四妙丸對高尿酸血癥大鼠腸道尿酸排泄影響的研究?

陳杰偉， 戴 號， 葉博聞， 張 璟， 陳覓蜜

(1.上海中醫(yī)藥大學， 上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院， 上海 200032)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是以體內嘌呤代謝紊亂、血清尿酸水平升高為臨床表現(xiàn)的常見代謝性疾病，是痛風、高血壓、腦卒中、冠心病等疾病的獨立致病因素[1，2]。隨著社會經濟發(fā)展，飲食結構改變，我國HUA患病率逐年升高，并呈高流行、年輕化趨勢，已成為第二大代謝性疾病[3]。

尿酸生成過多和/或排泄減少是HUA的主要發(fā)病機制[4]。腎臟排泄尿酸不足可致“腎臟排泄不良型”(renal underexcretion type, RUE)HUA；腸道尿酸排泄不足，導致“腎外排泄不足型”(extra-renal underexcretion type, EUE)HUA[5]。促進尿酸排泄是治療HUA的主要手段之一，代表藥物如苯溴馬隆以腎臟為靶器官，通過抑制腎小管重吸收，促進腎臟尿酸排泄，但對EUE型HUA無效，甚至會繼續(xù)加重腎臟負荷，引起慢性腎病等腎臟疾病[6]、肝毒性和骨髓抑制等不良反應[7]。因此，相較于單一的腎臟途徑，以腸道為靶器官促進尿酸排泄，正成為新的降尿酸治療手段。

中醫(yī)藥治療高尿酸血癥具有多靶點、療效持久、副作用小等優(yōu)勢[8]。四妙丸源自清代《成方便讀》，由蒼術、鹽黃柏、牛膝、薏苡仁組成，具有清熱祛濕、逐瘀通經之效，是臨床治療高尿酸血癥及痛風的常用方劑之一。方中鹽黃柏[9]、牛膝[10]、薏苡仁[11]可抑制腎臟對尿酸的重吸收，促進腎臟排泄尿酸；蒼術揮發(fā)油和去揮發(fā)油提取物能顯著降低HUA小鼠的SUA水平[12]。研究提示，四妙丸可能具有多靶點的作用，除腎臟外還可能促進腸道尿酸排泄[13]。本研究以四妙丸干預HUA大鼠，旨在觀察四妙丸對腸道總尿酸及十二指腸、空腸、回腸尿酸的影響，評價腸道排泄途徑的降尿酸作用，為四妙丸在高尿酸血癥中的臨床用藥提供實驗基礎，具有極大臨床意義。本研究通過上海中醫(yī)藥大學動物福利與倫理委員會批準(編號PZSHUTCM191122001)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級55只雄性SD大鼠，5～6周齡，體質量140～160 g，購于斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證SYXK(滬)2020-0009。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食及飲水，室溫維持26 ℃，濕度50%。

1.2 藥物

四妙丸組成：蒼術、鹽黃柏、薏苡仁、牛膝，飲片由上海同濟堂藥業(yè)有限公司提供(批號200201、191201、191101、191202)；苯溴馬隆片(宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司，批號H20040348)；氧嗪酸鉀(美國Sigma，批號H9733)；次黃嘌呤(美國Sigma，批號156124)；異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司，批號20082602)。

1.3 主要儀器

ADVIA2400全自動生化分析儀(德國西門子公司)；TDL-5000CR壹式大容量冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；PTHW5000 ML恒溫電熱套(鄭州科泰實驗設備有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀套(V-710 Vacuum Pump, R-200SE Rotavapor, F-114 Recirculating Chiller，瑞士BUCHI公司)；DZF-6210真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.4 四妙丸浸膏粉制備

根據2020版《中華人民共和國藥典》四妙丸組方，稱取蒼術(125 g)、鹽黃柏(250 g)、薏苡仁(250 g)、牛膝(125 g)碾碎，加10倍量水浸泡30 min煎煮1 h，過濾收集藥液，將殘渣再次加8倍量水煎煮1 h收集藥液。合并2次藥液減壓濃縮真空干燥，得浸膏261.62 g，浸膏提取率為34.88%。

1.5 動物分組、造模與給藥

55只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)后隨機分為正常組10只，模型組、苯溴馬隆組(4.7 mg/kg)、四妙丸高、中、低劑量組(2260.6 mg/kg、1130.3 mg/kg、565.2 mg/kg)每組各9只。除正常組外，造模大鼠以氧嗪酸鉀(100 mg/kg，腹腔注射)聯(lián)合次黃嘌呤(500 mg/kg，灌胃)每日1次，連續(xù)21 d，復制HUA模型大鼠。造模7 d后，SUA水平升高超過正常組20%以上則認為造模成功[14]。成模后模型組1只，四妙丸中劑量組2只，四妙丸低劑量組1只大鼠SUA水平未滿足標準予以剔除，成功模型大鼠共計41只，成模率91.1%。驗模成功后，正常組隨機剔除2只，模型大鼠隨機剔除1只并重新隨機分配至各組，每組設置8只。第8天開始給予相應劑量藥物灌胃干預，正常組和模型組給予等量溶媒，持續(xù)14 d。

1.6 樣本采集和檢測指標

1.6.1 血液樣本 于實驗過程中第7天(造模期)、第21天(干預期)給藥后2 h，以眼眶取血采集血樣，檢測血清尿酸(serum uric acid, SUA)。

1.6.2 尿液樣本 第21天用代謝籠收集24 h尿液，計算尿量后檢測尿尿酸濃度。計算尿酸清除率(clearance of uric acid, CUA)(mL/h)=尿酸濃度×尿量/(24×血尿酸濃度)。

1.6.3 腸液樣本 第21天以異氟烷呼吸麻醉安樂死大鼠后取材。十二指腸段從胃幽門向下取10 cm，回腸段從盲腸袋向上取5 cm，空腸段在空腸中部取20 cm。根據文獻方法優(yōu)化后采集腸液[15]，收集腸液時先用組織鉗夾住腸段兩端切斷腸道，以10 mL生理鹽水沖洗腸段，沖洗液即腸液樣本。腸液樣本38 ℃水浴1 h后檢測尿酸濃度。十二指腸尿酸(duodenum uric acid, DUA)、空腸尿酸(jejunum uric acid, JUA)、回腸尿酸(ileum uric acid, IUA)(單位: μg/cm)=腸液樣本尿酸濃度×樣本體積/腸段長度；腸道總尿酸(total intestinal uric acid, TUA)(單位: μg/cm)=(DUA×10+JUA×20+IUA×5)/35。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 四妙丸對大鼠血液SUA的影響

造模期：與正常組比較，各組造模大鼠SUA顯著升高(P<0.01)，造模成功。干預期：與模型組比較，苯溴馬隆組、四妙丸各劑量組SUA水平顯著下降(P<0.01)，提示苯溴馬隆與四妙丸均能降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平(表1)。

表1 各組大鼠血清尿酸(Serum uric acid, SUA)水平比較

2.2 四妙丸對HUA大鼠尿液CUA的影響

模型組大鼠尿液CUA水平顯著低于正常組(P<0.05)。與模型組比較，苯溴馬隆組、四妙丸低劑量組尿液中CUA顯著升高(P<0.01，P<0.05)，提示低劑量四妙丸可提高尿酸清除能力(表2)。

表2 大鼠尿液尿酸清除率(clearance of uric acid, CUA)比較

2.3 四妙丸對HUA大鼠腸道尿酸指標的影響

取大鼠腸液樣本與正常組比較，HUA模型組大鼠腸道TUA水平無顯著變化(P>0.05)，然而四妙丸低劑量干預動物腸道TUA水平顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，苯溴馬隆組JUA無顯著變化(P>0.05)，而四妙丸中劑量組、低劑量組JUA顯著升高(P<0.05，P<0.01)，四妙丸低劑量組IUA顯著升高(P<0.01)，提示四妙丸與苯溴馬隆降低血液尿酸的途徑并不相同，低劑量四妙丸能夠促進腸內尿酸順利排泄(表3)。

表3 各組大鼠腸道總尿酸(total intestinal uric acid, TUA)、十二指腸尿酸(duodenum uric acid, DUA)、空腸尿酸(jejunum uric acid, JUA)、回腸尿酸(Ileum uric acid, IUA)比較

3 討論

中醫(yī)認為高尿酸血癥屬于“膏濁病”“伏邪”等范疇，其發(fā)病與濕、熱、痰、濁、瘀諸邪有關。國醫(yī)大師朱良春更重視“濁瘀”，認為“濁瘀”是本病發(fā)生的重要病理因素[16]?！靶∧c受盛胃中水谷而分清濁”，小腸泌清別濁，將體內“濁瘀”之邪排出體外?！捌⑴c小腸相通”，脾胃運化常影響小腸。若脾失健運則濕熱內生，下注小腸，清濁不分，內生“濁瘀”不能排而致高尿酸血癥。四妙丸以鹽黃柏為君，取其寒以勝熱、苦以燥濕，且善除下焦?jié)駸?；蒼術、薏苡仁為臣，健脾燥利濕；牛膝為佐，引藥直達下焦，逐瘀通經。四妙丸以清熱祛濕為主，共治脾胃與下焦?jié)駸帷Ｐ∧c歸屬下焦，四妙丸亦可清利小腸濕熱。朱良春善用土茯苓加四妙丸配萆薢等藥組方，重在泄化濁瘀、蕩滌污垢，降低血尿酸[17]。其他學者亦以四妙丸加減化裁應用于高尿酸血癥，收獲良效[18]。

腎外腸道尿酸排泄減少是HUA的常見原因之一[5]。Yano[19]等發(fā)現(xiàn)，5/6腎臟切除術大鼠腎臟尿酸排泄減少，腸道尿酸增加，SUA水平并未升高。Sorensen[20]等發(fā)現(xiàn)，部分腎功能不全患者腸道是其尿酸排泄的主要途徑。本研究以“濁瘀”和小腸“泌清別濁”為理論基礎，探討四妙丸對腸道尿酸排泄的影響，通過實驗觀察到造模期各組造模大鼠SUA水平顯著高于正常組，且模型大鼠各組間SUA無顯著差異，表明HUA模型成功復制，HUA基線水平一致。干預結束后，四妙丸高、中、低劑量組SUA水平均顯著低于模型組，提示四妙丸可顯著降低HUA大鼠的血尿酸，與文獻報道一致[21]。其中，相較于苯溴馬隆組，低劑量組SUA水平呈更低趨勢，表明低劑量四妙丸的降尿酸作用優(yōu)于苯溴馬隆。模型組大鼠CUA水平顯著低于正常組，提示HUA大鼠腎臟的尿酸清除能力較低，可能與HUA導致的腎臟受損有關[6]。苯溴馬隆組、四妙丸低劑量組CUA顯著高于模型組，表明四妙丸低劑量可增強腎臟清除尿酸的能力，促進尿酸排泄。苯溴馬隆組、四妙丸低劑量組CUA無明顯組間差異，但顯著高于正常組，表明四妙丸低劑量與苯溴馬隆組類似，具有較強的促進腎臟排泄尿酸的作用，可能與上調腎臟尿酸轉運蛋白的表達有關[14,22]。通過各組大鼠腸道總尿酸比較發(fā)現(xiàn)，四妙丸各劑量呈一定量效關系，其中低劑量組TUA、JUA、IUA顯著高于模型組和苯溴馬隆組，提示低劑量四妙丸能促進大鼠腸道總尿酸的排泄；苯溴馬隆組腸道總尿酸與模型組比較無顯著差異，表明苯溴馬隆作用靶點單一，無法促進腸道排泄尿酸。上述結果表明，四妙丸降低尿酸作用除腎臟途徑外，還可通過促進腸道排泄尿酸，具有多靶點的優(yōu)勢。這可能也是低劑量四妙丸降尿酸作用優(yōu)于苯溴馬隆的原因。

進一步對腸道分段研究，各組大鼠十二指腸尿酸水平無顯著差異，表明十二指腸的尿酸排泄情況受藥物影響較小；通過比較空腸尿酸指標，四妙丸中、低劑量組顯著高于模型組，表明四妙丸中、低劑量可促進空腸排泄尿酸；比較回腸尿酸，四妙丸低劑量組IUA顯著高于模型組，表明低劑量四妙丸可有效促進回腸排泄尿酸。上述結果提示，四妙丸調控腸液尿酸排泄的主要部位在空腸、回腸，低劑量四妙丸促進不同腸段尿酸排泄的能力不同，回腸>空腸。Hosomi[23]等比較空腸、回腸、結腸對尿酸的清除能力，認為回腸>結腸>空腸與本研究結果類似。另一方面，以上實驗結果顯示，低劑量四妙丸促進腸道尿酸排泄作用優(yōu)于高劑量四妙丸，改善高尿酸血癥大鼠相關實驗指標，這可能是由于高劑量四妙丸給藥增加了動物代謝負擔，影響其發(fā)揮正常促代謝、促排泄的作用，其中具體機制尚需后續(xù)實驗探究與確認。

本研究以“濁瘀”病因病機和小腸泌清別濁功能為理論基礎，探討四妙丸對腸道尿酸排泄的影響，觀察到四妙丸能有效調控腸道尿酸排泄，并猜想與調控基因表達有關，為促進腸道尿酸排泄治療HUA提供了新的思路。