ELISA 法測定麩質(zhì)過敏原及其不確定度的評估

◎ 楊 琳，王 震

（諾安實力可商品檢驗（上海）有限公司，上海 201112）

食物過敏是由人體免疫系統(tǒng)對食物中特定蛋白質(zhì)的反應(yīng)引起的敏感性。目前有＞6%的幼兒和3%～4%的成年人存在食物過敏現(xiàn)象。在過敏的個體中，特定的食物蛋白質(zhì)會被免疫系統(tǒng)誤認(rèn)為是有害的，當(dāng)過敏個體第一次接觸到這種蛋白質(zhì)時，身體的免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生稱為免疫球蛋白E（IgE）的抗體，當(dāng)過敏個體再次暴露于相同的食物蛋白質(zhì)時，IgE抗體和化學(xué)物質(zhì)（如組胺）就會釋放出來。組胺是一種強大的化學(xué)物質(zhì)，可引起呼吸系統(tǒng)、胃腸道、皮膚或心血管系統(tǒng)的反應(yīng)。在極端情況下，食物過敏甚至可能致命。盡管任何食物都能激發(fā)過敏個體的免疫反應(yīng)，但只有少數(shù)食物是導(dǎo)致食物過敏的原因。

近幾年的普查結(jié)果顯示我國的乳糜瀉發(fā)生率為1‰～3‰，而歐洲人和澳洲人乳糜瀉的發(fā)生率則更高，為3‰～4‰。導(dǎo)致乳糜瀉的主要原因是長期食用含麩質(zhì)的谷物，包括小麥、黑麥、大麥、燕麥、斯佩爾特小麥、卡姆小麥或其雜交品系及其制品。因此食品制造商通過在產(chǎn)品上清楚地貼上成分清單來保護那些對食品過敏的人。這個在歐洲食品標(biāo)示中為強制規(guī)定，澳洲相關(guān)法規(guī)更是規(guī)定麩質(zhì)含量大于＞20 mg·kg-1的食品，必須強制在食品上申明[1-2]。所以過敏原的檢測可確保食品制造商在制造之前及期間，具有潛在危險的過敏成分不會進入食品中。

現(xiàn)階段過敏原的檢測有酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、側(cè)向流動（Lateral Flow Testing，LFT）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）幾種方法。其中LC-MS/MS設(shè)備相對昂貴；與ELISA相比，PCR的主要缺點是不針對過敏蛋白，針對DNA，而DNA的檢測并不意味著過敏蛋白的存在，且PCR只能定性測試，無法進行定量測試；側(cè)向流動僅為定性測試。因此首選以及最常用的方法是用ELISA檢測。

本文使用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）的方法測試麩質(zhì)過敏原。實驗選用大豆分離蛋白、薯條、淋洗水為樣品，測定樣品空白，同時使用標(biāo)準(zhǔn)品在線性最低點、中間點濃度對以上3個樣品進行3平行加標(biāo)并重復(fù)2天測試，以驗證測試的定量限、重復(fù)性和重現(xiàn)性，以確認(rèn)該方法的可行性。同時用線性最低點濃度加標(biāo)的樣品含量對于整體的測試進行不確定度評估。

1 材料與方法

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

麩質(zhì)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購自Sigma-Aldrich，CAS號為8002-80-0，純度85%；麩質(zhì)過敏原試劑盒，購自Biofront，型號為MonoTrace Glu-EK-96；純凈水，購自哇哈哈純凈水；無水乙醇，色譜純，購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

本實驗用到的主要實驗設(shè)備見表1。

1.3 測試流程

稱取0.25 g經(jīng)過充分研磨的食品樣品或0.25 mL液體樣品到聚丙烯離心管中。向試樣中加入10 mL預(yù)熱的萃取緩沖液（60%乙醇、焦亞硫酸鈉和谷胱甘肽），并短暫渦旋使其懸浮混勻。將裝有試樣的試管在60 ℃下培養(yǎng)試管1 h，每隔15 min劇烈振搖一次，以提取樣品中的蛋白質(zhì)。將試樣在室溫下以2 000g離心10 min，并用樣品稀釋劑將樣品提取液稀釋10倍。取200 μL稀釋過的樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)品添加到相應(yīng)的孔中，使樣品中的麩質(zhì)抗原與包被在試劑盒微孔板中的多克隆抗體結(jié)合，并在孔中形成抗原-抗體復(fù)合物。在22 ℃孵育10 min。小心倒出測試條孔中的液體，在吸水紙上拍打至干。用洗滌緩沖液清洗3次，并每次拍打吸干，以清洗去除未結(jié)合的麩質(zhì)抗原。向每個孔中添加100 μL抗麩質(zhì)辣根過氧化物酶（HRP）。將其置于避光環(huán)境中，22 ℃孵育10 min，此時酶與已形成的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體夾心。小心將測試條孔中液體倒出，清洗并拍打吸干，去除多余的結(jié)合抗體。每孔添加100 μL高靈敏度3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物后，22 ℃避光孵育10 min，向每個孔中添加100 μL反應(yīng)終止液，輕輕振搖進行混合，以防止產(chǎn)生氣泡干擾吸光度讀數(shù)。由于復(fù)合物上結(jié)合了酶，導(dǎo)致酶底物的加入后有顏色的產(chǎn)生，且顏色的強度與食物中麩質(zhì)的濃度成正比，所以使用裝有吸光度在450 nm的酶標(biāo)儀讀取微孔的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。

1.4 實驗測量方法與數(shù)學(xué)模型

實驗測量方法為稱樣→提取→孵育→離心→稀釋→孵育→洗板→加麩質(zhì)抗體共軛物→孵育→洗板→加底物→孵育→加終止液→讀數(shù)。被測量的數(shù)學(xué)模型：

式中：X為試樣中麩質(zhì)過敏原的含量，mg·kg-1；C為測定用試樣液中麩質(zhì)過敏原的濃度，μg·mL-1；M為試樣質(zhì)量，g；V為試樣的最后定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍與數(shù)據(jù)結(jié)果

取大豆分離蛋白、薯條、淋洗水空白基質(zhì)樣品，取3份不加入標(biāo)準(zhǔn)品直接測試，通過3 d對空白基質(zhì)的測定，得到的結(jié)果均為0 mg·kg-1，基質(zhì)樣品中的數(shù)值均＜檢出限的1/3，表明基質(zhì)對加標(biāo)沒有干擾，這3種基質(zhì)與試劑盒之間沒有交叉反應(yīng)。另取樣品分別于每份樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍低、中濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各3份后，重復(fù)2 d，按照1.3的試驗步驟測試，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線見圖1，基質(zhì)加標(biāo)數(shù)據(jù)見表2。

以標(biāo)樣的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，從儀器讀取450 nm的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作三次曲線，標(biāo)準(zhǔn)工作三次曲線的線性相關(guān)系數(shù)在2～100 μg·mL-1為R2=1，見圖1，滿足＞0.995的要求，說明線性在該定量范圍內(nèi)符合標(biāo)準(zhǔn)要求[4]。各個基質(zhì)最低加標(biāo)水平2 mg·kg-1均能夠同時滿足精密度和準(zhǔn)確度的要求，所以加標(biāo)最低點2 mg·kg-1即為此次驗證的定量限，同時該定量限也完全能滿足20 mg·kg-1的歐盟相關(guān)法規(guī)要求。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖

通過2個濃度點的基質(zhì)加標(biāo)并測試2 d，計算得出2 d測試的結(jié)果，并計算其回收率，同時對方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性與重現(xiàn)性進行驗證，結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)不同濃度水平的回收率均能滿足70%～120%的要求，證明其準(zhǔn)確度符合標(biāo)準(zhǔn)要求；基質(zhì)2個加標(biāo)水平的回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足＜20%的要求，證明其重復(fù)性及重現(xiàn)性符合標(biāo)準(zhǔn)要求[4]。

表2 基質(zhì)加標(biāo)數(shù)據(jù)表

2.2 不確定度的來源的確定和分析

2.2.1 A類不確定度的來源

取大豆分離蛋白基質(zhì)的最低點加標(biāo)的6個平行測定結(jié)果計算麩質(zhì)過敏原含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)。6 次的結(jié)果分別為 1.8 mg·kg-1、1.9 mg·kg-1、1.8 mg·kg-1、2.3 mg·kg-1、2.1 mg·kg-1和 2.3 mg·kg-1，平均值為 2.03 mg·kg-1[5-6]。

麩質(zhì)過敏原含量測定重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

麩質(zhì)過敏原含量測定重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 B類不確定度來源

（1）樣品稱量m引起的不確定度urel(M)。用萬分之一電子天平進行樣品的稱量，其分度值為0.1 mg，取均勻分布，包含因子則可讀性的不確定度為天平校正產(chǎn)生的不確定度，按檢定證書給出的稱量誤差為±0.3 mg，假設(shè)為均勻分布，

由此2項合成得出稱量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

得出稱量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(M)=u(M)/0.25 g=7.28×10-4。

（2）10 mL移液器移取提取液引起的不確定度urel(V)。樣品提取時加入10 mL提取液。移液器的不確定度來源于移液器產(chǎn)生的不確定度u(V1)和溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度u(T)。

移液器產(chǎn)生的不確定度：10 mL移液器，其不確定度由SIMT校定給出擴展不確定度U=12 μL，k=2；標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V1)=U/k=6 μL。

溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度：移液器一般在20 ℃下被校準(zhǔn)，實驗室的環(huán)境溫度一般為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，按矩形分布10 mL移液器由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(T)=10 000×5×2.1×10-4/則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引起的不確定度urel(std)。制備工作曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液時，使用了1 000 μL移液槍。1 000 μL移液槍的擴展不確定度U=3.5 μL，k=2；按矩形分布，溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1 000×5×2.1×

則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）測試用樣液體積引起的不確定度urel(V2)。吸取100 μL樣品提取液上機測試。使用100 μL移液槍，其擴展不確定度U=0.6 μL，k=2；按矩形分布，溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為100×5×2.1×10-4/

則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）酶標(biāo)儀引入的不確定度urel(A)。由校準(zhǔn)證書給出儀器擴展不確定度為吸光度U=0.06（k=2），則相對不確定度為urel(A)=0.06/2=0.03。

（6）孵育時間引入的不確定度urel(T)。實驗中共孵育3次，孵育時間均為10 min。已校準(zhǔn)過的計時器擴展不確定度為U=1 s（k=2），則由溫育時間引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（7）孵育溫度引入的不確定度urel(W)。實驗中共孵育3次，孵育溫度均為22 ℃。已校準(zhǔn)過的孵育箱擴展不確定度為U=0.4 ℃（k=2），則由溫育溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 計算合成相對不確定度urel(X)

合成相對不確定度urel(X)為：

2.2.4 計算擴展不確定度

在95%的置信概率下時，擴展因子k=2，則大豆分離蛋白中的麩質(zhì)過敏原含量的擴展不確定度為U=2×0.058 7=11.7%。則麩質(zhì)過敏原含量的測定結(jié)果可以表述為X=（2±0.234）mg·kg-1（k=2）。

2.3 不確定度評估

選取大豆分離蛋白基質(zhì)的最低點加標(biāo)數(shù)據(jù)作為A類不確定度的數(shù)據(jù)來源，統(tǒng)計測試的各個環(huán)節(jié)中所使用到的定量設(shè)備以及溫度和時間等關(guān)鍵因素作為B類不確定度的數(shù)據(jù)來源，最后合成A類與B類不確定度，從而得出一個合成擴展不確定度作為方法的不確定度U=2×0.058 7=11.7%（k=2）。

3 結(jié)論

從實驗結(jié)果可以看出采用ELISA的方法可以準(zhǔn)確測定大豆分離蛋白、薯條、淋洗水中麩質(zhì)的含量，其準(zhǔn)確性和精密度均能符合標(biāo)準(zhǔn)要求、不確定度也能比較準(zhǔn)確地體現(xiàn)該方法結(jié)果的可信賴程度、檢出限也能符合歐盟的法規(guī)要求。表明本文通過ELISA的測試方法解決了LC-MS/MS測試成本高、PCR只能測基因片段而不是測試致敏蛋白導(dǎo)致的假陽性問題以及PCR和側(cè)向流動技術(shù)僅為定性法的問題，因此采用該方法測試麩質(zhì)過敏原是一個成本較低、定量準(zhǔn)確的較好的選擇，不僅有利于企業(yè)對自己上市的產(chǎn)品進行篩查，還利于監(jiān)管單位對市售產(chǎn)品進行監(jiān)管。