胃癌相關(guān)基因與免疫生物標(biāo)志物關(guān)系和作用機制的研究進(jìn)展

史敏慧，張慧，姜達(dá)

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊 050011

近年來，胃癌綜合治療發(fā)展迅速，尤其是在免疫治療方面取得了重大進(jìn)展。CheckMate-649是迄今為止在胃癌及食管腺癌領(lǐng)域開展的規(guī)模最大的Ⅲ期臨床試驗，旨在評估與單獨化療相比，納武利尤單抗聯(lián)合化療一線治療人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性、晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌、胃食管連接部癌或食管腺癌患者的療效，結(jié)果證實，納武利尤單抗聯(lián)合化療可顯著延長患者的總生存期（overall survival，OS）和無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）[1]。HER2陽性胃癌是一類特殊類型的胃癌，KEYNOTE-811研究是一項評價帕博利珠單抗聯(lián)合曲妥珠單抗+化療治療HER2陽性轉(zhuǎn)移性胃或胃食管交界處癌的Ⅲ期隨機對照臨床試驗，結(jié)果顯示，在曲妥珠單抗聯(lián)合化療的基礎(chǔ)上加入帕博利珠單抗，患者的客觀緩解率（objective response rate，ORR）提高了22.7%[2]?；谶@一結(jié)果，美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)了帕博利珠單抗用于HER2陽性晚期胃及胃食管交界處腺癌的一線治療。

隨著胃癌一線治療領(lǐng)域的突破，胃癌進(jìn)入免疫治療時代。既往研究表明，具有程序性死亡受體配 體1（programmed celldeath 1ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）高表達(dá)、高腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden-high，TMB-H）、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability-high，MSI-H）或錯配修復(fù)缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）等特征的胃癌患者對免疫治療有較高的敏感性和應(yīng)答率，上述指標(biāo)可以作為預(yù)測胃癌免疫治療療效的生物標(biāo)志物[3]。胃癌組織中部分基因的變異可能與以上指標(biāo)有關(guān)，可能是預(yù)測免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）治療療效的潛在因素，胃癌細(xì)胞中各基因與部分生物標(biāo)志物的關(guān)系見表1。

表1 胃癌各基因與部分經(jīng)典免疫生物標(biāo)志物的關(guān)系

1 AT豐富結(jié)合域 1 A基因（AT-rich interaction domain 1 A，ARID 1 A）

ARID1A為抑癌基因，定位于染色體1p35.3，是染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWI/SNF的重要亞基。ARID1A基因可以通過促進(jìn)DNA損傷和錯配修復(fù)來維持基因組的穩(wěn)定性。此外，ARID1A功能缺失還會引起端粒內(nèi)聚亞基基質(zhì)抗原1（stromal antigen 1，STAG1）的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂期間端粒的缺陷及染色體畸變[4]。

1.1 ARID 1 A突變/缺失與PD-L 1高表達(dá)的關(guān)系

ARID1A缺失可以通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路上調(diào)PD-L1的表達(dá)。有研究選取159例胃癌患者手術(shù)的組織切片，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對5個準(zhǔn)單型單核苷酸（NR24、NR21、BAT25、BAT26、MONO27）進(jìn)行重復(fù)標(biāo)記，其中＜2個等位基因變異被認(rèn)為是微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS），≥2個等位基因變異判定為MSI-H[5]。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對MSS腫瘤來說，PD-L1陽性與ARID1A表達(dá)缺失相關(guān)（P=0.040）。在MSI-H腫瘤中，76.5%（13/17）的ARID1A缺失患者PD-L1表達(dá)陽性，而27.6%（8/29）的ARID1A保留患者PD-L1表達(dá)陽性[5]。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析發(fā)現(xiàn)，ARID1A突變胃癌患者（n=265）中PD-L1mRNA相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）[5]。

1.2 ARID 1 A突變/缺失與MSI-H/dMMR的關(guān)系

ARID1A可以與錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）系統(tǒng)的 MutS同系物 2（MutS homolog 2，MSH2）相互作用，在DNA復(fù)制時召集MSH2發(fā)揮MMR功能，因此，ARID1A基因突變或蛋白表達(dá)缺失均與胃癌dMMR相關(guān)。一項研究采用免疫組化法檢測417例胃癌患者胃癌組織中ARID1A及MMR蛋白的表達(dá)情況，并評估MSI狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，21.1%（88/417）的胃癌患者胃癌組織中存在ARID1A蛋白表達(dá)缺失，且ARID1A蛋白缺失與MMR蛋白缺失及MSI-H均明顯相關(guān)（P＜0.05）[6]。

1.3 ARID 1 A突變/缺失與TMB-H的關(guān)系

ARID1A可以與DNA損傷檢查點激酶共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3 related，ATR）相互作用而被招募到DNA雙鏈斷裂處，促進(jìn)DNA雙鏈斷裂轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂溎┒?，維持DNA損傷應(yīng)答信號。因此，ARID1A突變或表達(dá)缺失時，DNA損傷修復(fù)能力下降、基因組穩(wěn)定性下降、腫瘤的TMB升高。一項國內(nèi)研究回顧了2504例接受根治性胃切除術(shù)的胃腺癌患者的病歷資料發(fā)現(xiàn)，高TMB的胃癌患者中，ARID1A基因突變率高達(dá)74.42%[7]。ARID1A突變與TMB-H的相關(guān)性在其他惡性腫瘤中也被證實[8-9]。

由此可見，ARID1A突變導(dǎo)致其蛋白表達(dá)缺失、功能喪失，從而影響PD-L1水平，但該關(guān)系并不穩(wěn)定，可能與ARID1A的突變類型、突變豐度及其他通路的基因有關(guān)。ARID1A基因變異與dMMR/MSI-H呈正相關(guān)，且在基因和蛋白雙水平上均一致。此外，ARID1A的變異與TMB-H關(guān)系密切，這與其作用機制密切相關(guān)。

2 趨化素樣因子超家族成員 6（chemokine-like factor super family 6，CMTM 6）

CMTM6基因位于3號染色體p22區(qū)，其表達(dá)缺失會降低腫瘤特異性T細(xì)胞的活性并引起腫瘤免疫逃逸；此外，CMTM6還可能直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖，也可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究顯示，胃癌組織中CMTM6的表達(dá)與PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.260，P＜0.01）[10]。CMTM6具有調(diào)節(jié)跨膜轉(zhuǎn)運和蛋白分泌的能力，CMTM6蛋白與PD-L1特異性結(jié)合可使PD-L1/CMTM6蛋白復(fù)合體在內(nèi)含體中再循環(huán)，從而保護(hù)PD-L1不被溶酶體識別并降解，以維持PD-L1的高表達(dá)。在用35S-半胱氨酸/蛋氨酸進(jìn)行脈沖標(biāo)記的CMTM6敲除細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CMTM6缺失會導(dǎo)致PD-L1蛋白迅速降解并抑制其表達(dá)[11]。此外，CMTM6與E3泛素連接酶STUB1可能存在某種調(diào)節(jié)機制，在腫瘤細(xì)胞中抑制PD-L1的泛素化修飾，抑制其降解。CMTM6基因通過間接途徑影響PD-L1的表達(dá)，其可能對ICI的靶點及治療療效產(chǎn)生影響。

3 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 1（metastasis associated in colon cancer 1，MACC 1）

MACC1基因位于第7號染色體7p21.1上，是肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/肝細(xì)胞生長因子受體c-met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。MACC1可與c-met啟動子區(qū)SP1結(jié)合位點結(jié)合，啟動c-met的轉(zhuǎn)錄，提高HGF/c-met信號通路的活性，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。此外，MACC1可通過上調(diào)細(xì)胞外血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）C/D的分泌促進(jìn)胃癌淋巴血管生成。一項胃癌的薈萃分析顯示，MACC1過表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（OR=4.68，95%CI：1.98～11.06，P＜0.01）和血管侵犯（OR=1.63，95%CI：1.11～2.38，P=0.014）有關(guān)[12]。與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中MACC1、c-met和PD-L1的表達(dá)水平更高，下調(diào)MACC1的表達(dá)可以抑制c-met和PD-L1的表達(dá)；體外實驗還發(fā)現(xiàn)，c-met/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistictargetofrapamycin kinase，MTOR）通路抑制劑（SU11274、MK2206和雷帕霉素）可顯著抑制c-met、AKT和MTOR的磷酸化，從而抑制MACC1對PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)[13]。

MACC1除直接調(diào)節(jié)HGF/c-met通路而影響細(xì)胞增殖、分裂、遷移等活動外，還能間接對PI3K/AKT/MTOR通路產(chǎn)生影響。因此，MACC1的變異可能不止與免疫生物標(biāo)志物相關(guān)，也可能與胃癌的其他治療手段、免疫治療療效存在一定的關(guān)系。結(jié)直腸癌的研究中，MACC1的表達(dá)不受MMR狀態(tài)的影響[14]，但由于dMMR的病例數(shù)相對較少，MACC1與dMMR之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步驗證。

4 黏蛋白16（mucin 16，MUC16）

MUC16基因位于染色體19p13.2，其胞外部分經(jīng)蛋白酶酶切后脫離細(xì)胞膜，進(jìn)入血清或細(xì)胞外即為糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125），且MUC16的胞外段被酶切后，其胞內(nèi)段仍在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。MUC16可以通過JAK2激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3），增強胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力。

4.1 MUC16突變與TMB-H相關(guān)

一項研究分析了TCGA隊列的437份胃癌組織樣本和亞洲隊列的256份樣本，結(jié)果顯示，MUC16突變與更高的TMB相關(guān)，在控制了DNA聚合酶ε（DNA polymerase epsilon，POLE）突變及乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）1/2突變等因素后，這種關(guān)系仍然差異有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.87，95%CI：1.49～2.36，P＜0.01）[15]。上述結(jié)論在泛癌種的相關(guān)研究中同樣成立，且在大多數(shù)實體腫瘤中均存在差異（30種腫瘤中的25種）[16]，但MUC16突變與腫瘤較高的TMB間的關(guān)聯(lián)機制仍不清楚。

4.2 MUC16突變可能與PD-L 1的表達(dá)有關(guān)

在泛癌種的研究中發(fā)現(xiàn)，MUC16突變腫瘤患者的特點之一為多種免疫抑制分子的表達(dá)增強，如PD-L1、程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA4）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG3）等[16]，但此研究并未對各個腫瘤進(jìn)行具體分析。另一項針對黑色素瘤的研究同樣得出了相同結(jié)論[17]。提示MUC16突變可能與PD-L1、PD-1、CTLA4等的表達(dá)相關(guān)，但需要在未來進(jìn)一步研究，提示MUC16突變的腫瘤患者對抗PD-1/PD-L1治療存在潛在的適應(yīng)性免疫抵抗，對臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。

由此可見，MUC16突變腫瘤患者的腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞顯著高富集，且患者體內(nèi)γ干擾素和T細(xì)胞炎癥信號的富集程度也較高，這些免疫特征與ICI的治療獲益相關(guān)[16-17]。進(jìn)一步對接受抗PD-1/PD-L1治療的非小細(xì)胞肺癌患者和抗CTLA4治療的黑色素瘤患者的隊列分析發(fā)現(xiàn)，MUC16突變與患者的總生存期改善和免疫治療高應(yīng)答率相關(guān)[16]。這為MUC16突變胃癌患者的免疫治療可能獲益提供了有力證據(jù)。

5 HER 2基因

HER2基因是酪氨酸激酶受體家族成員，由位于17q染色體上的erbB-2原癌基因編碼，能夠抗細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，HER2基因還可上調(diào)VEGF或血管通透因子的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤新生血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

既往研究對HER2與PD-L1表達(dá)關(guān)系的研究結(jié)果并不一致。Oki等[18]的研究結(jié)果顯示，免疫組化法檢測HER2（+++）的胃癌患者中，72.4%（14/19）的患者胃癌組織中存在PD-L1過表達(dá)，且通過siRNA干擾HER2蛋白的表達(dá)可下調(diào)胃癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。Suh等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，與HER2陰性表達(dá)的胃癌患者相比，HER2陽性表達(dá)（+++）患者胃癌組織中PD-L1的過表達(dá)更多見（PD-L1≥10%，免疫組化結(jié)果計為陽性）。還有研究表明，阻斷HER2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中PI3K/AKT/MTOR通路，可抑制HER2基因擴(kuò)增胃癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。但有些研究則顯示了與前述研究相反的結(jié)論[20-21]。表明免疫治療對HER2陰性胃癌患者可能更有效，而HER2陽性患者免疫治療聯(lián)合抗HER2治療可能有效。有研究證明了PD-1單抗聯(lián)合抗HER2治療胃癌存在協(xié)同作用，曲妥珠單抗可以刺激HER2特異性的T細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，而PD-1單抗可以增強曲妥珠單抗的T細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)[22]。還有研究發(fā)現(xiàn)，抗HER2治療后，可以下調(diào)CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL21、VEGF和CXC趨化因子配體1（CX-C chemokine ligand 1，CXCL1）等細(xì)胞因子的釋放，改善腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性因素[23]，從而間接與PD-1單抗發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。KEYNOTE-811研究結(jié)果則肯定了免疫治療在局部晚期不可切除或轉(zhuǎn)移性HER2陽性胃癌或胃食管結(jié)合部腺癌患者一線治療中的作用[24]。

KEYNOTE-811研究納入的患者中近90%存在PD-L1聯(lián)合陽性分?jǐn)?shù)（combined positive score，CPS）≥1，且HER2陽性以免疫組化（+++）為主[2]，故考慮HER2與PD-L1的表達(dá)可能存在一致性。但相關(guān)研究未應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測，亦未考察所有患者的HER2基因擴(kuò)增、突變情況，仍需進(jìn)一步研究PD-L1與HER2間的相關(guān)性。一項對HER2蛋白陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的研究表明，乳腺癌中HER2蛋白表達(dá)陽性會帶來更高的TMB[25]，但胃癌中尚未見此種報道。

6 鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）

KRAS基因是RAS家族的成員，位于12號染色體，與腫瘤血管生成、增殖、遷移均有關(guān)。KRAS基因容易發(fā)生突變，使細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。

6.1 KRAS突變可能與PD-L 1高表達(dá)有關(guān)

在膠質(zhì)瘤或肺癌中，磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）缺失、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）或KRAS突變均可能上調(diào)PD-L1的表達(dá)。一項研究對30個PD-L1陽性胃癌樣本進(jìn)行KRAS突變檢測，將腫瘤細(xì)胞PD-L1膜染色超過5%被判定為陽性，并確定表達(dá)強度（1+、2+、3+）和相應(yīng)比例（0%～100%），H評分=1×（細(xì)胞染色1+的百分?jǐn)?shù)）+2×（細(xì)胞染色2+的百分?jǐn)?shù)）+3×（細(xì)胞染色3+的百分?jǐn)?shù)），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3例患者呈高PD-L1表達(dá)（H評分≥150）的MSI-H患者均存在KRAS突變并伴有ARID1A缺失；另外2例KRAS突變患者均保留了ARID1A表達(dá)，PD-L1表達(dá)相對較低（H評分＜50）[5]。表明KRAS突變和ARID1A缺失可能在促進(jìn)腫瘤PD-L1表達(dá)上有協(xié)同效應(yīng)。

6.2 KRAS突變與MSI-H的關(guān)系

研究顯示，胃癌患者中KRAS突變與MSI狀態(tài)密切相關(guān)[26-27]。一項研究分析了595例術(shù)前未接受治療的胃癌患者術(shù)后的腫瘤組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，24例患者存在KRAS突變，其中18例為MSI-H；且KRAS突變MSI-H患者的年齡較大、多為女性，中位生存期優(yōu)于KRAS野生型患者（108個月vs85個月），但KRAS突變伴MSS患者的預(yù)后較差（P＜0.01）[27]。

由此可見，KRAS基因突變可能會激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，在對惡性黑色素瘤及非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MAPK通路激活可上調(diào)PD-L1的表達(dá)，化療藥物也會對此過程造成干擾[28]，但該研究缺乏對RAS基因變異的描述。因此，若想明確KRAS或RAS基因?qū)D-L1表達(dá)的影響，還應(yīng)考察該基因的變異類型及患者的既往用藥史。一項對肺腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，與KRAS野生型相比，KRAS突變患者的TMB更高[29]。但對腸癌的研究結(jié)果則相反，TMB-H的腫瘤患者比低腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden-low，TMB-L）患者表現(xiàn)出更低的KRAS突變率[30]，且影響KRAS突變的因素有很多，不能單純推斷與TMB有關(guān)，尚需進(jìn)一步探索。KRAS與MSI雖然存在一定的關(guān)系，但對預(yù)后的影響卻相反，其原因可能與其他基因、通路變異有關(guān)。

7 磷脂酰肌醇- 4， 5二磷酸 3-激酶催化亞單位 α（phosphatidylinositol- 4, 5-bisphos-phate 3-kinase catalyticsubunit α，PIK 3CA）

PIK3CA是PI3K/AKT/MTOR通路重要的調(diào)節(jié)因子。根據(jù)TCGA的研究結(jié)果顯示，EB病毒陽性胃癌患者的PIK3CA突變率較高（約80%），且PIK3CA突變可能先于EB病毒感染，機體感染后通過病毒潛伏膜蛋白2A（1atent membrane protein 2A，LMP2A）強化事先突變的PIK3CA功能以激活PI3K/AKT通路，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[31]。在EB病毒陽性和MSI-H的胃癌患者中，PIK3CA的突變率較高，這些特殊的胃癌亞型可能獲得更好的免疫治療療效[32]。研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA、TP53突變與PD-1、PD-L1和PD-L2的表達(dá)有關(guān)（P＜0.01），考慮PIK3CA突變可以改變所有PD基因的表達(dá)[33]。PIK3CA基因突變與MSI及PD-L1的關(guān)系受到PI3K/AKT/MTOR通路作用的影響，但因為影響該通路的因素較多，其具體的作用機制尚不能完全明確。此外，PIK3CA基因擴(kuò)增可能與CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）密度明顯降低有關(guān)，從而對PD-L1的表達(dá)產(chǎn)生影響，但對TMB的影響不大[34]。而有關(guān)TP53對胃癌免疫治療療效的影響及作用機制尚不能明確。

8 小結(jié)與展望

上述與免疫生物標(biāo)志物PD-L1、TMB、MSI/MMR有關(guān)的胃癌基因中，大部分研究所觀察的指標(biāo)為該基因的蛋白表達(dá)水平，缺乏明確的基因變異與免疫生物標(biāo)志物的相關(guān)性研究證據(jù)。同時，以上結(jié)論多來自臨床前研究，尚需大規(guī)模臨床研究結(jié)果的證明及支持才能將其應(yīng)用于臨床。此外，本文僅綜述了該基因與免疫標(biāo)志物間的關(guān)系，沒有充分的證據(jù)表明其與免疫治療療效存在直接的關(guān)系，且真實世界及部分臨床研究顯示PD-L1、TMB、MSI/MMR也不能全面地預(yù)測ICI的治療療效，影響因素很多。因此，尋求精準(zhǔn)預(yù)測指標(biāo)，篩選優(yōu)勢人群仍是今后免疫治療的重點。