基于NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎癥通路探討越婢湯和真武湯對阿霉素腎病大鼠的影響?

劉慧丹， 宋純東△， 宋 丹， 陳 瑤， 丁 櫻， 賈評評， 花淑婷

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)， 鄭州 450046；3.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056002；4.焦作市第二人民醫(yī)院，河南 焦作 454000)

原發(fā)性腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高膽固醇血癥為基本特征的臨床綜合征[1]。阿霉素是一種常用的蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素及經(jīng)典的嚙齒類腎炎損傷誘發(fā)劑。阿霉素腎病模型是公認(rèn)的能較好模擬急慢性腎小球病變的模型之一[2]，臨床表現(xiàn)與人類NS相似。

感染是NS發(fā)生或加重的重要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子的大量激活與急慢性腎臟病密切相關(guān)[3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain like receptors，NLRs)家族中的血清核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎癥復(fù)合體成為近年研究的熱點(diǎn)，它是以NLRP3為基礎(chǔ)骨架，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-1銜接組成，可以剪切白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β前體成為有活性的IL-1β，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。NLRP3及其下游炎癥因子在慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)中發(fā)揮重要作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)可明顯緩解阿霉素腎病模型小鼠的腎小球硬化和腎小管損傷程度[5]。

《金匱要略》越婢湯、《傷寒論》真武湯分別具有宣肺、溫陽利水的作用，臨床治療NS水腫療效顯著[6，7]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，二者均能降低NS模型大鼠的蛋白尿，其機(jī)制可能與保護(hù)腎小球足細(xì)胞有關(guān)。足細(xì)胞是腎小球中終末分化的細(xì)胞，對腎臟過濾的完整性至關(guān)重要[6,8，9]。本研究旨在同時觀察并比較越婢湯及真武湯對阿霉素腎病模型大鼠的療效，以及對腎組織中相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1及下游炎性因子IL-1β表達(dá)的影響，進(jìn)一步明確其療效機(jī)制，為臨床辨證治療NS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查(編號YFYDW 2016-030)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器

真武湯組成：附子9 g，茯苓9 g，白芍9 g，白術(shù)6 g，生姜9 g；越婢湯組成：麻黃12 g，石膏25 g，大棗30 g，生姜9 g，甘草6 g，上述藥物均加工為顆粒劑(四川新綠色藥業(yè)科技有限公司)。注射用鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號90L0138)；SA1020免疫組化試劑盒、Rabbit Anti-NLRP3、Caspase-1、IL-1βAntibody(蘇州卡爾文生物科技有限公司，貨號e20190117、e20190112、e20190109、e20190111)；DAB顯色劑(北京中杉金橋生物有限公司，貨號2040A0911)等。肝腎功生化檢測儀(型號AU5821，貝克曼)；24 h尿蛋白定量(24-hour urine protein quantification，24hUTP)檢測儀(型號BS2000，邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司)；光學(xué)顯微鏡(型號BX53，日本奧林巴斯)。

1.2 動物分組及干預(yù)方法

清潔級雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常組、模型組、越婢湯組及真武湯組各12只，體質(zhì)量(200±20)g，購于河南省動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(豫)2015-0004。均飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室，室溫(23±2)℃，濕度(45±2)%，自由飲水，普通飼料。模型制備按參考文獻(xiàn)加以改良[10]。所有動物均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常組外其余3組均經(jīng)尾靜脈注射阿霉素4 mg·kg-1·d-1，1周后再次給予阿霉素2 mg·kg-1·d-1，正常組注射等量0.9%氯化鈉溶液。于第2次注射阿霉素2周后留取24 h尿液，如果24hUTP升高且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模成功[11]。造模成功后開始中藥灌胃，越婢湯顆粒按9.87 g·kg-1·d-1、真武湯顆粒按4.41 g·kg-1·d-1的劑量，共灌胃6周,正常組與模型組灌服相同劑量0.9%氯化鈉溶液。整個實(shí)驗(yàn)僅模型組大鼠死亡2只。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠基本情況 觀察動物精神狀態(tài)、活動度、體質(zhì)量、毛發(fā)、攝食及水腫情況等。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測 分別在第2次注射阿霉素后的第1、2、8周末禁食不禁水，代謝籠收集大鼠24 h尿液送檢24hUTP；于藥物灌胃第6周末各組大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射進(jìn)行深度麻醉(0.3 mL·100 g-1體質(zhì)量)；剖開大鼠腹腔，腹主動脈取血，自動生化分析儀檢測血清白蛋白(Serum albumin，ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、膽固醇(Cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)表達(dá)水平。

1.3.3 腎臟病理檢測 處死大鼠后摘取左側(cè)腎臟，剝離腎臟被膜，經(jīng)腎門縱向剪切留取半個腎臟，10%甲醛處理、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，腎組織標(biāo)本切片(厚度為3～5 μm)行HE染色，每組大鼠選擇6個標(biāo)本(×400)，光鏡下觀察腎臟組織病理變化情況。

1.4 免疫組化法檢測腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β

腎組織行石蠟切片并梯度脫蠟，修復(fù)抗原采用PBS沖洗，置于枸櫞酸鈉液并放進(jìn)微波爐，用正常小牛血清封閉后，先后滴加兔抗鼠多克隆抗體NLRP3(1∶1000)、兔抗鼠單克隆抗體 Caspase-1(1∶1000)及IL-1β(1∶100)，在濕盒中4 ℃過夜，第2天行PBS沖洗，之后入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。應(yīng)用Motic病理圖像分析系統(tǒng)半定量分析，每組大鼠選取8個樣本，各個樣本再隨機(jī)選取10個視野，將得到的信息輸入計(jì)算機(jī)并獲取陽性積分吸光度(Integral absorbance，IA)，IA值越大表示蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

造模3組大鼠于第2次注射阿霉素3～5 d后即表現(xiàn)出活動減少、精神不振、蜷臥、反應(yīng)遲鈍、納差便溏、毛發(fā)脫落、枯黃無澤、體質(zhì)量增加不明顯等癥狀，2周后出現(xiàn)四肢腫脹、腹水。正常組大鼠精神狀態(tài)、活動、皮毛及攝食等均無明顯改變。真武湯組與越婢湯組藥物干預(yù)后大鼠癥狀改善，水腫逐步減輕并消失。

2.2 各組大鼠24hUTP比較

造模后第1周末，模型組24hUTP與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后第2周末、藥物灌胃第6周末(造模后第8周末)，模型組24hUTP均明顯高于正常組(P<0.05)；藥物灌胃第6周末，真武湯組、越婢湯組24hUTP均明顯低于模型組(P<0.05)，但2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠不同時點(diǎn)24 h蛋白尿比較

2.3 各組大鼠血生化指標(biāo)比較

藥物灌胃第6周末，模型組與正常組比較ALB明顯降低，ALT、Scr、BUN、CHOL和TG均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，真武湯組、越婢湯組ALB明顯升高，Scr、CHOL和TG均明顯降低(P<0.05)。真武湯組與越婢湯組比較，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠肝腎功及血脂比較

2.4 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化

HE染色顯示，光鏡放大400倍觀察，正常組大鼠腎組織未見明顯病理變化，模型組有少量腎小球系膜輕度增生，包氏囊增厚，少量蛋白管型，球囊黏連，部分腎小球肥大和腎小管擴(kuò)張或萎縮，間質(zhì)可見局灶炎性細(xì)胞浸潤；真武湯組、越婢湯組較模型組病理改變明顯減輕，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化(HE×400)

2.5 各組大鼠腎臟組織NLRP3、IL-1β、Caspase-1免疫組化檢測結(jié)果

NLRP3、IL-1β、Caspase-1主要表達(dá)于腎小管及間質(zhì)細(xì)胞。與正常組比較，模型組NLRP3 、IL-1β、Caspase-1表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，真武湯組及越婢湯組NLRP3 、IL-1β、Caspase-1表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3圖2)。

表3 各組大鼠腎臟NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)結(jié)果

注：Nod-like Receptor Pyrin Domain Containing 3(NLRP3) 、半胱天冬酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-1、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β圖2 各組大鼠腎組織NLRP3、IL-1β、Caspase-1免疫組化染色結(jié)果(×200)

3 討論

NS以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥及水腫為主要表現(xiàn)，常反復(fù)發(fā)作。感染、血栓、急性腎損傷、蛋白及脂代謝紊亂為其常見的并發(fā)癥，部分患者可出現(xiàn)腎功能損害并進(jìn)行性加重，極易發(fā)展為終末期腎衰竭，預(yù)后較差，給患者、家屬及社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。對NS的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑，雖然大多數(shù)患者能夠緩解或臨床痊愈，但因眾所周知的毒副作用以及停藥后的反復(fù)或復(fù)發(fā)，令病程遷延，甚至因嚴(yán)重感染、重要部位的血栓而致命，都是極為棘手的臨床問題。因此，探討中醫(yī)藥有效的治療方劑及其療效機(jī)制，對NS防治及西藥減毒增效具有重要意義。

依據(jù)NS的臨床表現(xiàn)，其屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“尿濁”等范疇，其主要病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，本虛常以脾腎陽(氣)虛、氣陰兩虛證為主，標(biāo)實(shí)以風(fēng)邪外襲、水濕、濕熱及瘀血常見。《傷寒論》真武湯為脾腎陽虛所致水腫而設(shè)，研究發(fā)現(xiàn)該方可以調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)功能，改善醛固酮代謝、ALB、24hUTP及水腫等，并可糾正慢性腎衰早期多尿、尿比重下降、水代謝紊亂，進(jìn)而保護(hù)腎功能[13]，能夠調(diào)整腎陽虛實(shí)驗(yàn)大鼠的腎功能，改善腎小球?yàn)V過膜的通透性，促使代謝產(chǎn)物Scr、BUN排出，減少血漿白蛋白的大量丟失[14]，減輕腎陽虛型慢性腎衰模型大鼠腎組織病理損傷[15]?！督饏T要略》云：“風(fēng)水惡風(fēng)，一身悉腫，脈浮不渴，續(xù)自汗出，無大熱，越婢湯主之。”現(xiàn)代藥理研究表明，越婢湯對阿霉素腎病大鼠有降低蛋白尿、改善腎小球超微結(jié)構(gòu)、修復(fù)腎小球電荷屏障的作用[16]，可以通過調(diào)控瞬時受體電位離子通道(transient receptor potential channels，TRPC)，下調(diào)腎小球足細(xì)胞主要表達(dá)的TRPC5及TRPC6，改善足細(xì)胞損傷[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，真武湯和越婢湯均可通過上調(diào)阿霉素腎病大鼠腎組織水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)/水通道蛋白2(aquaporin-2,AQP2)的表達(dá)，減輕腎臟病理損害而降低蛋白尿并保護(hù)腎功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素腎病大鼠模型建立后，模型組與正常組比較24hUTP明顯增高，ALB明顯下降，血脂水平明顯升高；而采用越婢湯及真武湯干預(yù)后，2組與模型組比較ALB升高，24hUTP、Scr、CHO和TG均降低，ALT和BUN無明顯差異，而腎臟病理部分腎小球肥大、毛細(xì)血管袢變窄、腎小管擴(kuò)張、管腔可見蛋白管型、細(xì)胞外基質(zhì)增生等均明顯改善。上述結(jié)果提示，二者均有明顯的降低阿霉素腎病模型大鼠蛋白尿、保護(hù)腎功能及減輕病理損傷的作用，與國內(nèi)相關(guān)研究基本一致。但2治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥通路在急慢性腎臟疾病的進(jìn)展中起核心作用[18]。NLRP3是由位于染色體1q44上NLRP3基因編碼的蛋白，包含1016個氨基酸[19]，其吡啉結(jié)構(gòu)域 (pyrin domain，PYD)可與ASC的同型蛋白相互作用，通過銜接蛋白ASC來募集Caspase-1。NLRP3蛋白、ASC及Caspase-1共同組成一個蛋白復(fù)合物，即NLRP3炎癥復(fù)合體[20]。NLRP3炎癥復(fù)合體是目前研究最為清楚的影響NS發(fā)生發(fā)展的炎性小體[21]。正常情況下，NLRP3有自我調(diào)節(jié)作用，但當(dāng)存在NLRP3激動劑時，它可寡聚化并募集ASC，繼而活化Caspase-1。根據(jù)引起相應(yīng)細(xì)胞事件的不同，可將Caspase分為促炎癥型和促細(xì)胞凋亡型，Caspase-1屬于促炎癥型，以IL-1β和IL-18前體作為底物，通過蛋白裂解方式，使該因子以成熟的形式釋放至胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。研究證實(shí)，許多疾病如多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、2型糖尿病等均涉及NLRP3炎癥復(fù)合體(Caspase-1-IL-1β/IL-18)的激活[22]；健康人腎臟的遠(yuǎn)曲小管和集合管穩(wěn)定表達(dá)IL-18、Caspase-1以及嘌呤受體P2X7[23]，在各種感染或非感染性疾病中，腎組織Caspase-1、IL-1β表達(dá)水平上調(diào)，目前已在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)人和鼠腎臟的足細(xì)胞[24-26]、腎小管上皮細(xì)胞[27，28]等均可以表達(dá)NLRP3炎性小體，并活化Caspase-1后分泌IL-1β和IL-18 等炎癥因子而發(fā)揮作用，表明NLRP3炎癥復(fù)合體激活可能在腎臟疾病的病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

本研究顯示，模型組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，腎組織內(nèi)NLRP3、Caspase-1 、IL-1β等表達(dá)都高于正常組，說明NLRP3炎癥復(fù)合體高表達(dá)于阿霉素腎病鼠模型腎組織中，并可能參與該病的發(fā)生和發(fā)展，與上述研究結(jié)果一致；中藥治療后2組NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白在腎組織表達(dá)水平均明顯下降。同時發(fā)現(xiàn)，各種生化指標(biāo)及腎臟病理改善與NLRP3、Caspase-1、IL-1在腎組織表達(dá)水平下降呈正相關(guān)。這一結(jié)果提示，越婢湯、真武湯均可能通過下調(diào)腎組織NLRP3/Caspase-1/IL-1β的表達(dá)，抑制炎癥而發(fā)揮消腫、減少尿蛋白、改善腎臟功能及減輕腎臟病理損害的作用，但二者之間比較無明顯差異。

越婢湯主要用于水腫初期風(fēng)水相搏、肺氣不宣所致者，而真武湯多用于水腫遷延不愈，病程較長，辨證屬于脾腎陽虛且以腎陽虛為主者。雖然臨床都屬于NS，但有可能病理上有微小病變和局灶節(jié)段硬化之區(qū)別，二者均屬于足細(xì)胞病范疇。本研究未發(fā)現(xiàn)2組中藥生化、病理及NLRP3/Caspase-1/IL-1β在腎組織表達(dá)的明顯差異，可能與檢測的頻次少、間隔時間過長有關(guān)，未能夠及時反映和發(fā)現(xiàn)整個實(shí)驗(yàn)過程中不同階段和時期中藥不同治法的優(yōu)勢。如果增加大樣本量，實(shí)驗(yàn)過程中每周都進(jìn)行生化、病理及上述炎癥因子檢測，可能會發(fā)現(xiàn)2組不同利水經(jīng)方在疾病不同時期的各自優(yōu)勢，上述均尚有待進(jìn)一步的研究與探索。

綜上所述，炎癥在NS的發(fā)生發(fā)展中越來越受到關(guān)注，越婢湯、真武湯是利水的經(jīng)典方劑。本研究結(jié)果提示，2種利水法均可通過影響阿霉素腎病大鼠腎組織NLRP3炎性復(fù)合體的表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)而達(dá)到治療NS的作用。