不同物種端粒結(jié)合蛋白和端粒酶的研究進展

石桂英黃藝瀅雷雪裴李欣悅白 琳

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

端粒是位于真核生物染色體末端的蛋白質(zhì)-DNA 復合體,在復制過程中保護染色體末端的完整性,防止染色體融合、重組、降解等[1-3]。 端粒DNA由TTAGGG 重復序列組成,不同物種的端粒長度不同,人出生時端粒長度約為8～20 kb,獼猴的端粒長度約為15～18 kb,而實驗動物大小鼠的端粒長度約為25～500 kb(表1)[4]。 端粒DNA 的3’末端有一段＞12 核苷酸的單鏈序列,此單鏈序列插入端粒雙鏈序列形成T 環(huán)結(jié)構(gòu)[5]。 端粒長度會隨細胞復制而縮短,端粒長度的維持通過兩個復合體來完成即shelterin 和CST。 哺乳動物shelterin 復合體由6 個蛋白組成,即端粒重復結(jié)合因子1 和2(telomeric repeat binding factor 1 and 2,TRF1、TRF2)、端粒保護蛋白1(protection of telomeres 1,POT1)、TRF1 和TRF2 相互作用核蛋白2(the TRF2- and TRF1-interacting nuclear protein 2,TIN2)、抑制/激活蛋白1(repressor/activator protein 1,RAP1)、POT1-TIN2 組織蛋白(the POT1-TIN2 organizing protein,TPP1,又稱為ACD、TINT1、PTOP、PIP1)。 CST 包括3 個蛋白即CTC1(conserved telomere maintenance component 1)、STN1(suppressor of CDC thirteen homolog) 和TEN1(telomere length regulation protein TEN1 homolog)。 shelterin 保護端粒避免DNA 損傷應答,通過端粒酶調(diào)節(jié)端粒長度;而CST 控制端粒酶對端粒的延伸和C 鏈插入序列的合成[6](表1、圖1)。

圖1 人和小鼠shelterin 復合體和CST 復合體示意圖Figure 1 Schematic of human and mouse shelterin complex and CST complex

表1 不同物種端粒生物學特點Table 1 Telomere biology of different species

1 shelterin

端粒DNA 重復序列與shelterin 結(jié)合,可以區(qū)分染色體正常末端和損傷斷裂部位,抑制DNA 修復反應,調(diào)控端粒酶維持端粒長度。 裂殖酵母中shelterin由6 種蛋白組成,即TAZ1、RAP1、POZ1、TPZ1、CCQ1和POT1。 TAZ1 結(jié)合端粒雙鏈DNA,Pot1 結(jié)合端粒單鏈DNA[7]。 哺乳 動物shelterin 由TRF1、TRF2、POT1、TIN2、RAP1 和TPP1 組成。 其中哺乳動物端粒蛋白TRF1 和TRF2,與酵母TAZ1 同源[8],結(jié)合雙鏈端粒DNA,RAP1 單獨與TRF2 相互作用,提高TRF2對端粒重復序列的特異性[9]。 POT1 結(jié)合單鏈端粒DNA,POT1-TPP1 復合體對單鏈端粒DNA 有高度特異性[10]。 TIN2 是復合體的關(guān)鍵蛋白,位于shelterin的中心位置,同時與TRF1、TRF2 和TPP1 相互作用,保證復合體的穩(wěn)定[10-11](表2)。

表2 不同物種shelterin 復合體的組成Table 2 Shelterin complex of different species

1.1 TRF1 和TRF2

二者有TRF 同源結(jié)構(gòu)域(TRF homologydomain,TRFH)和C 末端SANT/Myb DNA 結(jié)合域。 TRF1 可以使端粒DNA 成環(huán)狀配對伸展,TRF2 可以使端粒DNA 形成T 環(huán)結(jié)構(gòu)。 TRF 同源結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合其它蛋白。 TRF1 和TRF2 蛋白表達豐富,可以覆蓋每個端粒。 二者都可以被磷酸化、磺酰化、對羥基化、泛素化等[13-14]。

已有研究發(fā)現(xiàn),二者可通過多種方式維持端粒穩(wěn)定。 在人和小鼠中隨年齡增長,TRF1 水平降低。提高TRF1 的表達,可延緩衰老相關(guān)生理變化的發(fā)生。 在小鼠不同組織中TRF1 缺失可影響干細胞功能,從而導致組織穩(wěn)態(tài)失衡[15]。 當小鼠端粒缺失TRF1 時,DNA 損傷修復和染色質(zhì)重塑相關(guān)的蛋白會發(fā)生重組。 小鼠TRF1 可抑制早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia ,PML)、breast cancer 1(BRCA1)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持(structural maintenance of chromosomes,SMC)5/6 復合體的累積,這些蛋白可促進同源重組和端粒模板RNA 的翻譯[16]。

在細胞周期中,周期依賴性激酶2(cyclindependent kinases 2,CDK2)調(diào)控TRF2 的磷酸化,控制T 環(huán)的形成,從而保護端粒,并避免不必要的DNA 損傷應答[17]。 TRF2 的TRFH 可以抑制ATM(ataxia-telangiectasia mutated)的活性,同時也參與調(diào)節(jié)T 環(huán)的形成[18]。 TRF2 通過主動招募起始點識別復合物2(origin recognition complex,ORC2)到端粒,介導端粒的復制啟動,以防止端粒功能障礙,而蔗糖非發(fā)酵蛋白2 同源物(sucrose non-fermenting protein 2 homologous,SNF2H)敲除會減少ORC2 的募集和端粒的復制啟動[19]。 TRF2 還招募核仁蛋白TCOF1 協(xié)調(diào)端粒的轉(zhuǎn)錄復制[20]。

但是,在小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESCs,簡稱ES)和上皮干細胞的研究中發(fā)現(xiàn),TRF2在端粒保護中可有可無。 ES 細胞中T 環(huán)的形成不依賴于TRF2[21]。 TRF2 敲除ES 并未出現(xiàn)端粒融合現(xiàn)象,仍可以無限擴增[22]。

1.2 RAP1

RAP1 是酵母和哺乳動物中唯一保守的shelterin 蛋白。 在甲基營養(yǎng)型耐熱多形漢遜酵母DL-1 中, RAP1 有 2 個 基 因 即 HpRAP1 A 和HpRAP1 B。 HpRAP1 B 可識別保護端粒DNA,HpRAP1 A 與亞端粒區(qū)域相關(guān)。 在核糖體蛋白基因的啟動子中,有HpRAP1 A 和HpRAP1 B 的特有結(jié)合位點[23]。 裂殖酵母中酪蛋白激酶2 可以使RAP1多個位點磷酸化,從而促進RAP1 與BQT4 和POZ1的相互作用,進而維持端粒與核被膜的距離,促使染色質(zhì)沉默結(jié)構(gòu)的形成[7]。 釀酒酵母RAP1 在代謝、炎癥、氧化應激等反應中都有重要作用[24]。

哺乳動物中RAP1 是TRF2 結(jié)合伴侶,與TRF2形成復合體,其在端粒中的位置和穩(wěn)定性依賴于TRF2,敲除TRF2 時,RAP1 也會消失。 在端粒酶缺失的情況下,RAP1 對端粒的維持和保護具有重要作用。 與端粒酶缺失小鼠相比,同時缺失RAP1 和端粒酶的小鼠,其生存能力隨傳代進行性降低[25]。在仍有增殖能力的人老化細胞中,下調(diào)RAP1 會導致端粒丟失融合;在端粒酶陽性細胞系中,當端粒酶被抑制時,敲除RAP1 會增加端粒的融合[26]。 在人老化細胞中,RAP1 與組蛋白異四聚體結(jié)合,參與核小體位移,從而調(diào)節(jié)基因表達,但不影響細胞衰老進程[27]。

在人間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)干細胞中,RAP1 負調(diào)節(jié)端粒長度,同時作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)基因啟動子的甲基化狀態(tài)。 RAP1 缺失可以促進人間充質(zhì)干細胞的自我更新,延緩其衰老;在人神經(jīng)干細胞中未見類似作用[28]。 成纖維細胞自然老化過程中TRF2 和RAP1 水平降低,相較于TRF2,RAP1 更穩(wěn)定。 在老化細胞中,細胞核和細胞質(zhì)中的RAP1含量相似,過氧化氫處理的細胞,其細胞核中的RAP1 減少,而細胞質(zhì)中的沒有改變[29]。

1.3 TIN2

TIN2 位于shelterin 的中心位置,可以結(jié)合TRF1、TRF2 和TPP1,還介導端粒酶與端粒的結(jié)合[30],TIN2 與TPP1/POT1 協(xié)作可以刺激端粒酶活性[11]。 TIN2 有3 種異構(gòu)體,即TIN2L、TIN2M、TIN2S,三者都位于端粒中,TIN2 異構(gòu)體在生化特性和功能上完全不同,TIN2 編碼基因突變的病人其shelterin 功能發(fā)生改變[31]。 在先天性角化不良癥中TIN2 發(fā)生突變,在端粒酶陰性成體細胞中會出現(xiàn)端粒功能失調(diào)表型,在端粒酶陽性干細胞中則加重端粒的維持問題[32]。 人抗原R(human antigen R,HuR)結(jié)合TIN2 mRNA 3’非翻譯區(qū)。 HuR 耗竭時,可以促進TIN2 表達,導致線粒體TIN2 增加,使ROS增加, 從而誘導生長停滯, 但不影響細胞核TIN2[33]。 Siah2(seven-in-absentia honolog 2)蛋白具有E3 泛素連接酶的活性,可調(diào)節(jié)一些蛋白的泛素化和降解,TIN2 是其中之一。 在體內(nèi),TIN2 與Siah2結(jié)合后被泛素化,Siah2 過表達可以導致TIN2 蛋白降解,從而使端粒中的TIN2 缺失;而敲除Siah2 后,TIN2 穩(wěn)定性增加[34]。

1.4 POT1

POT1 是存在于多種生物的一種單鏈DNA 結(jié)合蛋白,與富含鳥嘌呤的單鏈DNA 3’懸浮端結(jié)合[35]。人POT1 是一個管家基因,有22 個外顯子,在人的各種組織細胞中廣泛表達。 POT1 啟動子活性與POT1 表達和端粒長度正相關(guān),與人端粒酶表達呈負相關(guān)[36]。 POT1 與TPP1 結(jié)合形成復合體,此復合體對單鏈端粒DNA 有高度特異性[12]。 POT1-TPP1 復合體可以解開端粒二級結(jié)構(gòu),提高端粒酶活性[37]。 在 真 核 細 胞 多 種 活 動 中, microRNAs(miRNAs)可以調(diào)節(jié)基因表達,miR-185 可直接作用于POT1 3’非翻譯區(qū)。 在人腫瘤細胞和原代成體細胞中,miR-185 過表達都可導致端粒功能失調(diào)。 在原代細胞中,miR-185 過表達可加速衰老進程[38]。

嚙齒類動物有2 個POT1 蛋白,即POT1a 和POT1b,二者密切相關(guān),POT1a 抑制ATR(ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase)介導的DNA損傷修復機制,避免端粒末端被識別為DNA 斷端,POT1b 調(diào)控端粒3’懸浮端長度。 人POT1 同時具有這兩種功能。 在人細胞中,CST 復合體結(jié)合POT1和TPP1,在小鼠中只結(jié)合POT1b。 POT1 與單鏈DNA 結(jié)合,伸展G4 DNA 結(jié)構(gòu),抑制同源重組介導的修復反應,從而穩(wěn)定和保護端粒單鏈DNA;抑制ATR 介導的DNA 反應。 在黑色素瘤、慢性淋巴細胞白血病等多種腫瘤中,發(fā)現(xiàn)POT1 突變[39]。

1.5 TPP1

TPP1 的N 末端有7 個寡核苷酸/寡糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(oligonucleotide/oligosaccharide binding,OB),與端粒酶密切相關(guān);人TPP1 N 末端OB 結(jié)構(gòu)域突變可降低其對端粒酶的刺激作用,影響端粒酶與端粒的結(jié)合,導致端?？s短[40]。 TPP1 C 末端結(jié)構(gòu)域介導其與TIN2 的相互作用[41]。 敲降小鼠TPP1 會誘導p53 依賴性生長停滯和ATM 依賴性DNA 損傷應答。 在小鼠胚胎成纖維細胞中,TPP1 基因缺失增加姐妹染色體端粒融合,減少端粒酶與端粒的結(jié)合[42]。

在哺乳動物細胞中TPP1 與細胞周期調(diào)控因子激酶NEK6 相互作用,在G2/M 期NEK6 介導TPP1 Ser255 的磷酸化,從而調(diào)節(jié)端粒酶活性及其與TPP1的相互作用。 而POT1 負調(diào)控TPP1 Ser255 的磷酸化[43]。 在人肺癌細胞中,TPP1 OB 結(jié)構(gòu)域蛋白抑制端粒酶募集到端粒上,從而抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡[44]。 人多能干細胞端粒長度設(shè)定點的調(diào)控主要依賴于TPP1,TPP1L104A 突變可改變?nèi)烁杉毎肆ｉL度設(shè)定點[45]。

2 CST

CST 復合體由3 個亞單位組成,即CTC1、STN1和TEN1。 酵母CDC13 是哺乳動物CTC1 的同源物。 CST 復合體位于單鏈端粒DNA,限制端粒酶作用,以防懸浮端過度延伸。 TEN1 有助于穩(wěn)定CTC1-STN1 與端粒DNA 的相互作用。 CTC1 可以刺激DNA 聚合酶α(Polα),在端粒復制中起關(guān)鍵作用。STN1-TEN1 的作用類似復制蛋白A,在復制壓力下使細胞正常復制。

小鼠CTC1 基因缺失導致C 鏈端粒DNA 的迅速丟失,從而導致端粒的災難性丟失和過早死亡。CTC1 在CST 復合體中起關(guān)鍵作用,其突變對細胞環(huán)境具有致死性。 已知CTC1 的多個自發(fā)性突變與Coats plus disease ( CP) 和先天性角化不良(dyskeratosis congenita,DC)相關(guān)。 STN1 有2 個結(jié)構(gòu)域,N 末端OB 區(qū)和C 末端STN1 結(jié)構(gòu)域,TEN1 只有1 個OB 結(jié)構(gòu)域。 人TEN1 不與單鏈端粒DNA 相互作用。 而人STN1 與單鏈端粒DNA 親和力高,但缺乏特異性。 STN1-TEN1 復合物的形成對于正常發(fā)揮CST 復合物的功能至關(guān)重要。 STN1 突變與CP相關(guān)[6]。

盡管在纖毛蟲、酵母、植物和哺乳動物中都存在CST 復合體,序列同源性較低,物種間差異顯著。酵母和人的CST 復合體中,STN1 和TEN1 在結(jié)構(gòu)上高度保守,而CST 復合體的重要組分CDC13 和CTC1,沒有序列同源性,在長度和功能上差異顯著。酵母CDC13 與端粒酶全酶中的EST1 相互作用,從而募集端粒酶到端粒上。 人CTC1 則抑制端粒酶到端粒的募集。 近期研究發(fā)現(xiàn)嗜熱四膜蟲的p75-p45-p19 與CST 序列沒有同源性,但其功能類似纖毛蟲CST 復合物,協(xié)調(diào)G 鏈和C 鏈的合成[46]。

3 端粒酶

端粒酶是一種核蛋白,人端粒酶核蛋白由端粒酶RNA(telomerase RNA component,TERC)、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT),以及附屬蛋白 dyskerin、 端粒酶卡哈爾體蛋白

(telomerase Cajal Body protein 1 homolog,TCAB1)、

核糖核蛋白NOP10、NHP2、GAR1 組成[47]。 不同物種間,TERC 的大小和序列差異顯著,hTERC 有451個核苷酸(nucleotides,nt),纖毛蟲～150 nt,釀酒酵母～1150 nt,粉色面包霉菌＞2000 nt。 TERC 的大小和序列并非高度保守,所有TERC 有4 個功能特性:反轉(zhuǎn)錄模板、假結(jié)結(jié)構(gòu)域、與TERT 相互作用的干環(huán)(stem-loop)、RNA 穩(wěn)定所需的3’元素。 hTERC 由RNA 聚合酶II 從其自身啟動子轉(zhuǎn)錄而來。 多數(shù)生物中,TERT 蛋白含有4 個功能結(jié)構(gòu)域:端粒酶N 末端結(jié)構(gòu)域(telomerase essential N-terminal domain,TEN)、TERC 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(telomerase RNA binding domain,TRBD),反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域、C 端擴展區(qū)(Cterminal extension,CTE)。 hTERT 中TEN 在端粒酶募集至端粒的過程中起關(guān)鍵作用,參與催化端粒重復序列的合成[9,13,48]。

各組織中端粒酶活性,恒河猴、日本獼猴、食蟹猴與人相似:在多數(shù)成體組織中端粒酶活性受到抑制,在脾、胸腺、消化道中有弱活性,睪丸中活性較高。 在牛、羊、馬、鹿的成纖維細胞和各種綿羊或馬的成體組織中均未檢測到端粒酶活性。 豬的多個成體組織,如淋巴結(jié)、肺、腎和小腸等具有顯著水平的端粒酶活性[49]。 提高端粒酶活性可以促進大鼠和人顆粒細胞、小鼠卵巢中類固醇激素基因的表達和激素生成[50]。

端粒酶附屬蛋白同樣具有重要作用。 dyskerin的編碼基因是DKC1,位于X 染色體。 dyskerin 可以穩(wěn)定hTR,增強hTERT 活性。 dyskerin 過多或過少都會導致癌癥,乳腺癌和前列腺癌中dyskerin 水平較高,dyskerin 水平降低與腦垂體癌變有關(guān),DC 中dyskerin 水平較低。 DKC1 基因突變小鼠可發(fā)生多種惡性腫瘤[51]。 NHP2 敲除可以抑制TERT 表達,破壞端粒酶復合體的穩(wěn)定,從而抑制細胞增殖,促進細胞凋亡[52];NHP2 的致病性突變減少小核仁RNA(small nucleolar RNAs,snoRNAs)的累積,影響核糖體RNA(ribosome RNA,rRNA)的加工處理,NHP2 缺失可減少rRNA 生成,導致肺纖維化和H?yeraal-Hreidarsson 綜合征[53]。 NOP10 可預測肺癌的預后,其相關(guān)snoRNAs 可以促進肺癌細胞的生長、增殖、遷移和侵襲[54]。 在乳腺癌中NOP10 高表達也預示預后不良[55]。 DKC1 和NOP10 突變導致腎病綜合征,包括白內(nèi)障、聽力障礙、小腸結(jié)腸炎等[56]。 在癌細胞中,抑制TCAB1 表達,可減少p21蛋白降解,從而誘導細胞衰老[57]。

4 總結(jié)與展望

端粒結(jié)合蛋白、端粒酶,以及端粒酶附屬蛋白,在維持端粒長度和穩(wěn)定中起重要作用,這些蛋白基因突變或表達量改變,可導致多種疾病,如以短端粒為特點的端粒病,包括先天性角化不良、肺纖維化、再生障礙性貧血等[58];在多種腫瘤中也發(fā)現(xiàn)端粒結(jié)合蛋白的突變,如在乳腺、胃、甲狀旁腺等腫瘤中都有POT1 突變[12]。 與端粒功能障礙相關(guān)的疾病,在治療時,可以將端粒結(jié)合蛋白、端粒酶、端粒酶附屬蛋白等作為治療靶點。

已有研究表明,哺乳動物端粒的長度與壽命呈負相關(guān),端粒酶活性與體重呈負相關(guān)。 小鼠的壽命較短,體重較小,其端粒較長,各組織有不同程度端粒酶活性;而人的壽命較長,體重較大,端粒較短,多數(shù)組織無端粒酶活性,因此人有復制性衰老現(xiàn)象[59]。 端粒酶敲除的嚙齒類動物模型是研究端粒和端粒酶基本生物特性的良好模型,但很難用于深入研究人類衰老和疾病中端粒和端粒酶的作用。要深入研究端粒和端粒酶在人類疾病中的作用,還需尋找合適的模型。