1-MCP處理對(duì)早酥梨衰老的影響

張海霞

（武威職業(yè)學(xué)院，甘肅 武威 733000）

早酥梨作為西北地區(qū)主栽產(chǎn)品之一，成熟于8月中旬，果形美觀，果皮翠綠、光滑，肉質(zhì)細(xì)嫩，風(fēng)味好，水分多，品質(zhì)上乘[1-2]，深受消費(fèi)者歡迎。其主要銷售市場(chǎng)在廣州、福建等南方地區(qū)，在市場(chǎng)上具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。但上市時(shí)正值酷暑高溫，果實(shí)呼吸作用強(qiáng)，容易造成果皮發(fā)黃、肉質(zhì)變軟，失去了原有的商品性狀，使貨架期大大縮短，令種植戶和銷售商遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，解決早酥梨的生理衰老問題對(duì)于推進(jìn)優(yōu)質(zhì)梨基地的產(chǎn)業(yè)化、提高經(jīng)濟(jì)效益有重要意義。

乙烯是成熟衰老激素[4]，在果蔬貯藏過程中，乙烯能促進(jìn)果蔬的成熟衰老。近幾年來，人們?cè)趯で蟾行У目挂蚁┥碜饔玫幕瘜W(xué)物質(zhì)的方面，發(fā)現(xiàn)有一些環(huán)丙烯化合物能夠和乙烯受體發(fā)生不可逆結(jié)合，進(jìn)而對(duì)乙烯效應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，如CP（亞甲基環(huán)丙烯）、3，3-DMCP（3，3-二甲基環(huán)丙烯）、1-MCP（1-甲基環(huán)丙烯）和3-MCP（3-甲基環(huán)丙烯），其中1-MCP的效果最佳，它具有無毒、穩(wěn)定、使用濃度低等特點(diǎn)。

1-MCP屬于乙烯競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，不僅可以阻止受體與乙烯的正常結(jié)合，還能與乙烯受體進(jìn)行不可逆結(jié)合，從而阻礙乙烯信號(hào)傳導(dǎo)，起到延緩成熟的作用，能夠明顯延長(zhǎng)呼吸躍變型果實(shí)的貯藏期和貨架期。國(guó)內(nèi)外對(duì)它的研究多地集中在花卉和果品上，并取得了一些較理想的結(jié)果。汪俏梅、郭得平等在青花菜的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1-MCP處理的青花菜其貯藏期間的MDA含量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而CAT和SOD兩者的活性在不斷增大，說明1-MCP處理可以對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)而使青花菜的衰老得以延緩[5]。白華飛，楊曉棠等用1-MCP處理青棗，發(fā)現(xiàn)1-MCP能夠有效減緩果實(shí)膜透性的增大，丙二醛含量遠(yuǎn)低于對(duì)照，并提高了青棗SOD、POD的活性[6]。李敏等用0.25μl/L 1-MCP處理臺(tái)農(nóng)果實(shí)，不僅能夠使果實(shí)失重率降低，可滴定酸含量的下降推遲，還能夠抑制PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的增加，從而延緩果實(shí)的后熟作用[7]。高敏和張繼澍的研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理能夠明顯抑制SOD（超氧化物歧化酶）和POD（過氧化物酶）活性在前期的上升和后期的下降[8]。

目前，關(guān)于1-MCP在水果貯藏保鮮上應(yīng)用的研究報(bào)道不少，但尚未見到將1-MCP應(yīng)用于早酥梨抗氧化酶的研究。本研究以早酥梨為材料，用不同濃度的1-MCP處理果實(shí)，研究常溫貯藏期間果實(shí)黃化、丙二醛含量、細(xì)胞膜透性及三種抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的變化，為早酥梨采后衰老的控制提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

早酥梨采收自甘肅景泰縣條山農(nóng)場(chǎng)一個(gè)管理良好的盛果期果園，8月中旬采摘，選擇無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小均勻的果實(shí)進(jìn)行套袋裝箱，并于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。試驗(yàn)試劑：1-MCP（1-甲基環(huán)丙烯，商品名：安喜培），片劑（由臺(tái)灣利統(tǒng)公司生產(chǎn)）。

1.2 材料處理方法

準(zhǔn)確稱取0.5 g、1.0 g、1.5 g的1-MCP分別置于3個(gè)小燒杯中，分別與待處理的果品同置于1 m3的塑料帳中，向燒杯中分別加入15 mL、30 mL和45 mL的蒸餾水并立即密封帳子，使帳內(nèi)氣體濃度分別達(dá)到0.5μl/L、1.0μl/L、1.5μl/L，常溫密閉熏蒸12 h，待熏蒸結(jié)束，即刻將果實(shí)裝進(jìn)紙箱于常溫下貯藏。對(duì)照組果實(shí)以空氣中密閉12 h后裝入紙箱同樣于常溫下貯藏。每處理用果40個(gè)，重復(fù)試驗(yàn)3次，定期（0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d）取樣測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)測(cè)定方法

1.3.1 果皮黃化指數(shù)的評(píng)估

將黃化指數(shù)分為4級(jí)，即果皮全綠（1級(jí)）、果皮綠微黃（2級(jí)）、果皮淺黃（3級(jí)）、果皮全黃（4級(jí)），如果黃化指數(shù)大于等于3級(jí)，則認(rèn)為其已經(jīng)到達(dá)了貨架末期。在常溫放置期間，通過視覺感官評(píng)定方法對(duì)早酥梨的黃化指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。

1.3.2 組織膜透性的測(cè)定

參照張昭其等[9]方法并修改。在5個(gè)果實(shí)相同部位切取1 mm厚的薄片組織15片，用無離子水沖洗3次后用濾紙吸干組織表面水分，再放入燒杯中加入40 mL無離子水，采用電導(dǎo)儀測(cè)定初始及3 h后的電導(dǎo)率，測(cè)定溫度為25℃，然后將燒杯放入95℃的水浴箱中進(jìn)行水浴，水浴30 min測(cè)定最終電導(dǎo)率，計(jì)算細(xì)胞膜完整率，見公式（1）。

1.3.3 MDA（丙二醛含量）測(cè)定

參照Hodgesetal[10]方法。用紫外分光光度計(jì)（導(dǎo)津UV-2450）測(cè)出反應(yīng)液在450 nm、532 nm和600 nm三處的吸光度值，再運(yùn)用公式計(jì)算反應(yīng)液中MDA的濃度（CMDA）和果實(shí)樣品中MDA的含量（nmol?g FW-1）。計(jì)算公示如下：

1.3.4 POD（過氧化物酶）活性測(cè)定

參考李合生[11]方法。將3 g果肉組織放入研缽中，加3 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L、pH5.9的磷酸緩沖液，每100 mL中加入PVP0.5 g）和石英砂少許，在冰浴條件下快速研磨至勻漿，再在4℃的條件下以8 000 r/min離心20 min，獲得上清液，即酶粗提液。測(cè)定POD活性時(shí)，分別取1.8 mL愈創(chuàng)木酚（0.05 mol/L）、30μl經(jīng)稀釋的酶液（50μl酶液加150μl磷酸緩沖液）和100μl H2O22%進(jìn)行混合，混勻后于470 nm波長(zhǎng)下比色，每隔1 min記錄1次吸光度，共記錄3次。以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位（u）。見公式（4）。

式中：△A470——反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W——果實(shí)鮮質(zhì)量，g；t——反應(yīng)時(shí)間，min；Vt——提取酶液總體積，mL；Vs——測(cè)定時(shí)取用酶液體積，mL。

1.3.5 SOD（超氧化物歧化酶）活性測(cè)定

粗酶液提取參照Lacan and Baccou[12]方法。

從6個(gè)果實(shí)中獲取果肉樣品3.0 g，加入3 mL提前預(yù)冷的pH 7.5的磷酸緩沖液（含5 mmol/L二硫蘇糖醇和2%PVP）100 mmol/L，在冰浴條件下快速研磨至勻漿后，在4℃的條件下以12 000×g離心30 min，收集上清液用于CAT和SOD兩項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

SOD活性測(cè)定：使用10 mL指形玻璃管，依次加入磷酸緩沖液（1.5 mL，50 mmol/L）、甲硫氨酸（MET）溶液（0.3 mL，130 mmol/L）、氮藍(lán)四唑（NBT）溶液（0.3 mL，750μmol/L）、EDTANa2溶液（0.3 mL，100μmol/L）和酶提取液（0.3 mL），最后加入核黃素（0.3 mL，20μmol/L）。對(duì)照2支玻璃管中的酶液用緩沖液代替，混勻后將其中1支玻璃管放在暗處，其他各玻璃管均放在4 000 lx日光燈下反應(yīng)15 min。反應(yīng)完成后，以暗處放置的玻璃管液體做空白參照，分別測(cè)定其他各玻璃管混合液在560 nm處的吸光度值。SOD活性以每毫克蛋白抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位（U）表示。

1.3.6 CAT（過氧化氫酶）活性測(cè)定

參考Larrigaudièreetal等[13]人方法，將3 mL 10 mmol/L H2O2（以50 mmol/L pH7.5的磷酸緩沖液配制）和100μl粗酶液混合構(gòu)成酶促反應(yīng)體系，記錄2 min內(nèi)自酶液加入后每隔30 s反應(yīng)體系于240 nm處的吸光度值。酶活性用△OD240?min-1?mg-1蛋白質(zhì)表示。

1.3.7 蛋白含量的測(cè)定

根據(jù)Bradford[14]考馬斯亮藍(lán)法，以G-250型考馬斯亮藍(lán)溶液和牛血清蛋白混合液的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=0.834 7x-0.047 5，x=吸光度（0.556-1.032），y=蛋白值。樣品測(cè)定時(shí)，在50μl粗酶液中加入2 mL G-250型考馬斯亮藍(lán)溶液，充分混合2 min后倒入比色皿中，1 min后于595 nm波長(zhǎng)下吸光度值，根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP處理對(duì)果皮黃化指數(shù)的影響

由圖1可以看出，在常溫貯藏期間，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，早酥梨果皮的黃化指數(shù)逐漸升高；對(duì)照組在第12 d就到了貨架末期（果皮淺黃），第20 d時(shí)果皮全黃，黃化指數(shù)達(dá)到4級(jí)；1-MCP 0.5μl/L處理在第16 d時(shí)果皮綠微黃（2級(jí)），第20 d時(shí)果皮綠微黃（2級(jí)）；經(jīng)1-MCP1.0與1-MCP1.5μl/L處理的果實(shí)在整個(gè)貯藏期間黃化指數(shù)始終保持在1級(jí)，說明1-MCP處理能夠明顯延緩早酥梨果皮的黃化，延長(zhǎng)早酥梨的貯藏期，其中以1-MCP1.0與1-MCP1.5μl/L效果最好。

圖1 1-MCP處理對(duì)果皮黃化指數(shù)的影響Fig.1 Effect on pericarp yellowing index

2.2 1-MCP處理對(duì)細(xì)胞膜透性的影響

由圖2可知，貯藏期間組織細(xì)胞膜透性逐漸增加，貯藏前期對(duì)照和處理之間差異不明顯，貯藏8 d后，對(duì)照果皮膜透性迅速增加，而經(jīng)過1-MCP處理的其增長(zhǎng)均比較緩慢，20 d后，差異效果最為顯著。對(duì)照組膜透性為63%，經(jīng)0.5μl/L、1.0μl/L和1.5μl/L處理的果實(shí)其膜透性分別為52%、38%、40%，分別比對(duì)照減少了11%、25%、23%，可見1-MCP顯著減緩了細(xì)胞膜透性的增加，表明1-MCP處理能在一定程度上維持細(xì)胞膜的完整性。其中以濃度為1.0μl/L、1.5μl/L的效果最好。

圖2 1-MCP處理對(duì)細(xì)胞膜透性影響Fig.2 Effect on cell membrane permeability

2.3 1-MCP處理對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響

膜結(jié)構(gòu)的破壞是膜脂過氧化作用的結(jié)果，MDA是膜脂過氧化降解的典型產(chǎn)物，通常把MDA含量作為植物衰老的指標(biāo)之一。除對(duì)照和0.5μl/L 1-MCP處理的果實(shí)外，其他兩組處理的MDA含量在貯藏期間是不斷增加的（見圖3）。處理組MDA含量始終低于對(duì)照，而且隨著貯藏天數(shù)的增加，處理與對(duì)照之間的差異越來越明顯，在16 d時(shí)，經(jīng)0.5μl/L、1.0μl/L和1.5μl/L 1-MCP處理的果實(shí)其MDA含量分別是對(duì)照組的85%、72%、67%，說明1-MCP減緩了膜質(zhì)過氧化程度，減少了MDA的積累，延緩了早酥梨的衰老。

圖3 1-MCP處理對(duì)丙二醛（MDA）含量的影響Fig.3 Effect on malondialdehyde content

2.4 1-MCP處理對(duì)過氧化物酶（POD）活性的影響

在貯藏前期對(duì)照與處理的POD活性變化不大，隨著貯藏天數(shù)的增加，差異效果越來越明顯，并且POD活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，并且都在貯藏至12 d時(shí)POD活性達(dá)到最高值，不同濃度1-MCP的處理并沒有影響到POD活性峰值的出現(xiàn)時(shí)間，但都不同程度的增加了POD的活性。其中以濃度為1.0μl/L、1.5μl/L處理的效果最顯著（見圖4）。

圖4 1-MCP處理對(duì)過氧化物酶（POD）活性的影響Fig.4 Effect on peroxidase activity

2.5 1-MCP處理對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD能夠清除植物組織內(nèi)的超氧自由基，延緩組織的衰老。各處理SOD的活性都呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)（見圖5）。

圖5 1-MCP處理對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響Fig.5 Effect on superoxide dismutaseactivity

1-MCP較對(duì)照下降緩慢，酶活性大大高于對(duì)照，貯藏前期，對(duì)照與處理的差異不顯著，隨著貯藏天數(shù)的增加，對(duì)照與處理差異越來越明顯。貯藏至20 d時(shí)，經(jīng)濃度0.5μl/L、1.0μl/L、1.5μl/L處理的果實(shí)其SOD活性分別為對(duì)照的1.67、2.03、2.23倍。說明1-MCP能使果實(shí)保持較高的SOD活性，起到延緩衰老的作用，以1.0μl/L、1.5μl/L的處理效果最顯著。

2.6 1-MCP處理對(duì)過氧化氫酶（CAT）活性的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組的CAT水平均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)照組在貯藏至第8 d時(shí)達(dá)到最大值，而經(jīng)1-MCP處理的果實(shí)其CAT活性在10 d達(dá)到最高，同時(shí)，貯藏后期經(jīng)1-MCP處理的果實(shí)CAT活性的下降較對(duì)照組也明顯緩慢，表明1-MCP可以延緩早酥梨果實(shí)常溫貯藏前期CAT活性的增加及貯藏后期CAT活性的降低（見圖6）。

圖6 1-MCP處理對(duì)過氧化氫酶（CAT）活性的影響Fig.6 Effect on catalase activity

3 討論與總結(jié)

綠色果蔬的黃化和果實(shí)的顏色變化是成熟與衰老的顯著標(biāo)志之一，在這個(gè)過程中，伴隨的是葉綠素的迅速降解。研究證實(shí)，細(xì)胞組織損傷、衰老或死亡與機(jī)體中膜脂過氧化作用的加強(qiáng)，MDA、活性氧及自由基含量的不斷增加有著密切的關(guān)系。作為細(xì)胞中的保護(hù)性酶類，CAT、SOD、POD等能夠有效地清除活性氧自由基使細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡得以調(diào)解進(jìn)而延緩組織衰老。鑒于此，采取有效措施對(duì)保護(hù)性酶類的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)以實(shí)現(xiàn)延緩衰老可以作為今后研究的重點(diǎn)和努力的方向。

本試驗(yàn)表明，采用1-MCP處理早酥梨，可以延緩早酥梨果皮的黃化速度，降低細(xì)胞膜透性的增加和MDA的積累，抑制SOD、POD及CAT的活性的下降，從而延緩果實(shí)衰老。這與張昭其在臺(tái)灣青棗的研究上具有相似性[9]。