健康體檢人群血清膽紅素水平對頸動脈粥樣硬化進(jìn)展影響的隊列研究

秦璐 ，谷永勝 ，李琳 ，張凱華 ，姚文濤 ，吳宗鍇，何偉亮，牛小莉，李俐濤，王賀波*

腦血管病發(fā)病率、致殘率、死亡率高，是影響居民生活質(zhì)量的重要原因。全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，缺血性腦血管病約占所有腦血管病事件的62.4%［1］，腦血管病已成為我國健康壽命損失的第一病因［2］。目前認(rèn)為，動脈粥樣硬化是缺血性心腦血管病發(fā)生、發(fā)展的重要病理學(xué)基礎(chǔ)［3］，而超聲測定頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度（carotid intima-media thickness，cIMT）作為一種臨床常用的無創(chuàng)性動脈粥樣硬化檢測方法，已在世界范圍內(nèi)被廣泛使用［4］。橫斷面研究表明，血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平與高血壓、高脂血癥患者cIMT呈負(fù)相關(guān)［5-7］，提示TBIL可能為動脈粥樣硬化的保護(hù)因素，但目前探究TBIL和間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）作用的大型隊列研究較少。本研究通過回顧性隊列研究方法，應(yīng)用彩色超聲診斷儀測定cIMT，探討TBIL和IBIL平均暴露水平對健康體檢人群頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的影響，以期為腦血管病防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本隊列研究數(shù)據(jù)來自2010年1月至2019年12月于河北省人民醫(yī)院體檢中心進(jìn)行健康體檢者。所有研究對象均為石家莊地區(qū)居民。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初次體檢時cIMT≤1 mm；（2）進(jìn)行≥2次的體檢且初次體檢時TBIL≤34.2 μmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）初次體檢或隨訪結(jié)束時的TBIL和/或IBIL數(shù)據(jù)缺失者；（2）潛在的吉爾伯特人群，即TBIL＞34.2 μmol/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）＞80 U/L和/或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）＞80 U/L者［8］；（3）嚴(yán)重腎臟疾病、心功能不全，以及醛固酮增多癥、庫欣綜合征等糖脂代謝異常者。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（編號：2021102）。

1.2 資料收集 （1）一般資料收集。第一次體檢時收集參與者信息，包括年齡、性別、吸煙和飲酒狀況、既往史。（2）體格檢查。測量身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)指數(shù)（BMI）；使用自動血壓計測量靜坐血壓，包括收縮壓和舒張壓，測血壓前休息5 min，均檢測右手臂，間隔5 min后復(fù)測，計算兩次測量的平均值。（3）實驗室檢查。第一次體檢時禁食至少8 h，采集靜脈血液標(biāo)本，采用血液分析儀測定白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計數(shù)（NEUT）。采用日本日立公司全自動生化分析儀進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。采用CHOD-PAP底物法測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），采用直接法和選擇抑制法分別測定高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），采用國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會推薦方法測定AST、ALT，采用己糖激酶法測定血糖，采用脲酶-谷氨酸脫氫法測定尿素氮（BUN），采用堿性苦味酸法測定血肌酐（Scr），采用釩酸鹽氧化法測定TBIL和直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL），計算IBIL。（4）超聲檢查。應(yīng)用彩色超聲診斷儀（佳能醫(yī)療系統(tǒng)和西門子醫(yī)療系統(tǒng)）測量cIMT，醫(yī)師經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)培訓(xùn)并獲得資格認(rèn)證?？v向掃描雙側(cè)頸動脈（圖1），動脈壁的兩條高回聲線分別為內(nèi)膜線和中膜線，兩條高回聲線之間的距離即為cIMT，測量雙側(cè)cIMT取平均值。

圖1 頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度的測量Figure 1 Measurement of carotid intima-media thickness

1.3 定義與診斷標(biāo)準(zhǔn) （1）高血壓：收縮壓/舒張壓≥140/90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），或既往診斷為高血壓，目前正在服用降壓藥物者［9］。（2）糖尿?。嚎崭寡恰?.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT ）2 h血糖≥11.1 mmol/L，或既往診斷為糖尿病，目前應(yīng)用降糖藥物或胰島素者［10］。（3）BMI分組：以BMI=24 kg/m2作為成年人超重與否的分界線［11］。（4）IBIL計算公式：IBIL=TBIL-DBIL。（5）估算的腎小球濾過率（eGFR）計算公式：eGFR=175×Scr-1.154×年齡-0.203×（0.742女性）［12］。（6）腎功能不全是指有慢性腎臟病史且eGFR＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1的患者。（7）心功能不全：紐約心功能分級為Ⅳ級，即休息時也有心源性呼吸困難癥狀者。（8）吸煙定義為目前吸煙或既往吸煙而戒煙未滿3年，飲酒定義為每日飲用白酒＞40 g。（9）隨訪終點(diǎn)：頸動脈粥樣硬化進(jìn)展，即體檢發(fā)現(xiàn)cIMT＞1 mm；如隨訪期內(nèi)cIMT未增加，則以最后一次體檢時間為隨訪終點(diǎn)。（10）分組定義：頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組為隨訪終點(diǎn)時cIMT＞1 mm；非進(jìn)展組為直至隨訪結(jié)束，cIMT≤1 mm。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)并雙人整理核查，采用R 4.0.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料采用（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）〔M（QR）〕表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料采用相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以膽紅素水平為自變量構(gòu)建Cox比例風(fēng)險回歸模型，采用方差膨脹因子診斷法檢驗混雜因素之間是否存在共線性，排除方差膨脹因子＞5的混雜因素，分析血清膽紅素水平與頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的關(guān)系。由于部分參與者的血清清蛋白信息不完整，本研究在主模型分析中沒有考慮血清清蛋白水平，通過調(diào)整有清蛋白數(shù)據(jù)的參與者的血清清蛋白水平進(jìn)行敏感性分析，驗證結(jié)論。以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象頸動脈粥樣硬化進(jìn)展情況 共入選11 394例研究對象，其中女3 962例（34.77%），男7 432例（65.23%），平均基線年齡（48.6±12.4）歲，參與者的平均隨訪時間為（2.39±1.46）年；在隨訪期間，1 586例（13.92%）cIMT增加，納入頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組，9 808例（86.08%）cIMT無增加，納入非進(jìn)展組。

2.2 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組與非進(jìn)展組基線特征比較 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組與非進(jìn)展組年齡、性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、LDL-C、TC、TG、ALT、AST、BUN、eGFR水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；吸煙史、飲酒史、WBC、NEUT、HDL-C、Scr水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組與非進(jìn)展組基線特征比較Table 1 Comparison of characteristics between the carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

2.3 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組與非進(jìn)展組不同性別研究對象TBIL和IBIL水平比較 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組平均TBIL和IBIL水平分別為（14.59±4.60）μmol/L和（10.90±3.54）μmol/L，非進(jìn)展組平均TBIL和IBIL水平分別為（14.44±4.60）μmol/L和（10.89±3.63）μmol/L，兩組間TBIL及IBIL水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（tTBIL=1.26，PTBIL=0.211；tIBIL=0.08，PIBIL=0.937）。在頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組和非進(jìn)展組中，男性的TBIL和IBIL水平均高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

表2 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組與非進(jìn)展組不同性別研究對象TBIL和IBIL水平比較（±s，μmol/L）Table 2 Comparison of TBIL and IBIL levels between different genders in carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

表2 頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組與非進(jìn)展組不同性別研究對象TBIL和IBIL水平比較（±s，μmol/L）Table 2 Comparison of TBIL and IBIL levels between different genders in carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

注：TBIL=總膽紅素，IBIL=間接膽紅素

性別 例數(shù) TBIL IBIL頸動脈粥樣硬化進(jìn)展組男1 109 15.34±4.69 11.38±3.64女477 12.16±3.86 9.79±3.01 t值 -11.04 -9.00 P 值 ＜0.001 ＜0.001非進(jìn)展組男6 323 15.38±4.63 11.55±3.69女3 485 11.90±4.01 9.69±3.19 t值 -29.64 -26.15 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 健康體檢人群血清膽紅素水平對頸動脈粥樣硬化進(jìn)展影響的Cox回歸分析 模型1以cIMT是否增加為因變量（賦值：否=0，是=1），以膽紅素水平（賦值：以實際值納入）為自變量進(jìn)行Cox回歸分析；模型2在模型1基礎(chǔ)上校正了性別（賦值：女=0、男=1）和年齡（賦值：＜60歲=0、≥60歲=1）；模型3在模型2基礎(chǔ)上校正了BMI（賦值：＜24 kg/m2=0、≥24 kg/m2=1）、吸煙史（賦值：無=0，有=1）、飲酒史（賦值：無=0，有=1）；模型4在模型3基礎(chǔ)上校正了高血壓（賦值：無=0，有=1）、糖尿病（賦值：無=0，有=1）、HDL-C、LDL-C、TG、TC、ALT、AST、eGFR（計量資料以實際值納入）。研究隊列中5人缺失是否患高血壓的信息，85人缺失是否患糖尿病的信息，在進(jìn)行Cox回歸分析時，模型4及敏感性分析中沒有納入缺失信息者。模型4結(jié)果顯示：TBIL水平每升高1個標(biāo)準(zhǔn)差，頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的風(fēng)險下降6.6%〔HR（95%CI）=0.934（0.881，0.990）〕；IBIL水平每升高1個標(biāo)準(zhǔn)差，頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的風(fēng)險下降17.4%〔HR（95%CI）=0.826（0.777，0.877）〕，見表 3。

表3 健康體檢人群血清膽紅素水平對頸動脈粥樣硬化進(jìn)展影響的Cox回歸分析Table 3 Cox regression analysis of the influence of serum bilirubin level on the progression of carotid artery plaque in healthy subjects

表4顯示了在模型4基礎(chǔ)上對年齡、性別、BMI、飲酒、吸煙、高血壓、糖尿病進(jìn)一步分層分析（變量賦值同表3）。結(jié)果顯示TBIL、IBIL對于不同亞組人群頸動脈粥樣硬化的保護(hù)作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表4 在不同分層人群中膽紅素對頸動脈粥樣硬化進(jìn)展影響的Cox回歸分析Table 4 Cox regression analysis of the effect of bilirubin on carotid plaque progression in different stratified populations

2.5 敏感性分析 為了排除血清清蛋白水平對膽紅素與頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的混雜影響，且由于僅有部分體檢人群有血清清蛋白數(shù)據(jù)，因此模型5在模型4的基礎(chǔ)上進(jìn)一步校正血清清蛋白水平，結(jié)果顯示在除外血清清蛋白的影響后，膽紅素水平仍是頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的保護(hù)因素〔HR（95%CI）分別為0.912（0.833，0.998）、0.841（0.767，0.922），P＜0.05〕，見表 3。

3 討論

本研究采用隊列設(shè)計，在石家莊地區(qū)研究血清膽紅素對頸動脈粥樣硬化的影響。調(diào)整了混雜因素后發(fā)現(xiàn)，TBIL和IBIL水平是頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的保護(hù)因素，IBIL的保護(hù)作用更強(qiáng)。

研究表明，膽紅素是動脈粥樣硬化的保護(hù)因素［13］。TAO等［14］進(jìn)一步研究了IBIL的作用，認(rèn)為IBIL是動脈粥樣硬化的保護(hù)因素。本研究結(jié)果支持了上述結(jié)論，且IBIL的保護(hù)作用較TBIL更強(qiáng)。BERGMANN等［15］發(fā)現(xiàn)，IBIL對男性和女性的保護(hù)作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異，本研究結(jié)果支持此結(jié)論。一項涉及2 207例研究對象的橫斷面研究使用肱-踝脈波速度作為觀察指標(biāo)，得出膽紅素只對男性有保護(hù)作用，對女性沒有保護(hù)作用的結(jié)論［16］。這些研究結(jié)果的不同可能與研究設(shè)計、人群異質(zhì)性、膽紅素水平不同有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)膽紅素是最有效的內(nèi)源性抗氧化劑，在腦梗死等急性氧化應(yīng)激事件時可迅速增加，其水平與腦梗死的嚴(yán)重程度及不良功能預(yù)后呈正相關(guān)［17］。但在健康人群和高血壓、糖尿病、肥胖等人群中，膽紅素具有抗氧化作用，其水平可能與機(jī)體氧化應(yīng)激水平呈負(fù)相關(guān)，可降低腦血管病的發(fā)病風(fēng)險［18］。膽紅素代謝途徑如下：血紅蛋白分解為脂溶性的IBIL，后者與清蛋白結(jié)合，在血液中運(yùn)輸；少于0.01%的膽紅素以游離膽紅素形式存在；IBIL在肝細(xì)胞內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1的催化下轉(zhuǎn)化為水溶性膽紅素［19］，即DBIL，大部分DBIL通過膽道系統(tǒng)排出，小部分DBIL水解為非結(jié)合膽紅素，即IBIL，進(jìn)入腸肝循環(huán)。膽紅素-清蛋白復(fù)合物不能自由通過各種生物膜，降低了其對細(xì)胞的影響。膽紅素在肝臟中的結(jié)合反應(yīng)使得膽紅素水溶性增加，利于代謝排出。游離膽紅素水平影響其向組織細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此膽紅素對于人體有益還是有害主要取決于游離膽紅素水平［20］。游離膽紅素水平不穩(wěn)定且難以測定，故采用IBIL水平代替。因此本研究重點(diǎn)探討了IBIL對動脈粥樣硬化的作用。血液中游離膽紅素水平受多種因素影響，血清清蛋白水平是游離膽紅素水平的影響因素之一［21］，其可影響膽紅素的清除和對機(jī)體的作用。在本研究中，調(diào)整人群血清清蛋白水平后，TBIL和IBIL對于頸動脈粥樣硬化仍具有保護(hù)作用。

動脈粥樣硬化的典型特征是動脈壁的慢性炎性狀態(tài)，脂質(zhì)和炎性細(xì)胞的逐漸積累導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、動脈壁發(fā)生動脈粥樣硬化［22］。而膽紅素可通過抗氧化、抗感染、免疫調(diào)節(jié)和阻斷細(xì)胞間黏附作用，以延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展［20，23-24］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族是體內(nèi)最重要的活性氧來源，可能參與氧化應(yīng)激介導(dǎo)的端粒縮短［25］，這一途徑可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。而膽紅素是一種強(qiáng)大的線粒體超氧化物抑制劑，通過膽紅素加氧酶抑制NADPH氧化酶活性［26］，從而減少體內(nèi)超氧化物的產(chǎn)生。膽紅素還能清除過多的活性氧，減少自由基誘導(dǎo)的脂蛋白氧化修飾［27］。膽紅素通過抑制補(bǔ)體誘導(dǎo)［28］及阻斷促炎細(xì)胞因子［24］的產(chǎn)生來影響機(jī)體的炎性反應(yīng)途徑。在動脈粥樣硬化形成過程中，內(nèi)皮環(huán)境的改變導(dǎo)致黏附分子表達(dá)增加，觸發(fā)免疫細(xì)胞遷移到動脈壁［29］。研究表明，IBIL可防止腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的細(xì)胞間黏附分子蛋白的過度表達(dá)，從而抑制免疫細(xì)胞向動脈內(nèi)膜遷移，限制炎性反應(yīng)，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展［23］。這為高膽紅素血癥個體預(yù)防動脈粥樣硬化提供了理論依據(jù)。

本研究的局限性：隊列數(shù)據(jù)中缺乏膳食、運(yùn)動、調(diào)脂藥物使用、糖尿病患者血糖控制情況、是否使用胰島素等信息，所以未能校正上述混雜因素，可能使膽紅素對動脈粥樣硬化進(jìn)展影響的估計受影響；同時，本研究人群僅源于石家莊地區(qū)，且為回顧性隊列研究，亟待今后開展多中心、前瞻性隊列研究。

綜上所述，膽紅素是動脈粥樣硬化進(jìn)展的影響因素，TBIL和IBIL水平每升高1個標(biāo)準(zhǔn)差，頸動脈粥樣硬化進(jìn)展的風(fēng)險分別下降6.6%和17.4%。膽紅素在不同性別、年齡、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒特征人群中對頸動脈粥樣硬化的影響無差異。本研究對臨床醫(yī)師早期預(yù)防和治療動脈粥樣硬化性疾病有一定的借鑒意義。

作者貢獻(xiàn)：秦璐負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計、論文撰寫；秦璐、谷永勝、王賀波負(fù)責(zé)研究的實施與可行性分析、結(jié)果的分析與解釋；秦璐、谷永勝、李琳、張凱華負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集；秦璐、谷永勝、李琳、張凱華、姚文濤負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理；秦璐、谷永勝負(fù)責(zé)統(tǒng)計學(xué)處理；秦璐、吳宗鍇、何偉亮、王賀波負(fù)責(zé)論文的修訂；秦璐、牛小莉、李俐濤負(fù)責(zé)英文的修訂；王賀波負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。