SNP rs951781影響食管癌患者的術(shù)后生存

孫 琳，宋 昕，魏夢(mèng)霞，趙學(xué)科，徐瑞華，李 貝，范宗民，韓雪娜，陳亞杰，鐘 侃，喬佳欣，馬琳琳，謝葉真，王立東

食管癌(esophageal cancer,EC)是世界上排名第六的惡性腫瘤。在中國(guó)，食管癌發(fā)病率居第六位，死亡率居第四位，預(yù)后差，中晚期EC的5 a生存率僅為15%～25%[1-3]。但EC至今缺乏較高敏感性和特異性的早期篩查和診斷方法。本研究團(tuán)隊(duì)在60 a的食管癌研究過(guò)程中已建立50萬(wàn)例跨度47 a(1973 年至 2019年)的食管癌和賁門(mén)癌患者隨訪的臨床診療、病理信息大數(shù)據(jù)庫(kù)和大樣本庫(kù)。全基因組外顯子測(cè)序(whole exome sequence，WES)技術(shù)用于分析個(gè)體的全基因組DNA外顯子序列，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域。相比于全基因組測(cè)序，WES周期短、成本低、深度高，可以檢測(cè)到比全基因組測(cè)序更多的低頻和罕見(jiàn)突變，從而可以分析大量的樣本[4-6]。表達(dá)數(shù)量性狀基因座(expression quantitative trait loci,eQTL)分析方法是將不同基因型個(gè)體的基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為數(shù)量性狀，分析基因型對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響。eQTL作用可根據(jù)遺傳變異位點(diǎn)與靶基因的相對(duì)位置分為順式(cis)和反式(trans)[7]。本研究旨在采用WES測(cè)序和eQTL的方法對(duì)食管癌患者癌組織和癌旁組織不同單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)基因型進(jìn)行對(duì)比分析，為臨床食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和早期診斷提供分子基礎(chǔ)，揭示分子基礎(chǔ)及環(huán)境和遺傳因素交互作用對(duì)食管癌發(fā)生的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

1.1.1 研究對(duì)象的采集共收集來(lái)自高發(fā)地區(qū)醫(yī)院的199位食管癌患者的癌組織和癌旁組織。所用組織樣品均為新鮮組織樣本，在手術(shù)切除后30 min內(nèi)剝離，-80 ℃保存。癌旁正常組織選取距腫瘤邊緣至少2 cm遠(yuǎn)的鄰近上皮正常組織(生殖系對(duì)照)?；颊咴谌虢M前未接受放化療等其他治療，排除圍手術(shù)期內(nèi)吻合口瘺死亡的患者。所有患者都簽署了獨(dú)立的知情同意書(shū)，用于取樣和分子分析，并已獲得了相關(guān)機(jī)構(gòu)的審查和批準(zhǔn)。本研究主要通過(guò)電話、家訪和村醫(yī)與患者或患者家屬直接聯(lián)系，或通過(guò)新合作醫(yī)療數(shù)據(jù)庫(kù)、醫(yī)療保障局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)和公民死亡信息登記管理等系統(tǒng)查詢方式進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，記錄去世時(shí)間和主要死因等。

1.1.2 組織樣本的制備將199例食管癌患者的癌組織和癌旁組織配對(duì)，分裝到已經(jīng)標(biāo)記的凍存管內(nèi)，樣本編號(hào)為001～199號(hào)。在樣本類(lèi)型中，食管癌組織用字母T標(biāo)記(Tumor)，癌旁正常組織用字母N標(biāo)記(Normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時(shí)保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.2 WES測(cè)序SNP分析

1.2.1 DNA樣品檢測(cè)利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白、RNA污染及其降解程度。用Nanodrop2000(Thermo，美國(guó))檢測(cè)DNA的純度，并用Qubit 3.0測(cè)出DNA樣品濃度，選擇0.6 μg以上的DNA樣品進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)。

1.2.2 建庫(kù)捕獲及上機(jī)測(cè)序采用Agilent液相芯片捕獲系統(tǒng)，對(duì)患者全外顯子區(qū)的DNA進(jìn)行富集，基因組DNA經(jīng)破碎儀隨機(jī)打斷成片段，采用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進(jìn)行建庫(kù)及捕獲。后在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制高通量測(cè)序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后形成原始Raw Data測(cè)序序列。將原始Raw Data數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，并且控制平均堿基位置測(cè)序錯(cuò)誤率低于0.1%，樣本的測(cè)序reads達(dá)到95%以上的比對(duì)率，且堿基覆蓋深度達(dá)到10×以上時(shí)該點(diǎn)檢測(cè)的SNP比較可信。

1.2.4 SNP檢測(cè)和功能注釋使用bcftools軟件識(shí)別SNP，并利用ANNOVAR軟件對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析與鑒定

采用液相色譜—質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù)對(duì)199例食管癌的癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行分析。

1.4 eQTL分析

利用199例食管癌患者的基因型分型數(shù)據(jù)以及癌組織和癌旁組織的全基因組外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行eQTL分析，根據(jù)SNP位點(diǎn)(即單個(gè)DNA突變的位點(diǎn))到基因的距離，eQTL可分為順式作用(cis-eQTL)和反式作用(trans-eQTL)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。高發(fā)區(qū)癌組織與癌旁組織的SNP影響蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生采用雙重線性回歸檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier方法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 全基因組外顯子測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)199例食管癌患者癌組織和癌旁組織的WES分析，NES基因rs951781位點(diǎn)的SNP分型：①野生型純合子CC型158例，占79.40%；②突變型雜合子CT型37例，占18.60%；③突變型純合子TT型4例，占2.01%。

2.2 NES基因rs951781位點(diǎn)不同基因型食管癌患者生存率比較

對(duì)199例食管癌患者3種基因型的生存期進(jìn)行比較，不同基因型食管癌患者的生存之間存在顯著性差異(P=0.018)。CC型的生存率最差，TT型的生存率最高，生存曲線如圖2所示，對(duì)野生型純合子CC型、突變型雜合子CT型、突變型純合子TT型的0.5、1、1.5 a生存率進(jìn)行比較。

圖2 NES 3種基因型生存曲線(n=199)

2.3 eQTL分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)199例食管癌患者癌組織和癌旁組織進(jìn)行eQTL分析，發(fā)現(xiàn) ACTB的表達(dá)量與NES基因rs951871位點(diǎn)變異存在關(guān)聯(lián)性(P<0.001)。NES基因rs951871位點(diǎn)對(duì)ACTB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平有trans-eQTL效應(yīng)，可下調(diào)ACTB蛋白的表達(dá)水平(beta=-0.43)，將野生型純合子CC型賦值為0，突變型雜合子CT型賦值為1，突變型純合子TT型賦值為2。其中，NES基因rs951871位點(diǎn)的突變型純合子TT型蛋白表達(dá)量最低，突變型雜合子CT型次之。見(jiàn)圖3。

圖3 NES 3種基因型對(duì)ACTB表達(dá)量的影響

3 討論

食管癌的發(fā)生與環(huán)境和遺傳因素密切相關(guān)。吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒感染等環(huán)境因素暴露個(gè)體并非均患有食管癌，遺傳因素在食管癌發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用[8]。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)100個(gè)基因含有罕見(jiàn)的易感等位基因，且與食管癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[9-14]。

NES-rs951871位點(diǎn)SNP與食管癌的相關(guān)研究相對(duì)較少。本研究結(jié)果顯示，NES-rs951871位點(diǎn)的基因型與食管癌患者預(yù)后生存期有關(guān)，不同基因型食管癌患者的生存之間存在顯著差異(P=0.018)。突變型純合子TT型的生存率最好，TT基因型患者0.5、1、1.5 a生存率均高于CC基因型和CT基因型，說(shuō)明NES-rs951871位點(diǎn)TT基因型患者預(yù)后優(yōu)于CC、CT基因型患者，推測(cè)NES-rs951871位點(diǎn)突變的食管癌患者預(yù)后較好，提示 NES-rs951871位點(diǎn)與食管癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，可能是預(yù)測(cè)食管癌患者生存期的生物標(biāo)志物，為評(píng)估患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

NES基因rs951871位點(diǎn)的多態(tài)性可顯著影響食管癌患者癌組織和癌旁組織中的β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)蛋白水平，NES基因rs951871位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因T的劑量每增加1，受調(diào)控的ACTB蛋白表達(dá)量下調(diào)0.43個(gè)單位。ACTB是一種高度保守的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白，多年來(lái)一直被認(rèn)為是一種常見(jiàn)的看家基因，并被用作參考基因[15]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明ACTB在肺癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤，結(jié)直腸癌等多種癌癥中表達(dá)水平較高[16-19]，也有免疫相關(guān)結(jié)果表明ACTB在調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮特定作用，異常的ACTB表達(dá)可能會(huì)改變腫瘤免疫微環(huán)境，從而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。故推測(cè)NES-rs951871位點(diǎn)為功能性SNP，其多態(tài)性可能影響了與該段DNA序列相互作用的反式作用因子的結(jié)合能力，從而影響ACTB蛋白的表達(dá)，進(jìn)而最終影響了食管癌的發(fā)生發(fā)展。但NES-rs951871的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。