嬰幼兒配方乳粉中泛酸檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法與試劑盒法比對(duì)探究

◎ 孫叢叢，李 鵬，李玉平，張?zhí)觳?/p>

（河北三元食品有限公司，河北 石家莊 050700）

泛酸又稱(chēng)維生素B5，是一種水溶性維生素，化學(xué)式為C9H17NO5，因以輔酶A（CoA）和?；d體蛋白（ACP）這種結(jié)合態(tài)形式廣泛存在于動(dòng)植物中而得“泛酸”之名[1]。泛酸純品為淡黃色油狀物，具有酸性，易溶于水及乙醇，不溶于脂溶劑；在酸性溶液中易分解，在中性溶液中較為穩(wěn)定[2-4]。

經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道，泛酸的檢測(cè)方法有間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法、毛細(xì)管等速電泳法以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[5-9]。目前，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016）中規(guī)定，食品中泛酸的檢測(cè)方法有微生物法和高效液相色譜法，各企業(yè)使用微生物法檢測(cè)泛酸還可分為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法和試劑盒法。

高效液相色譜法利用泛酸的化學(xué)性質(zhì)，即泛酸易溶于水，在弱酸性至中性條件下（pH為5.0～7.0）穩(wěn)定，樣品經(jīng)超聲提取后，經(jīng)C18反相色譜柱分離，在紫外檢測(cè)器200 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，通過(guò)對(duì)色譜峰的保留時(shí)間和紫外光譜圖定性，利用外標(biāo)法定量，可計(jì)算樣品中泛酸的含量。但該方法不適于含水解蛋白乳粉樣品檢測(cè)，而且需要的儀器成本和維護(hù)成本投入較大[10]。傳統(tǒng)微生物法是利用植物乳桿菌生長(zhǎng)需要泛酸，泛酸含量與植物乳桿菌生長(zhǎng)吸光度成線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)對(duì)植物乳桿菌吸光度的測(cè)定，可計(jì)算出待測(cè)樣品中泛酸的含量。此檢測(cè)方法需要提前活化菌株，洗菌制備接種菌懸液，樣品前處理提取過(guò)程至少4 h，接種前需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列管和試樣管進(jìn)行高壓滅菌，檢測(cè)過(guò)程比較復(fù)雜，對(duì)人員和環(huán)境設(shè)施要求高，檢測(cè)周期長(zhǎng)。試劑盒法與傳統(tǒng)微生物法原理相同，但其采用了一種新型的微孔板反應(yīng)體系，使用方便，不需要活化菌株，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，而且靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，可在各企業(yè)內(nèi)廣泛使用。

《嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)許可審查細(xì)則（2013版）》中明確規(guī)定，企業(yè)可以使用快速檢驗(yàn)設(shè)備，但應(yīng)保持檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。企業(yè)使用的快速檢測(cè)方法及設(shè)備應(yīng)定期與食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法進(jìn)行比對(duì)或驗(yàn)證。因此，本文采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法與試劑盒法檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中的泛酸含量，并對(duì)兩種方法進(jìn)行比對(duì)，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

5種嬰幼兒配方乳粉，均購(gòu)自河北三元食品有限公司；質(zhì)控樣品Q(chēng)C-IP-705（2021），購(gòu)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；試劑盒，購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

植物乳桿菌（ATCC 8014），美國(guó)Microbiologics公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

（1）培養(yǎng)基。乳桿菌肉湯培養(yǎng)基、菌株儲(chǔ)存用瓊脂培養(yǎng)基、泛酸測(cè)定培養(yǎng)基，購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

（2）試劑。冰乙酸（天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠(chǎng)）、三水合乙酸鈉（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、乙醇（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品。D-酸鈣（C18H32CaN2O10），純度99.8%，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204分析天平（梅特勒托利多有限公司）；KQ5200DE超聲振蕩器（昆山市超聲儀器公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械公司）；DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械公司）；YXQ-LS-100A壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；Vortex Genie2渦旋混勻器（美國(guó)Vortex）；TD5M-WS離心機(jī)（上海盧湘儀儀器有限公司）；T9S紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀、移液器（美國(guó)熱電）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016），稱(chēng)取樣品后加入80 mL 20%乙醇溶液，具塞，超聲振搖提取4 h以上至試樣完全溶解，用水定容至100 mL，適當(dāng)稀釋。試劑盒法是加入20 mL樣品提取稀釋液后，95 ℃水浴加熱30 min，迅速冷卻，無(wú)菌濾膜過(guò)濾，再進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016）和試劑盒說(shuō)明書(shū)分別制備標(biāo)準(zhǔn)溶液。具體見(jiàn)表1、表2。為保證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系，應(yīng)制備2～3套標(biāo)準(zhǔn)系列管，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的均值計(jì)算。

表1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法標(biāo)準(zhǔn)溶液制備表

表2 試劑盒法標(biāo)準(zhǔn)溶液制備表

1.3.3 菌懸液制備

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法需要活化菌株，挑取單菌落至種子培養(yǎng)液，（37±1）℃培養(yǎng)20～24 h后，3 000 r·min-1，離心10 min，棄去上清液，用0.9%無(wú)菌生理鹽水重復(fù)洗菌2次（3 000 r·min-1，離心10 min）后，棄去上清液，復(fù)溶，制成接種液。試劑盒法直接使用套裝菌球即可。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)系列管及樣品管制備

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法標(biāo)準(zhǔn)系列管按照表1制備，最后每管加入5 mL泛酸測(cè)定用培養(yǎng)基。樣品系列管制備見(jiàn)表3。

表3 樣品系列管制備表

各系列管制備完成后，需要于121 ℃滅菌15 min，之后迅速冷卻至室溫。無(wú)菌條件下，每管加入50 μL接種液，另準(zhǔn)備一支標(biāo)準(zhǔn)0管（含0 ng泛酸）不接種，作為0對(duì)照管。

1.3.5 接種與培養(yǎng)

試劑盒法采用點(diǎn)板操作，套裝內(nèi)干粉培養(yǎng)基與10 mL無(wú)菌水混合后，于95 ℃水浴加熱10 min，迅速冷卻，經(jīng)無(wú)菌濾膜過(guò)濾，加入標(biāo)準(zhǔn)菌球，混勻。微孔板內(nèi)先點(diǎn)培養(yǎng)基，每孔100 μL，再點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液/樣品稀釋液，每孔100 μL。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法培養(yǎng)條件為（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。試劑盒法為（36±1）℃，避光培養(yǎng)44～48 h。

1.3.6 吸光度測(cè)定

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法使用紫外分光光度計(jì)，于550 nm處，以未接種的0對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣系列管的吸光度值。試劑盒法使用酶標(biāo)儀，于550 nm處，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液和各樣品溶液吸光度值。

1.3.7 泛酸含量計(jì)算

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法試樣稀釋液中泛酸濃度按式（1）計(jì)算：

式中：ρ為試樣稀釋液中泛酸濃度，ng·mL-1；ρx為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得測(cè)定系列管中泛酸含量，ng；Vx為制備試樣系列管時(shí)吸取的試樣稀釋液體積，mL。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法待測(cè)液中泛酸含量按式（2）計(jì)算：

式中：X為試樣中泛酸含量，固態(tài)試樣，mg/100 g；為試樣稀釋液泛酸濃度平均值，ng·mL-1；V1為試樣提取液的定容體積，mL；F為試樣提取液稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g；為換算系數(shù)。

試劑盒法待測(cè)液中泛酸含量按式（3）計(jì)算：

式中：X為樣品中泛酸濃度， μg/100 g（ μg/100 mL）；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀取的濃度，μg/100 g；F為稀釋倍數(shù)（不考慮熱提取時(shí)稀釋的20倍）；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

以標(biāo)準(zhǔn)系列管泛酸含量為橫坐標(biāo)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值均值為縱坐標(biāo)，使用ELISA專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)分析軟件中4-Parameyer繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法和試劑盒法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1、圖2所示。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.992 8，試劑盒法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.994 3，兩種方法線(xiàn)性關(guān)系均良好。

圖1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法泛酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

圖2 試劑盒法泛酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法和試劑盒法分別對(duì)6個(gè)樣品測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4、表5。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法重復(fù)性測(cè)定RSD值為1.16%～2.43%，試劑盒法重復(fù)性測(cè)定RSD值為1.14%～2.29%，兩種方法重復(fù)性均良好，且質(zhì)控樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)與理論真值（3.955 mg/100 g）接近，準(zhǔn)確度較高。

表4 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表

表5 試劑盒法重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表

2.3 方法差異比較

采用配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，對(duì)兩種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行分析，t值為0.602，sig值為0.573（p＞0.05），表明國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法和試劑盒法檢測(cè)泛酸含量無(wú)顯著差異，因此試劑盒法可以應(yīng)用于嬰幼兒食品中泛酸的測(cè)定。

3 討論

與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物法相比，試劑盒法主要有以下優(yōu)勢(shì)。①菌株活化方面，不需要提前活化菌株，縮短了檢測(cè)周期。②耗材使用方面，不需要大量試管、三角瓶、容量瓶等玻璃器皿，可省去清洗、沸水浴煮、高溫干燥滅菌等處理工序。③標(biāo)準(zhǔn)溶液配制直接配制工作液即可，線(xiàn)性范圍更寬，適于高含量泛酸樣品檢測(cè)。④樣品前處理時(shí)間短，方便快捷。⑤樣品吸光度值測(cè)定采用96孔板，使用酶標(biāo)儀測(cè)定，一次性讀取數(shù)據(jù)，快速、高效。因此，試劑盒法更適于企業(yè)實(shí)驗(yàn)室大量實(shí)驗(yàn)樣本的檢測(cè)。

4 展望

實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)探究?jī)龈删驈?fù)溶菌懸液濃度，配制不同濃度泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用96微孔板，對(duì)泛酸進(jìn)行測(cè)定，這樣可省去試劑盒檢測(cè)費(fèi)用，為企業(yè)節(jié)約檢測(cè)成本。另外，通過(guò)調(diào)試菌懸液濃度與樣品稀釋液稀釋度，通過(guò)優(yōu)化其最佳配比，有可能縮短微孔板培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)而縮短檢測(cè)周期。