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    HER2陽性乳腺癌ERBB3基因E928G點(diǎn)突變功能的初步研究

    2022-04-19 12:28:58韋光楠廖寧陳博
    醫(yī)學(xué)綜述 2022年7期
    關(guān)鍵詞:磷酸化變異位點(diǎn)

    韋光楠,廖寧,陳博

    (1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣州 510006; 2.廣東省人民醫(yī)院 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院乳腺外科,廣州 510080)

    根據(jù)全球流行病學(xué)調(diào)查顯示,乳腺癌在女性中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。其中人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor,HER)2過表達(dá)型發(fā)病率為15%~20%,因易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后較差??笻ER2靶向藥物治療的效果較好,但腫瘤耐藥的發(fā)生大大縮短了患者的生存期[2-3]。HER3/ERBB3作為HER家族中的一員,能與HER2形成異源二聚體,該二聚體在HER家族異源二聚體中活性最強(qiáng)。HER2/HER3異源二聚體的形成能激活下游信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化[4-5]。當(dāng)ERBB3形成異二聚體且被磷酸化后,胞內(nèi)暴露出的6個(gè)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)亞基結(jié)合位點(diǎn)能夠募集PI3K至調(diào)節(jié)亞基位點(diǎn),進(jìn)而激活下游PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)信號(hào)通路,導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生[6]。因此,ERBB3基因作為乳腺癌治療的另一個(gè)可行靶點(diǎn)越來越受到重視[7]。CLEOPATRA臨床研究發(fā)現(xiàn),ERBB3過表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān),但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),ERBB3并不能預(yù)測(cè)藥物治療對(duì)患者是否獲益[8-9]。在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)ERBB3錯(cuò)義突變能增強(qiáng)ERBB2/ERBB3異源二聚體的活性,從而促進(jìn)腫瘤生長,導(dǎo)致抗HER2治療耐藥的發(fā)生[10]。目前對(duì)于ERBB3基因在乳腺癌中的研究結(jié)果尚不統(tǒng)一,對(duì)乳腺癌的治療效果仍不明確[11-12]。因此,本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ERBB3基因突變可能對(duì)乳腺癌細(xì)胞造成的影響,為后續(xù)進(jìn)一步研究ERBB3基因在乳腺癌細(xì)胞中的作用提供依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 納入2017年6月至2019年5月就診于廣東省人民醫(yī)院經(jīng)病理確診為乳腺癌的患者384例。免疫組織化學(xué)雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體任一項(xiàng)陽性定義為激素受體(hormone receptor,HR)陽性,其中HR-/HER2-患者50例,HR-/HER2+患者43例,HR+/HER2-患者227例,HR+/HER2+患者64例。本研究獲得廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署了知情同意書。

    1.2方法

    1.2.1主要儀器與試劑 Nextseq500測(cè)序平臺(tái)(美國Illumina公司),高速離心機(jī)Z230MR(德國HERMLE公司),Bio-Rad T100聚合酶鏈反應(yīng)儀、中型垂直電泳系統(tǒng)、B107蛋白印跡成像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司,細(xì)胞培養(yǎng)二氧化碳孵育箱和超凈工作臺(tái)(美國Thermo公司),DKZ-1恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司),JY96-IIN超聲裂解細(xì)胞儀(上海滬析公司)。核酸提取及純化試劑盒、基因測(cè)序用文庫試劑盒均購自美國Agilent公司,杜爾貝科改良伊格爾高糖培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司,BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(批號(hào):P0010S)、3-磷酸甘油醛脫氫酶內(nèi)參抗體(批號(hào):AF1186)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置試劑盒(批號(hào):P0012A)均購自上海碧云天公司,磷酸化ERBB3(Tyr1289)抗體(美國Affinity公司生產(chǎn),批號(hào):DF7597),磷酸化Akt(Ser473)抗體(批號(hào):4060T)、Akt抗體(批號(hào):4691S)均購自美國Cell Signaling Technology公司,ECL熒光檢測(cè)試劑(北京索萊寶公司生產(chǎn),批號(hào):PE0010)。人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT474-V1、SKBR3-V1,ERBB3基因正常表達(dá)的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT474-C1、SKBR3-C1,ERBB3基因E928G突變的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT474-M1、SKBR3-M1均由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2.2基因組DNA提取 石蠟包埋組織樣本在提取核酸前進(jìn)行組織脫蠟,新鮮組織樣本無需進(jìn)行此步驟。新鮮組織標(biāo)本研磨成小顆粒,石蠟包埋組織標(biāo)本脫蠟后研磨,加入細(xì)胞裂解液,充分混勻后加入蛋白酶K,水浴加熱至完全溶解,加入核糖核酸酶A,水浴1 h迅速降溫,加入蛋白沉淀液離心,取上清液加入異丙醇,離心,棄上清液,加入70%乙醇沖洗DNA沉淀,離心棄去上清液,加入DNA溶解液水浴溶解DNA。樣本質(zhì)量要求核酸總量>50 ng為合格品,DNA純度A260/A280為1.7~2.1。

    1.2.3上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 引物設(shè)置為寡核苷酸,模板為文庫片段進(jìn)行DNA的復(fù)制,復(fù)制完成后將文庫片段洗脫,采用邊合成邊測(cè)序,在Read1完成后,解鏈并洗掉測(cè)序中合成的部分,加入Index引物,繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制,讀出接頭中Index序列,從而得出每個(gè)位點(diǎn)的DNA所屬文庫。本研究測(cè)序范圍覆蓋520個(gè)癌癥相關(guān)基因的基因組進(jìn)行分析,對(duì)于目的基因ERBB3的檢測(cè)包括拷貝數(shù)變異、基因融合、單核苷酸變異、插入或缺失等。

    1.2.4Western blot檢測(cè)磷酸化Akt水平 采用胰酶分別消化細(xì)胞株BT474-V1、SKBR3-V1、BT474-C1、SKBR3-C1、BT474-M1、SKBR3-M1,在培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基,移液槍吹打成細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至EP管中,2 500 r/min離心5 min,棄去上清液。磷酸鹽緩沖溶液吹打洗滌細(xì)胞,繼續(xù)離心,再重復(fù)磷酸鹽緩沖溶液洗滌1次。在每管細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液置于冰上裂解5 min,再將每管置于超聲裂解細(xì)胞儀繼續(xù)裂解。取上清液分裝于0.5 ml離心管。本實(shí)驗(yàn)采用BCA法測(cè)蛋白濃度,具體操作流程嚴(yán)格按照試劑盒流程執(zhí)行并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白濃度。采用凝膠試劑盒操作說明進(jìn)行凝膠的配置。待測(cè)樣品中加入Loading buffer混勻后,金屬浴100 ℃ 5 min。每孔上樣量12 μl后連接電源正負(fù)極進(jìn)行電泳,初始先將電流設(shè)置為80 V電泳20 min后,增大電壓至120 V繼續(xù)電泳,總時(shí)長為2.5 h。電泳結(jié)束后開始電轉(zhuǎn)膜,調(diào)整電流至250 mA,電壓100~120 V,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為4 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束,加入封閉液室溫封閉1 h。一抗按照說明書稀釋后,搖床上4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后,在室溫下Tris-Hcl緩沖液洗膜3次,再加入與一抗相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h。孵育結(jié)束后,繼續(xù)用Tris-Hcl緩沖液洗膜3次。ECL工作液處理后,置于蛋白印跡ECL-過氧化物酶成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描拍照。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2 HumVar生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)改變產(chǎn)生的危害性。PROVEAN軟件評(píng)分為-14~-2.5定義為有害突變,-2.5~14定義為良性改變;SIFT軟件評(píng)分>0.05定義為中性,<0.05定義為有害突變;Poly-Phen-2 HumVar軟件評(píng)分為0~0.446定義為中性,0.910~1.00定義為可能有害[13-14]。

    2 結(jié) 果

    2.1HER家族變異分布情況 384例患者中133例檢出HER家族變異(包括表皮生長因子受體1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)。表皮生長因子受體1變異頻率為1.3%(5/384);ERBB2變異頻率最高,為28.9%(111/384),其中ERBB2擴(kuò)增103例,ERBB2突變14例,同一患者的ERBB2基因可同時(shí)存在多種變異類型;ERBB3變異頻率為3.4%(13/384);ERBB4變異頻率為1.0%(4/384)。

    2.2ERBB3基因變異患者的一般情況 13例ERBB3基因患者年齡22~80歲,中位年齡54歲,年齡≥50歲8例,年齡<50歲5例;月經(jīng)狀態(tài):絕經(jīng)前6例,絕經(jīng)后7例;病理類型:浸潤性導(dǎo)管癌11例,浸潤性小葉癌1例,浸潤性混合型癌1例;組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)2例,Ⅱ級(jí)5例,Ⅲ級(jí)6例;腫瘤大?。篢17例,T25例,T31例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài):N010例,N11例,N21例,N31例;臨床分期: Ⅰ A 5例, Ⅱ A 6例,ⅢA 1例,ⅢC 1例;ER狀態(tài):ER+10例,ER-3例;HER2狀態(tài):HER2+3例,HER2-10例;HR/HER2狀態(tài):HR+/HER2-7例,HR+/HER2+3例,HR-/HER2-3例,無HR-/HER2+患者。

    2.3乳腺癌ERBB3基因變異類型 本研究中檢測(cè)到ERBB3常見的突變類型為錯(cuò)義突變,此外還有擴(kuò)增、內(nèi)含子突變。突變的熱點(diǎn)主要集中在胞外結(jié)構(gòu)域Ⅱ以及激酶區(qū),突變的熱點(diǎn)為V104L、E928G,見圖1。13例患者中有12例為ERBB3基因錯(cuò)義突變(其中1例患者ERBB3基因發(fā)生G284A、E928G兩個(gè)位點(diǎn)的錯(cuò)義突變),1例患者檢測(cè)到ERBB3基因擴(kuò)增。在12例基因錯(cuò)義突變患者中,有1例患者檢測(cè)到ERBB3基因內(nèi)含子突變。本研究檢測(cè)到的新突變位點(diǎn)為N522S、S300F、R678W、M760R、Q1301*。

    注:Mutations為突變,ERBB3為人表皮生長因子受體3

    2.4ERBB3基因突變蛋白功能損傷預(yù)測(cè) PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)改變產(chǎn)生的危害性,結(jié)果顯示,D297Y、T355I、E928G、E1261A、L431F、P583S、R667L、D297H、R678W位點(diǎn)的改變均可能對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能造成有害影響,見表1。

    2.5Western blot檢測(cè)磷酸化ERBB3、Akt水平 人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞BT474-V1、SKBR3-V1均不表達(dá)ERBB3蛋白。BT474-C1、SKBR3-C1均為重新構(gòu)建的能夠表達(dá)ERBB3蛋白的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞。BT474-M1、SKBR-3-M1是慢病毒感染后構(gòu)建的ERBB3基因E928G突變的人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞。6組細(xì)胞中磷酸化ERBB3水平未見明顯改變,在BT474-M1、SKBR-3-M1兩組細(xì)胞中磷酸化Akt水平明顯升高,見圖2。

    表1 ERBB3突變位點(diǎn)PROVEAN、SIFT、Poly-Phen-2 HumVar軟件評(píng)分

    注:pERBB3為磷酸化人表皮生長因子受體3,pAkt為磷酸化蛋白激酶B,GADPH為3-磷酸甘油醛脫氫酶

    3 討 論

    既往研究發(fā)現(xiàn),ERBB3基因擴(kuò)增可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長分化,最終導(dǎo)致對(duì)藥物治療的敏感性降低[15]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),ERBB3擴(kuò)增改變或ERBB3與其他HER家族成員形成異二聚化后,不易被降解,下游通路異常激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖[16-17],但對(duì)于ERBB3基因突變對(duì)腫瘤影響的研究較少。Yang等[18]發(fā)現(xiàn)ERBB3基因不同位點(diǎn)突變的胃腸道腫瘤對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的敏感性不同,通過構(gòu)建不同位點(diǎn)突變的腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)E928G位點(diǎn)突變對(duì)耐藥的影響最大,影響藥物療效的機(jī)制可能與下游PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活相關(guān)[7]。ERBB3基因在乳腺癌方面的研究主要是基因擴(kuò)增對(duì)腫瘤的影響,涉及基因突變的研究較少[19-20],故本研究旨在探索ERBB3突變對(duì)乳腺癌治療的影響。

    與以往研究不同,本研究從臨床患者樣本的數(shù)據(jù)出發(fā),尋找ERBB3基因常見突變類型及突變熱點(diǎn),主要研究潛在的有害突變位點(diǎn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響。本研究結(jié)果顯示,本中心與TCGA數(shù)據(jù)庫中均存在共同的突變熱點(diǎn)E928G及V104L,利用生物信息學(xué)軟件對(duì)檢測(cè)到的突變位點(diǎn)進(jìn)行分析,因此能更快地篩選出潛在的有害突變位點(diǎn)。經(jīng)過3個(gè)軟件分析顯示,E928G位點(diǎn)突變危害性更大,與以往文獻(xiàn)報(bào)道相同[18]。通過對(duì)突變細(xì)胞磷酸化Akt水平的檢測(cè),驗(yàn)證了ERBB3突變的HER2陽性乳腺癌細(xì)胞中磷酸化Akt水平升高,該結(jié)果可能與ERBB3基因構(gòu)象改變相關(guān)。E928位點(diǎn)位于激酶區(qū),該區(qū)域存在PI3K調(diào)節(jié)亞基位點(diǎn),與PI3K相結(jié)合后激活下游通路,當(dāng)E928位點(diǎn)發(fā)生改變,募集到更多的PI3K結(jié)合亞基位點(diǎn),下游PI3K/Akt信號(hào)通路活化水平提高,可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥[21-22]。

    綜上所述,ERBB3基因E928G突變可引起細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt水平升高,可能使下游PI3K/Akt信號(hào)通路過度激活,導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。本研究為HER2陽性乳腺癌患者抗HER2治療耐藥的機(jī)制研究提供了新方向,同時(shí)也為多靶點(diǎn)聯(lián)合治療提供了新思路。但本研究存在的不足主要是未進(jìn)行臨床標(biāo)本的驗(yàn)證,有待后續(xù)的藥物相關(guān)性研究進(jìn)行補(bǔ)充。

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