短暫清除小膠質(zhì)細胞減緩光誘導損傷小鼠視網(wǎng)膜視功能退變

饒必林 肖家怡 林鑫 臧科多 譚航 湯純 張軍 高美玲

作者單位：溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院 眼視光與視覺科學國家重點實驗室 視網(wǎng)膜生理和疾病研究組，溫州 325027

光線是視覺形成的必要因素，但長期較強的光照會造成視網(wǎng)膜光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮細胞的凋亡，稱之為光毒性。流行病學研究表明，可見光照射是視網(wǎng)膜變性，尤其是年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）發(fā)生和病變的危險因素，因此視網(wǎng)膜光損傷的研究在臨床眼科和視覺科學中占有重要的地位。在AMD中，光感受器細胞變性是不可逆性視力喪失的主要原因。小膠質(zhì)細胞是視網(wǎng)膜內(nèi)的常駐免疫細胞，在免疫監(jiān)視和宿主防御中發(fā)揮重要作用，但其在視網(wǎng)膜變性中究竟是起神經(jīng)保護還是神經(jīng)毒性作用仍不明確。在光感受器細胞變性刺激下，小膠質(zhì)細胞的激活增加，活化的小膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生大量的促炎細胞因子和趨化因子。有研究表明通過干預(yù)小膠質(zhì)細胞免疫反應(yīng)可以減輕光感受器細胞的損傷，保持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。集落刺激因子1受體（Colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）小分子抑制劑可以選擇性地消除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞，已被廣泛用于生理和病理條件下小膠質(zhì)細胞起源、復(fù)制和功能發(fā)揮的研究。本研究旨在通過構(gòu)建穩(wěn)定的光誘導視網(wǎng)膜損傷模型，利用CSF1小分子抑制劑短暫清除小膠質(zhì)細胞，研究其能否減緩急性光誘導的視網(wǎng)膜損傷，以期制定1種通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞來抑制視網(wǎng)膜變性的策略。

1.料與方法

1.1.料

1.1.1.驗動物 選取ICR雄性白化小鼠30只，8周齡，體質(zhì)量為22～24 g，購自上海杰思捷實驗動物技術(shù)有限公司。所有動物均飼養(yǎng)在溫度為25 ℃，相對濕度為70%的環(huán)境中，光照和黑暗周期為12 h，并給予充足的飼料和水。實驗動物的飼養(yǎng)和使用均嚴格遵守國家技術(shù)委員會頒布的《實驗動物質(zhì)量管理辦法》。

1.1.2.要試劑及儀器 TUNEL試劑盒（0000452295，Promega公司）；兔抗鼠Cone-arrestin抗體（AB15282，1:400，美國Millipore公司）、鼠抗C-terminalbindingprotein-2（CtBP2）抗體（612044，1:100，美國BD公司）、兔抗Protein kinase C-ɑ（PKC-ɑ）抗體（P4334，1:300，德國Sigma公司）、兔抗IBA1抗體（019-19741，1:400，日本W(wǎng)AKO公司）、鼠抗CD68抗體（MCA1957，1:400，美國Bio-Rad公司），Alexa Fluor 488偶聯(lián)驢抗鼠IgG（715-545-150，1:500，美國Jackson公司），Alexa Fluor 594 偶聯(lián)驢抗兔IgG（711-585-152，1:500，美國Jackson公司）；小分子抑制劑PLX5622（S887405，美國Selleck公司）；超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（LSM880，德國蔡司公司），羅蘭視覺電生理儀（RETI-Port 21，德國羅蘭公司），體式顯微鏡（SZM0850，深圳微特視界科技有限公司）。

1.2.法

1.2.1.組及造模 將30只ICR小鼠隨機分為對照組、光損傷組和清除小膠質(zhì)細胞組，每組10只。光損傷組小鼠在光照前進行24 h暗適應(yīng)，隨后將小鼠暴露于15 000 lx的白光下，照射20 h；結(jié)束光照后置于黑暗飼養(yǎng)條件下過夜，并轉(zhuǎn)入正常光照周期，直到5 d后利用視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢查視網(wǎng)膜功能。清除小膠質(zhì)細胞組則先連續(xù)5 d以腹腔注射的方式給予20 μl濃度為100 mmol/L的PLX5622溶液，之后暴露于15 000 lux白光下20 h，緊接著連續(xù)注射3 d PLX5622溶液，直至取材。

1.2.2.RG檢測 強光照射結(jié)束后5 d，通過對ICR小鼠進行ERG檢查，評價視網(wǎng)膜功能。ERG檢查前小鼠暗適應(yīng)8 h，腹腔注射0.8%的戊巴比妥鈉進行麻醉，并用1%托吡卡胺進行散瞳。將引導電極輕觸摸角膜，參考電極置于耳后皮下，接地電極連接尾巴根部。按照暗適應(yīng)0.01，暗適應(yīng)3.0，暗適應(yīng)10.0，暗適應(yīng)3.0振蕩電位，明適應(yīng)3.0和明適應(yīng)閃爍3.0 的程序記錄雙眼的反應(yīng)，取a、b波振幅平均值進行統(tǒng)計分析。

1.2.3.UNEL試驗 采用細胞凋亡原位檢測試劑盒對視網(wǎng)膜切片進行TUNEL染色。將30 μm的視網(wǎng)膜冰凍切片晾干，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌5 min，重復(fù)3次。0.2%的TritonX-100穿透5 min；加入平衡液平衡10 min，棄平衡液；加入含有平衡緩沖液、核苷酸和rTdT酶混合物；蓋上塑料蓋玻片，37 ℃避光孵育1 h。移除塑料蓋玻片，加入2X SSC終止反應(yīng)，封片，置于超高分辨率激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4.疫熒光染色 分別采集各組小鼠的眼球并解剖得到視網(wǎng)膜，將其置于4%多聚甲醛（Polyformaldehyde，PFA）中固定40 min，經(jīng)10%，20%和30%蔗糖脫水后進行OCT包埋，然后冰切。切片用兔抗Cone-arrestin抗體、鼠抗C-terminalbindingprotein-2（CtBP2）抗體、兔抗Protein kinase C-ɑ（PKC-ɑ）抗體、兔抗IBA1抗體、鼠抗CD68抗體等一抗過夜孵育；用Alexa Fluor 594偶聯(lián)驢抗兔和Alexa Fluor 488偶聯(lián)驢抗鼠二抗對切片進行染色。DAPI染色檢測細胞核。

1.2.5.聚焦顯微鏡成像及圖像分析 將免疫熒光染色后的視網(wǎng)膜切片或鋪片置于超高分辨率激光共聚焦顯微鏡下成像。對于TUNEL切片染色都選取視神經(jīng)附近的切片，統(tǒng)計該片上所有TUNEL陽性細胞數(shù)量；視網(wǎng)膜鋪片則將其平均分為4個象限，每個象限在距離視神經(jīng)大約0.5 mm的位置拍1 張圖片，該圖片包含視神經(jīng)纖維層（Retinal nerve fiber layer，RNFL），內(nèi)網(wǎng)狀層（Inner plexiform layer，IPL），外網(wǎng)狀層（Outer plexiform layer，OPL）和外核層（Outer nuclear layer，ONL）層，統(tǒng)計各層小膠質(zhì)細胞的數(shù)量。

1.3.計學方法

實驗研究。采用IBM SPSS Statistics（26版）統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。每組數(shù)據(jù)先進行方差齊性檢驗，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，若方差齊性，則選用LSD比較；方差不齊，則選用Tamhane’s T2（M）比較。以

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.果

2.1.損傷模型的建立

相比于對照組，光損傷組在暗適應(yīng)ERG反應(yīng)中a波和b波的振幅均出現(xiàn)顯著性下降，差異有統(tǒng)計學意義（

P

<0.001，

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=0.008）（見圖1A-B），說明光損傷組的光感受器細胞層和雙極細胞層出現(xiàn)功能障礙。TUNEL染色結(jié)果顯示，對照組基本上無TUNEL陽性細胞，而光損傷組在神經(jīng)節(jié)細胞層，內(nèi)核層及外核層均有TUNEL陽性細胞出現(xiàn)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，外核層TUNEL陽性細胞數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計學意義（

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=0.035）（見圖1C-D）。上述結(jié)果表明，光誘導小鼠視網(wǎng)膜損傷后ERG反應(yīng)顯著下降，凋亡細胞顯著增多，說明本研究成功建立了穩(wěn)定的光損傷模型。

圖1.強光造成ICR小鼠視網(wǎng)膜損傷A：代表性的ERG記錄；B：視網(wǎng)膜電圖a波和b波的振幅統(tǒng)計（柱高和誤差柱代表平均值和SD，n=24）；C：小鼠視網(wǎng)膜切片TUNEL染色，綠色為TUNEL陽性信號，藍色為DAPI信號（標尺=50 μm）；D：小鼠各核層TUNEL陽性細胞數(shù)量統(tǒng)計（柱高和誤差柱代表平均值和SEM，n=3，每只小鼠在視神經(jīng)附近選取2～3張切片染色）。Control表示對照組，LD5表示光損傷組；a，P<0.05；b，P<0.01；c，P<0.001Figure 1.Strong light cause ICr retinal damage.A:A representative ERG records.B:Statistics of the ERG a wave and b wave amplitude (column height and error bars represent mean value and SD,n=24).C:TUNEL staining of mouse retinal sections,green represents TUNEL positive signal,blue represents DAPI signal (Bar=50 μm).D:Statistics of TUNEL positive cells in each nuclear layer of mouse retina (column height and error bars represent mean value and SEM,n=3,2-3 sections were selected near the optic nerve from each mouse).Control represents the control group,and LD5 represents light damage group;ERG,electroretinogram;SD,standard error of mean;SEM,standard error of mean.a,P<0.05;b,P<0.01;c,P<0.001.

2.2.損傷后視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的變化

對照組小膠質(zhì)細胞主要分布在IPL和OPL，在內(nèi)核層和外核層鮮有小膠質(zhì)細胞胞體出現(xiàn)，但光損傷5 d后，激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量增多，并向外核層甚至視網(wǎng)膜下腔遷移（見圖2A、B）。視網(wǎng)膜鋪片染色的結(jié)果與切片染色一致，可以看到相較于對照組，光損傷組在外網(wǎng)層的小膠質(zhì)細胞數(shù)目明顯增加。此外，對照組中的小膠質(zhì)細胞的特點為胞體小，分枝細且長，呈典型的靜息狀態(tài)；但光損傷組小膠質(zhì)細胞除了數(shù)目增多外，胞體變大，分枝短而粗，呈變形蟲樣，是典型的激活狀態(tài)（見圖2B）。對分布在外網(wǎng)狀層和外核層的小膠質(zhì)細胞進行統(tǒng)計，光損傷組相較于對照組小膠質(zhì)細胞增多，差異有統(tǒng)計學意義（

P

<0.001）（見圖2D）。

圖2.光損傷導致小膠質(zhì)細胞的增殖激活和遷移A：小鼠視網(wǎng)膜切片染色，紅色表示IBA1信號，綠色表示CD68信號，藍色表示DAPI信號，SRS表示視網(wǎng)膜下腔，OPL表示外網(wǎng)狀層。B：小鼠視網(wǎng)膜鋪片染色，紫色表示IBA1信號，綠色表示CD68信號。C：光損傷組視網(wǎng)膜下腔小膠質(zhì)細胞分布情況，紅色表示IBA1信號，綠色表示CD68信號。D：視網(wǎng)膜鋪片外網(wǎng)狀層和外核層小膠質(zhì)細胞的統(tǒng)計結(jié)果，黑色為對照組，紅色為光損傷組（柱高和誤差柱代表平均值和SD，n=3，每個視網(wǎng)膜拍3～4張照片）。標尺=50 μm；c，P<0.001Figure 2.Light damage leads to proliferation,activation and migration of microgliaA:Staining of mouse retinal sections,red indicates IBA1 signal,green indicates CD68 signal,blue indicates DAPI signal,SRS indicates subretinal space,OPL indicates outer plexiform layer.B:Retinal whole-mount staining,purple indicates IBA1 signal,green indicates CD68 signal.C:Distribution of microglia in the subretinal lumen of the light damage group,red indicates IBA1 signal,green indicates CD68 signal.D:Statistical results of microglia in the retinal outer plexiform layer and outer nuclear layer.Black represents the control group,and red represents the light-damaged group (column height and error bar represent mean value and SD,n=3,3-4 photos per retina).SRS,subretinal space;OPL,outer nuclera layer;Bar=50 μm;c,P<0.001.

2.3.除小膠質(zhì)細胞減少光損傷造成的細胞凋亡

小膠質(zhì)細胞的清除策略見圖3A。視網(wǎng)膜切片免疫組織化學結(jié)果顯示，清除小膠質(zhì)細胞使光損傷引起活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，浸潤到視網(wǎng)膜下腔和外核層的小膠質(zhì)細胞也顯著減少，見圖3B。視網(wǎng)膜鋪片免疫組織化學直觀體現(xiàn)了OPL/ONL小膠質(zhì)細胞數(shù)量的減少，且差異有統(tǒng)計學意義（

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=0.027），見圖3C-D。與之相符的是，清除小膠質(zhì)細胞后由光損傷造成視網(wǎng)膜TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯減少，主要體現(xiàn)在OPL（見圖3E-F）。

圖3.清除小膠質(zhì)細胞對光損傷后視網(wǎng)膜的保護作用A：小膠質(zhì)細胞的清除策略圖；B：各組視網(wǎng)膜切片有代表性的免疫熒光圖，紅色信號表示IBA1信號，綠色信號表示CD68信號，藍色信號表示DAPI信號；C：小鼠視網(wǎng)膜鋪片免疫組織化學，紅色表示IBA1信號；D：視網(wǎng)膜鋪片外網(wǎng)狀層和外核層小膠質(zhì)細胞數(shù)目的統(tǒng)計結(jié)果，1表示光損傷組，2表示小膠質(zhì)細胞清除組（柱高和誤差柱代表平均值和SEM，n=3，每個視網(wǎng)膜拍3～4張）；E：小鼠視網(wǎng)膜切片TUNEL染色，綠色為TUNEL陽性信號，藍色為DAPI信號；F：小鼠視網(wǎng)膜各核層TUNEL陽性細胞統(tǒng)計結(jié)果（柱高和誤差柱代表平均值和SEM，n=3～4，每個眼球染3張切片）。標尺=50 μm；aP<0.05Figure 3.Protective effect of microglia depletion on retina after light damageA:Microglia clearance strategy.B:Representative immunofluorescence images of each group,red signal represents IBA1 positive cells,green signal represents CD68 positive cells,and blue signal represents DAPI positive cells.C:Retinal whole-mount immunohistochemistry,red signal represents IBA1.D:Statistical results of the number of microglia in the retinal outer plexiform layer and outer nuclear layer,1 represents the light damage group,2 represents the microglia depletion group (column height and error bars represent mean value and SEM,n=3,3-4 shots per retina).E:TUNEL staining of mouse retina section,green is TUNEL positive signal,blue is the DAPI signal.F:Statistical results of TUNEL positive cells in each nuclear layer of the mouse retina (column height and error bars represent mean value and SEM,n=3-4,each eyeball is stained with 3 slices).SEM,standard error of mean;Bar=50 μm;a,P<0.05.

2.4.膠質(zhì)細胞的清除對突觸的影響

突觸前和突觸后的形態(tài)學改變（如結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常）會影響突觸傳遞。因此，本研究檢測了突觸前相關(guān)蛋白CtBP2的表達情況和與突觸后靶點密切相關(guān)的PKC-α信號。視網(wǎng)膜切片免疫組織化學結(jié)果顯示，與對照組相比，光損傷組的CtBP2信號明顯減弱，但小膠質(zhì)細胞清除組相比于光損傷組CtBP2信號減弱程度較輕（見圖4A）。PKC-α的免疫組織化學結(jié)果顯示，雙極細胞的信號傳遞在光損傷后，也出現(xiàn)明顯的減弱；但小膠質(zhì)細胞清除組較于光損傷組有一定程度的增強（見圖4B）。

圖4.清除小膠質(zhì)細胞保護細胞間信號傳遞A：CtBP2免疫組織化學結(jié)果，綠色表示CtBP2信號，藍色表示DAPI信號；B：PKC-α免疫組織化學結(jié)果，紅色表示PKC-α信號，藍色表示DAPI信號。標尺=10 μmFigure 4.Microglia depletion protects intercellular signaling transmission.A:Immunohistochemical results of CtBP2 (green) and DAPI (blue).B:Immunohistochemical results of PKC-α (red) and DAPI (blue);Bar=10 μm.

2.5.除小膠質(zhì)細胞減緩光誘導感光細胞功能損傷

從上述結(jié)果可知，光損傷會引起視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡，所以本研究探究了視錐細胞的外節(jié)長度變化。免疫組織化學結(jié)果顯示，光損傷后視錐細胞的外節(jié)變短；小膠質(zhì)細胞清除組中視錐細胞外節(jié)長度幾乎維持在正常水平（見圖5A）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，光損傷組與小膠質(zhì)細胞清除組的外節(jié)長度差異有統(tǒng)計學意義（

P

<0.001），且對照組與小膠質(zhì)細胞清除組差異無統(tǒng)計學意義，見圖5B。ERG的結(jié)果表明，光損傷前是否注射PLX5622 對ERG反應(yīng)無顯著影響；但注射PLX5622 后，ERG反應(yīng)損傷程度減輕，但差異不具有統(tǒng)計學意義（見圖5C-D）。

圖5.清除小膠質(zhì)細胞對光損傷后視網(wǎng)膜功能的影響A：Cone-arrestin免疫組織化學結(jié)果；B：視錐細胞外節(jié)統(tǒng)計結(jié)果，1 代表對照組，2 代表光損傷組，3 代表小膠質(zhì)細胞清除組；C：代表性的視網(wǎng)膜電圖記錄；D：視網(wǎng)膜電圖b波的振幅統(tǒng)計，灰色表示未注射PLX5622，紅色表示注射PLX5622（柱高和誤差柱代表平均值和SD，Non PLX5622 n=10，PLX5622 n=8）；標尺=20 μm，cP<0.001Figure 5.The effects of microglia depletion on retinal function after light damageA:Cone-arrestin immunohistochemical results.B:Statistical results of cone outer segment length,1 represents the control group,2 represents the light damage group,and 3 represents the microglia depletion group.C:Representative electroretinogram records.D:Amplitude statistics of ERG b wave,gray indicates no injection PLX5622,red indicates injection PLX5622 (column height and error bars represent mean value and SD,Non PLX5622 n=10,PLX5622 n=8);Bar=20 μm,cP<0.001.

3.論

實驗性光誘導視網(wǎng)膜變性構(gòu)建模型已被廣泛用于視網(wǎng)膜疾病相關(guān)機制的研究中。與遺傳性視網(wǎng)膜變性相比，光損傷模型具有如下優(yōu)點，首先它不依賴于動物的遺傳缺陷和年齡；其次，由于視網(wǎng)膜變性是誘發(fā)的，研究人員可以通過調(diào)節(jié)光照強度、曝光時間和光譜來控制視網(wǎng)膜退化的程度。但在照射過程中，要注意籠中小鼠的密度，防止出現(xiàn)個體差異大的情況。本研究以對光誘導視網(wǎng)膜損傷極其敏感的白化小鼠作為動物模型，15 000 lx的白光照射白化小鼠20 h，成功造成小鼠視網(wǎng)膜功能下降和感光細胞變性。上述結(jié)果表明本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定的光誘導視網(wǎng)膜損傷模型。

當光照誘導視網(wǎng)膜發(fā)生損傷后，負責監(jiān)控視網(wǎng)膜微環(huán)境的小膠質(zhì)細胞被激活，活化的小膠質(zhì)細胞將產(chǎn)生促炎因子和趨化因子，如CCL2調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的遷移，使其在神經(jīng)元損傷部位出現(xiàn)并聚集。研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞浸潤到OPL，通過吞噬作用清除凋亡變性的光感受器，并進一步分泌促進光感受器凋亡的促炎細胞因子。與之相似的是，本研究發(fā)現(xiàn)在光損傷后，小膠質(zhì)細胞被激活，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；隨著時間的推移，活化的小膠質(zhì)細胞逐漸從IPL向OPL甚至視網(wǎng)膜下腔遷移，到達光感受器損傷部位。光損傷組分布在OPL/ONL中小膠質(zhì)細胞的數(shù)目相較于對照組顯著增多。

有學者認為小膠質(zhì)細胞可以清除受損視網(wǎng)膜中凋亡的光感受器和細胞碎片，從而有利于光感受器的存活，但也有人認為小膠質(zhì)細胞的活化及其細胞炎性反應(yīng)可能是視網(wǎng)膜變性發(fā)病機制的早期改變，小膠質(zhì)細胞的持續(xù)活化將最終導致視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的損傷。除了光誘導視網(wǎng)膜變性模型，在遺傳性視網(wǎng)膜變性中小膠質(zhì)細胞的激活甚至比光感受器細胞凋亡發(fā)生的更早，而且激活的小膠質(zhì)細胞吞噬活的光感受器細胞，可能是加速視網(wǎng)膜變性的關(guān)鍵。利用四環(huán)素調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)可以挽救幼年神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)病小鼠光照引起的視網(wǎng)膜病變，而通過腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）過表達TGF-β1來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活，也可以保護遺傳性視網(wǎng)膜病變小鼠中視錐細胞的凋亡。因此，通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活以及免疫調(diào)節(jié)治療可能成為挽救視網(wǎng)膜變性的潛在手段。

CSF1R主要表達在髓系細胞中，尤其是巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞。該受體介導的信號通路對于髓系細胞的存活、增殖和遷移等功能均具有重要作用。早期研究者通過該基因敲除的小鼠來研究免疫細胞缺失的影響，但由于該基因的重要性，敲除小鼠表現(xiàn)出諸多弊端。直至2014 年，Elmore等開發(fā)了CSF1R的小分子抑制劑，可以在短期內(nèi)清除小膠質(zhì)細胞，開啟了小膠質(zhì)細胞研究的新紀元。他們的研究表明，持續(xù)使用CSF1R小分子抑制劑可以抑制斑塊形成，并顯著改善阿爾茲海默癥小鼠模型的學習和記憶功能。此外，在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，損傷后通過CSF1R小分子抑制劑短暫清除小膠質(zhì)細胞，可以顯著改善神經(jīng)病變和認知功能。因此，本研究嘗試通過CSF1R小分子抑制劑短暫清除小膠質(zhì)細胞干預(yù)光照引起的視網(wǎng)膜變性。

既往研究表明光誘導小鼠視網(wǎng)膜損傷后，小膠質(zhì)細胞迅速激活，于光照后6 h便可在OPL觀察到遷移的小膠質(zhì)細胞，而在小鼠飼料中添加或者通過腹腔注射小分子抑制劑PLX5622，需要1周左右才可以顯著清除視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞。為了排除小膠質(zhì)細胞早期激活對光感受器細胞的影響，本研究在光誘導損傷前5 d開始通過腹腔注射PLX5622進行處理，試圖在光損傷前殺死大部分小膠質(zhì)細胞，并在損傷后繼續(xù)注射PLX5622，排除短期內(nèi)小膠質(zhì)細胞對光感受器細胞的影響。清除小膠質(zhì)細胞后，發(fā)現(xiàn)被激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著減少，同時分布在OPL/ONL的小膠質(zhì)細胞數(shù)量也隨之減少，進一步分析發(fā)現(xiàn)光感受器凋亡的數(shù)量也減少，一定程度上緩解了急性光損傷導致的光感受器損傷。通過突觸相關(guān)蛋白和雙極細胞的免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)短期清除小膠質(zhì)細胞對光損傷后視網(wǎng)膜的信號傳導有一定的保護作用。最后ERG顯示清除小膠質(zhì)細胞對視網(wǎng)膜功能有保護作用，但差異不具有統(tǒng)計學意義。因此在急性光誘導視網(wǎng)膜損傷模型中，小膠質(zhì)細胞的迅速活化和增殖可能引發(fā)了過度的炎癥反應(yīng)，加重了光感受器的變性。

本研究在OPL 凋亡細胞數(shù)量和改善視功能方面實驗組和對照組差異不具有統(tǒng)計學意義?？赡艽嬖谝韵略?，第一，本研究采用的腹腔注射PLX5622 與飼料添加PLX5622 清除小膠質(zhì)細胞的方式，清除效果上存在一定的差距。雖然大部分研究者采用在飼料中添加PLX5622 的方式，也證明了該方法可以實現(xiàn)99%的清除率，但該方法無法用于新生的小鼠，而且在飼料中添加需要的PLX5622量較大。為了克服以上問題，Riquier等采用腹腔注射的方式清除小膠質(zhì)細胞，他們的研究發(fā)現(xiàn)，該方法可以實現(xiàn)新生小鼠和成年鼠中99%的清除率。第二，Todd等研究表明，在NMDA致小鼠視網(wǎng)膜興奮性損傷模型中，運用PLX5622清除小膠質(zhì)細胞將導致視網(wǎng)膜神經(jīng)元死亡增加。相矛盾的是Takeda等發(fā)現(xiàn)清除小膠質(zhì)細胞可以保護神經(jīng)節(jié)細胞抵抗N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartate，NMDA）。那么在光誘導損傷條件下，清除小膠質(zhì)細胞對光感受器細胞雖有保護作用，但對于其他神經(jīng)元和細胞產(chǎn)生的影響并不明確，這可能導致結(jié)果不具有統(tǒng)計學意義。第三，本研究樣本數(shù)較少，標準誤偏大。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，停止注射PLX5622后，小膠質(zhì)細胞迅速增殖，甚至超過正常小鼠視網(wǎng)膜中小膠質(zhì)細胞的數(shù)量（結(jié)果未發(fā)表）。我們在檢測視網(wǎng)膜功能時，已經(jīng)停止注射48 h，這也可能對小鼠視網(wǎng)膜功能造成一定的影響。因此，本研究仍存在不足之處，后期將增加動物數(shù)量，進一步開展光損傷后進行小膠質(zhì)細胞清除對視網(wǎng)膜變性的影響的研究。

總之，本研究結(jié)果顯示調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)可以有效改善光感受器的損失率，挽救視網(wǎng)膜功能。因此，未來針對調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活性的藥物研發(fā)將給眼病患者帶來福音。

利益沖突申明

本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明

饒必林：收集數(shù)據(jù)，資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。肖家怡：收集數(shù)據(jù)，資料的分析和解釋。林鑫、臧科多、譚航、湯純：收集數(shù)據(jù)。張軍：參與選題、設(shè)計和修改論文的結(jié)果結(jié)論。高美玲：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進行核修。