土壤中抑菌放線菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件研究

晏愛芬 余麗 黃鑫

摘要 采用彈土法從高黎貢山百花嶺段土壤中共分離到放線菌38株，對分離得到的38株放線菌的發(fā)酵液進行抑菌活性測定，其中H33菌株對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白假絲酵母都具有較好的抑菌作用，其抑菌直徑都在8 mm以上。通過對H33菌株培養(yǎng)特征、顯微特征和生理生化特征的研究，初步鑒定為鏈霉菌屬（Streptomyces）。H33菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基2（葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.25 g、胰胨0.15 g、NaCl 0.25 g、重鉻酸鉀7.5 mg、復合維生素10 g、水500 mL，pH 7.2），最佳發(fā)酵時間為6 d，最適發(fā)酵培養(yǎng)基pH為7.0，最適培養(yǎng)溫度28? ℃。

關鍵詞 抑菌放線菌;篩選;鑒定;分離純化;發(fā)酵條件

中圖分類號 S154.3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）07-0065-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.016

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Screening and Identification of Bacteriostatic Actinomycetes in Soil and Fermentation Conditions

YAN Ai-fen， YU Li，HUANG Xin

（School of Resources and Environment，Baoshan University，Baoshan，Yunnan 678000）

Abstract A total of 38 actinomycetes were isolated from the soil in Baihualing section of Gaoligong Mountain by the bombing method，and the antibacterial activity of the 38 isolated actinomycetes was tested.Among them，the H33 strain had good antibacterial effects on Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus and Candida albicans，and its antibacterial diameter was all above 8 mm.Through the study of the culture characteristics，microscopic characteristics and physiological and biochemical characteristics of the H33 strain，it was preliminarily identified as Streptomyces.The best fermentation medium for H33 strain was fermentation medium 2 （glucose 0.5 g，peptone 0.25 g，tryptone 0.15 g，NaCl 0.25 g，potassium dichromate 7.5 mg，multivitamin 10 g，water 500 mL，pH 7.2） ，the optimal fermentation time was 6 d，the optimal fermentation medium pH was 7.0，and the optimal culture temperature was 28? ℃.

Key words Antibacterial actinomycetes;Screening;Identification;Isolation and purification;Fermentation conditions

放線菌由于菌落邊緣菌絲呈放射狀而得名[1]。在微生物資源中放線菌具有巨大的應用價值，在它的營養(yǎng)細胞分化成菌絲以及進一步產(chǎn)生孢子的過程中，細胞代謝會產(chǎn)生各種各樣的次生代謝產(chǎn)物，它們能夠合成一些具有專一性功能的物質(zhì)，來控制細胞分化和細胞周期，從而抑制病原菌的生長[2]。放線菌在自然環(huán)境中分布廣泛，如陸地、淡水、動物腸道、植物體等均有分布。其中土壤含水量較低、通風較好、腐殖質(zhì)豐富，適宜大量放線菌的生長[3]。譚悠久等[4]從土壤中分離抑菌放線菌，并對分離到的抑菌放線菌進行代謝產(chǎn)物抗菌活性研究;王東勝[5]從秦嶺主峰太白山北坡土壤中分離抑菌放線菌，分離到的放線菌具有抑菌作用的可培養(yǎng)菌株達到56%。高黎貢山百花嶺段植被豐富，土壤腐殖質(zhì)豐富，人為干擾較小，其土壤中含有大量的微生物，該研究從高黎貢山百花嶺段土壤中篩選具有抑菌作用的放線菌，并對該放線菌進行初步鑒定、發(fā)酵條件等研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品的采集。

從高黎貢山百花嶺段不同海拔和植被區(qū)采集土壤。采集時去除表層土后用鏟子鏟取5～10 cm深度的土壤，放入自封袋，寫好標簽。帶回實驗室4? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白假絲酵母（Candida albicans），均由保山學院微生物實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基。

高氏1號培養(yǎng)基;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細菌）;PDA培養(yǎng)基（真菌）;發(fā)酵培養(yǎng)基1（液體高氏1號培養(yǎng)基）;發(fā)酵培養(yǎng)基2（葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.25 g、胰胨0.15 g、NaCl 0.25 g、重鉻酸鉀7.5 mg、復合維生素10 g、水500 mL，pH 7.2）;發(fā)酵培養(yǎng)基3（葡萄糖2.5 g、乳糖0.75 g、玉米餅粉10 g、碳酸鈣 1.5 g、蒸餾水500 mL，pH 7.0）。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離與純化。

采用彈土分離法分離放線菌。土樣風干研碎，放于已滅菌的濾紙片上，打開平板皿蓋，用手指彈撥濾紙片背面（使紙片含菌面保持在平板上方），蓋上皿蓋后置28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，挑單菌落進行平板劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，挑取單菌落移接斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株發(fā)酵液抑菌活性的測定。

挑取放線菌接種于10 mL液體高氏1號培養(yǎng)基中，放入28 ℃、160 r/min振蕩恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，取1 mL培養(yǎng)液置于離心機10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾后用于抑菌活性測定[6]。

采用濾紙片法對分離到的放線菌進行抑菌活性測定。用1 mL的移液槍吸取供試菌菌液0.2 mL分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基表面，用直徑為5 mm的濾紙片，蘸取濾液貼于涂滿供試菌液的平板上，每個平板貼3張含有濾液的濾紙片，再貼一片蘸取無菌水的濾紙片作為對照，平板分別置于37、28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法用直尺測量抑菌圈直徑，求平均值[7-8]。

1.2.3 抑菌放線菌的分類鑒定。

1.2.3.1 培養(yǎng)特征觀察。

將篩選出的放線菌接種于液體高氏1號培養(yǎng)基中，在28 ℃下培養(yǎng)3、5、7 d分別觀察并記錄菌株在培養(yǎng)基生長時的菌落形態(tài)，不同時間段內(nèi)的顏色變化和生長情況[9]。

1.2.3.2 顯微特征觀察。用已滅菌的蓋玻片45°插入培養(yǎng)基中，在蓋玻片與培養(yǎng)基的交界處接種放線菌，28 ℃培養(yǎng)7 d后緩慢拔出蓋玻片，用光學顯微鏡觀察記錄菌絲體形態(tài)。

1.2.3.3 生理生化特征。菌株的生理生化特征參考徐麗華等[10]的方法進行。

1.2.4 發(fā)酵條件的研究。以下試驗均用生長速率法測其抑菌率，其方法參照徐方繼等[11]的方法進行。

1.2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響。

分別取25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基1、發(fā)酵培養(yǎng)基2、發(fā)酵培養(yǎng)基3，裝入100 mL錐形瓶中滅菌后，接種抑菌放線菌，置于28 ℃、280 r/min搖床恒溫培養(yǎng)6 d后，測其對白假絲酵母的抑菌率，選擇出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基[12]。

1.2.4.2 培養(yǎng)時間對發(fā)酵液抑菌作用的影響。

保持其他培養(yǎng)條件不變，分別在培養(yǎng)4、5、6、7、8 d后測放線菌發(fā)酵液對白假絲酵母的抑菌率，選出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)時間。

1.2.4.3 溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響。

取pH為7.0的25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入100 mL錐形瓶中滅菌后，接種抑菌放線菌，分別置于24、28、32、36 ℃在280 r/min搖床培養(yǎng)6 d后，測出其對白假絲酵母的抑菌率，選出最佳發(fā)酵溫度。

1.2.4.4 pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響。

利用氫氧化鈉（1 mol/L）和鹽酸（1 mol/L）將篩選到的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，各取25 mL不同初始pH的培養(yǎng)基裝入100 mL錐形瓶中滅菌后，接種置于28 ℃、280 r/min搖床培養(yǎng)6 d后，測出其對白假絲酵母的抑菌率。

2 結果與分析

2.1 土壤中抑菌放線菌的篩選 從采集的土樣中共分離純化到38株放線菌，采用濾紙片法對38株放線菌發(fā)酵液進行抑菌活性測定，其中有5株放線菌具有抑菌作用，如表1所示。由表1可知，H33菌株的發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白假絲酵母都具有抑菌作用，其中對白假絲酵母的抑菌效果最好，其抑菌圈直徑達到11.40 mm。因此，選取H33放線菌進行進一步試驗研究。

2.2 菌株的初步鑒定

2.2.1 菌落特征。H33菌株菌落特征如圖1所示，正面呈現(xiàn)出紫色，反面呈暗紅色，菌落的表面褶皺，產(chǎn)生了一定量的水珠，生長狀況良好。

2.2.2 顯微特征。

在光學顯微鏡下觀察H33菌株的菌絲形態(tài)特征如圖2所示，氣生菌絲豐富，直徑較粗、不斷裂，顏色為紫灰色;孢子絲螺旋狀、右旋;基內(nèi)菌絲呈暗紅色，質(zhì)地堅韌、無隔膜。

2.2.3 生理生化特征。

H33菌株的生理生化特征如表2所示，菌株不能使明膠液化，產(chǎn)纖維素酶，能使牛奶凝固和胨化，不產(chǎn)淀粉酶，能利用葡萄糖和蔗糖，不能利用果糖，試驗顯示H33菌株氮源不能利用丙氨酸和酪氨酸。

根據(jù)菌株H33的菌落特征、顯微特征、生理生化特征，參照閻遜初[13]放線菌分類系統(tǒng)，初步鑒定菌株H33為鏈霉菌屬（Streptomyces）。

2.3 發(fā)酵條件的研究

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株H33發(fā)酵液抑菌活性的影響。

用3種不同發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株H33進行發(fā)酵培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)（表3），其發(fā)酵液對白假絲酵母的抑菌效果最好的是發(fā)酵培養(yǎng)基2，抑菌率達到40.50%。

2.3.2 培養(yǎng)時間對菌株H33發(fā)酵液抑菌活性的影響。

從表4可以看出，從發(fā)酵第4天開始至第6天，菌體慢慢地產(chǎn)生了一些次級代謝物，發(fā)酵液的抑菌活性在緩慢增加;到第6天后由于各類營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏和菌體自身代謝活性的降低，自身所產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物也越來越少，發(fā)酵液的抗菌活性也隨之變?nèi)?，所以最佳發(fā)酵時間為6 d，其抑菌率達到41.54%。

2.3.3 溫度對菌株H33發(fā)酵液抑菌活性的影響。

H33菌株在不同溫度下發(fā)酵，其發(fā)酵液對白假絲酵母的抑菌活性如表5所示，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，其抑菌效果最好，抑菌率達到44.07%。

2.3.4 pH對菌株H33發(fā)酵液抑菌活性的影響。從表6可以看出，

H33菌株在不同的pH條件下發(fā)酵，其發(fā)酵液的活性受pH的影響，在pH大于7.0時，活性逐步降低。抑菌活性較好的是pH為7.0的發(fā)酵液，抑菌率達到40.50%。

3 討論與結論

放線菌是一種具有應用前景的微生物資源，自然界分布廣泛，數(shù)量眾多，其中與人類關系密切的鏈霉菌屬（Streptomyces）最為典型[14]。馬愛愛等[15]從祁連山老虎溝不同海拔位點的根際土壤中分離純化放線菌，并對具有抑菌作用的放線菌進行生理及系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究，其中鏈霉菌屬為主要類群。

該研究從高黎貢山百花嶺段土壤中分離純化放線菌，并對分離到的放線菌進行抑菌試驗，從中篩選具有抑菌作用的放線菌，菌株H33對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白假絲酵母都具有較好的抑菌效果，抑菌直徑都在8 mm以上，且對白假絲酵母的抑菌直徑在11 mm以上。對H33菌株的菌落特征、顯微特征和生理生化特征分析，可將H33菌株初步鑒定為鏈霉菌屬放線菌。通過發(fā)酵條件研究菌株H33的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基2（葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.25 g、胰胨0.15 g、NaCl 0.25 g、重鉻酸鉀7.5 mg、復合維生素10 g、水500 mL，pH 7.2），最適發(fā)酵時間為6 d，最適發(fā)酵初始pH為7.0，最適培養(yǎng)溫度為28 ℃。

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