乙酸脅迫條件下釀酒酵母全基因組啟動子區(qū)組蛋白H4 K16 乙?；揎椃治?/h1>
2022-04-18 04:54:00王玉婧張小華劉向勇
河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年1期
馬 田，王玉婧，程 爽，張小華，劉向勇
（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003）
隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和世界人口的不斷增加，化石能源的消耗與日俱增。但化石能源為不可再生資源，同時在大量使用過程中產(chǎn)生空氣污染、溫室效應(yīng)等環(huán)境問題，尋求可再生的環(huán)保型新能源成為亟待解決的社會問題。
高效、清潔、可再生能源燃料乙醇被認(rèn)為是化石能源最有潛力的替代品。木質(zhì)纖維素具有成本低、可再生、原料豐富等優(yōu)點，其中農(nóng)業(yè)廢棄物（秸稈、玉米芯、蔗渣等）是木質(zhì)纖維素材料的主要來源。近年來，利用釀酒酵母代謝木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇成為生物質(zhì)資源開發(fā)利用的研究熱點[1-2]。但木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中會伴隨產(chǎn)生大量有毒抑制物，嚴(yán)重影響微生物的發(fā)酵性能，是制約生物燃料乙醇規(guī)?；a(chǎn)的重要因素[3-4]。
乙酸是木質(zhì)纖維素水解液中主要抑制物之一，可導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)酸化，抑制細(xì)胞正常代謝與生長，甚至引發(fā)細(xì)胞死亡[5-8]。因此，深入解析酵母乙酸耐受機(jī)制，選育高乙酸耐受菌株，對推動纖維素乙醇發(fā)酵的規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。
組蛋白是構(gòu)成真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，其可與DNA 緊密結(jié)合組成核小體。組蛋白中某些特定的氨基酸位點在相關(guān)酶（如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等）作用下可發(fā)生乙?；?、甲基化、ADP 核糖基化等表觀遺傳學(xué)修飾[9]。已有研究表明，這些組蛋白修飾可通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)、影響基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[9-14]。
釀酒酵母組蛋白H4 中的16 位賴氨酸（K16）是已知的重要乙?；揎椢稽c[15-19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母組蛋白H4 K16 位點突變（賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚┛蓪?dǎo)致酵母乙酸耐受性升高，表明組蛋白H4 K16 位點與酵母乙酸耐受性相關(guān)[20]。為深入揭示組蛋白H4 K16 位點在酵母乙酸脅迫應(yīng)答的作用，采用染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片（Chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-chip）技術(shù)分析乙酸脅迫條件下釀酒酵母全基因組啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎椀淖兓?，進(jìn)一步解析酵母乙酸耐受機(jī)制，為推進(jìn)釀酒酵母代謝木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物，生產(chǎn)燃料乙醇提供理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
野生型釀酒酵母菌株BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）由日本酵母遺傳中心惠贈。釀酒酵母培養(yǎng)采用液體酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，pH值調(diào)整為4.5或6.8，115 ℃高溫滅菌30 min。
1.2 試驗方法
1.2.1 釀酒酵母乙酸脅迫處理 接種釀酒酵母BY4741 單菌落于10 mL YPD（pH 值6.8）液體培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)接至100 mL 新鮮YPD（pH 值4.5）液體培養(yǎng)基中，酵母菌體起始量為OD600=0.1。搖床培養(yǎng)至酵母菌體進(jìn)入對數(shù)生長階段（OD600=0.6～0.7），將酵母培養(yǎng)物平均分為2份（每份50 mL），分別標(biāo)記為對照組和乙酸脅迫處理組。在乙酸脅迫處理組中，添加347 μL乙酸（8.7 mol/L，pH 值4.5），至乙酸終濃度為60 mmol/L，對照組添加等體積無菌水。30 ℃、100 r/min 搖床繼續(xù)培養(yǎng)30 min，離心收集酵母細(xì)胞。乙酸脅迫處理組和對照組均設(shè)置2個生物學(xué)重復(fù)。
1.2.2 釀酒酵母全基因組ChIP-chip 分析 酵母細(xì)胞經(jīng)甲醛（終質(zhì)量體積比為1%）化學(xué)交聯(lián)后，采用Diagenode bioruptor UCD-200 非接觸式超聲波破碎儀（Diagenode公司，比利時）隨機(jī)切割酵母細(xì)胞染色質(zhì)DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測超聲破碎效果。在經(jīng)超聲處理的酵母染色質(zhì)DNA 提取物中取出一部分作為Input DNA（ChIP-chip 的內(nèi)參對照），另一部分加入組蛋白H4 K16 乙?；禺愋钥贵w（Active motif 公司，美國）和Protein A/G 免疫沉淀磁珠（Santa cruz 公司，美國）進(jìn)行交聯(lián)染色質(zhì)的免疫沉淀。免疫沉淀復(fù)合物經(jīng)NaCl（終濃度為0.2 mol/L）處理解交聯(lián)后，采用QIAGEN DNA 純化試劑盒（Qiagen 公司，德國）回收免疫沉淀DNA。免疫沉淀DNA 經(jīng) GenomePlex?complete whole genome amplification kit（Sigma-aldrich 公司，美國）擴(kuò)增后，采用QIAquick PCR purification kit（Qiagen 公司，德國）進(jìn)行DNA 純化。純化的DNA 經(jīng)NanoDrop ND-1000（Thermo scientific?公司，美國）定量后，使用NimbleGen dual-color DNA labeling kit 進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記DNA 與Agilent yeast whole genome array芯片（型號：G48104-14810，Agilent公司，美國）雜交之后，采用Agilent scanner G2505C 進(jìn)行芯片掃描。芯片數(shù)據(jù)經(jīng)軟件Agilent feature extraction software（version 11.0.1.1）和Bioconductor packages分析后，使用NimbleScan v2.5 軟件（Roche-NimbleGen 公司，美國）篩選位于釀酒酵母基因組啟動子區(qū)域的組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椄淖儯ㄉ呋蚪档停└患濉＝M蛋白H4 K16 乙?；揎棽町愇稽c最終選取在2個生物學(xué)重復(fù)試驗結(jié)果中呈現(xiàn)相同變化趨勢的富集峰區(qū)域。采用在線基因富集分析工具WebGestalt（http://www.webgestalt.org/）[21]和 Saccharomyces genome database（http://www.yeastgenome.org）數(shù)據(jù)庫對啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎棸l(fā)生差異變化的基因進(jìn)行功能聚類分析。
1.2.3 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 以免疫沉淀DNA 和Input DNA 為模板，采用適用于SYBR GreenⅠ熒光法檢測的實時定量PCR 預(yù)混液SYBR Green Real-Time PCR Master Mix（Arraystar 公司，美國），在QuantStudio ?5 Real-Time PCR System（Applied biosystems 公司，美國）中進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增。染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 所用引物見表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；40 個PCR 循環(huán)[95 ℃，10 s；60 ℃，60 s（收集熒光）]。染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 數(shù)據(jù)采用Percent input（%input）=2（CtInputDNA-Ct免疫沉淀DNA）×稀釋倍數(shù)×100%法[22]分析。染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR試驗結(jié)果以2個獨立生物學(xué)重復(fù)測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。
表1 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR所用引物信息Tab.1 Primer sequences used for chromatin immunoprecipitation with quantitative real-time PCR
2 結(jié)果與分析
2.1 酵母染色質(zhì)DNA片段化分析
染色質(zhì)DNA 片段化的效果是影響染色質(zhì)免疫沉淀試驗質(zhì)量的重要因素。通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測釀酒酵母乙酸脅迫處理組和對照組中經(jīng)超聲波片段化的酵母染色質(zhì)DNA。結(jié)果（圖1）顯示，乙酸脅迫處理組和對照組中的酵母染色質(zhì)DNA片段介于250～1 000 bp，能夠滿足后續(xù)染色質(zhì)免疫沉淀試驗的要求。
圖1 超聲切割酵母細(xì)胞染色質(zhì)DNA大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Determination of sheared yeast chromatin DNA size through agarose gel electrophoresis
2.2 釀酒酵母全基因組ChIP-chip分析
ChIP-chip 分析結(jié)果顯示，與對照組相比，酵母細(xì)胞經(jīng)60 mmol/L 乙酸脅迫處理30 min 后，73 個酵母基因的啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎棸l(fā)生了改變（表2）。其中，組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椛仙?9 個，組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椣陆祷?4個。
表2 乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；l(fā)生差異變化的酵母基因Tab.2 Yeast genes with differentially altered acetylation levels of histone H4 K16 in the promoter regions under acetic acid stress
進(jìn)一步對組蛋白H4 K16 乙?；揎棽町愇稽c的染色體分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。組蛋白H4 K16 乙酰化修飾上升基因主要分布在2、4、5、7、13、15、16 號染色體上，其中7 號染色體上基因數(shù)量最多（12 個）；組蛋白H4 K16 乙酰化修飾下降基因主要分布在1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16 號染色體上，其中15 號染色體上基因數(shù)量最多（10個）。
圖2 乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；l(fā)生差異變化基因的染色體分布Fig.2 Chromosome distribution of genes with differentially altered acetylation levels of histone H4 K16 in the promoter regions under acetic acid stress
利用在線基因富集分析網(wǎng)站W(wǎng)ebGestalt（http://www.webgestalt.org/）和釀酒酵母全基因組數(shù)據(jù)庫（Saccharomyces genome database）（http： www.yeastgenome.org），對乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16 乙酰化發(fā)生差異變化基因的功能進(jìn)行分析。結(jié)果（圖3）顯示，按生物學(xué)過程分類基因功能主要富集在堿基切除修復(fù)、細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞周期進(jìn)程和含蛋白質(zhì)的復(fù)合物組裝；按細(xì)胞組分分類基因功能主要富集在DNA聚合酶復(fù)合體、液泡質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)V-型ATP 酶、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)雙扇區(qū)ATP 酶復(fù)合物/質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)域、有絲分裂紡錘體和核染色體；按分子功能分類基因功能主要富集在單鏈DNA 3′—5′外脫氧核糖核酸酶活性、蛋白酶體結(jié)合、ATP 酶活性/耦聯(lián)離子跨膜運(yùn)動。
圖3 乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎棸l(fā)生差異變化基因的功能分類Fig.3 Functional classification of genes with differentially altered acetylation levels of histone H4 K16 in the promoter regions under acetic acid stress
2.3 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR驗證
為進(jìn)一步驗證ChIP-chip 試驗結(jié)果，隨機(jī)選取3個啟動子區(qū)組蛋白H4 K16 乙?；揎棸l(fā)生差異變化的基因（ATP12、VPS55、DLT1），進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 檢測。試驗結(jié)果（表3）表明，染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 結(jié)果與ChIP-chip試驗結(jié)果（表2）一致，酵母細(xì)胞經(jīng)乙酸脅迫處理后ATP12和VPS55基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 乙酰化修飾下降，而DLT1基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16乙?；揎椛仙?。
表3 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR結(jié)果Tab.3 Result of chromatin immunoprecipitation with quantitative real-time PCR
3 結(jié)論與討論
木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的乙酸會對酵母細(xì)胞的生長代謝及發(fā)酵能力產(chǎn)生抑制作用[23-25]，深入揭示酵母乙酸耐受機(jī)制對提高酵母乙酸耐受性和乙醇發(fā)酵產(chǎn)量具有重要意義。已有研究表明，酵母細(xì)胞會啟動多種機(jī)制應(yīng)答乙酸脅迫環(huán)境，如通過細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)和細(xì)胞膜成分調(diào)整來減少乙酸分子向胞內(nèi)擴(kuò)散、增加細(xì)胞膜和液泡膜上質(zhì)子泵對細(xì)胞質(zhì)中過量H+的外排，加速細(xì)胞質(zhì)pH 值恢復(fù)到正常水平、調(diào)整碳水化合物代謝途徑以應(yīng)對乙酸脅迫引發(fā)的能量限制，以及促進(jìn)大量乙酸脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活化（例如Haa1p）并激活下游靶基因等[5-8]。
雖然人們對酵母乙酸耐受機(jī)制的認(rèn)識不斷深入，但是對其可能涉及的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制至今卻知之甚少。表觀遺傳學(xué)是一種不涉及DNA 序列變化的可逆的基因表達(dá)調(diào)控方式，組蛋白乙?；揎検亲钇毡榈谋碛^遺傳調(diào)控機(jī)制之一。研究表明，酵母組蛋白H4 K16 位點的乙?；揎椬饔门c細(xì)胞壽命、染色質(zhì)組裝、DNA 損傷修復(fù)、基因沉默、DNA 復(fù)制等密切相關(guān)[15-19]。在前期研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H4 K16位點突變可導(dǎo)致酵母乙酸耐受性升高的基礎(chǔ)上[20]，進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞經(jīng)乙酸脅迫處理（60 mmol/L、30 min）后，與對照組相比，73 個酵母基因的啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椝桨l(fā)生了改變（乙?；揎椛仙?9 個、下降基因54 個），并且廣泛分布于多條染色體上。后續(xù)基因功能分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3個不同層面均有基因的顯著富集并涉及多種功能類別。以上73 個酵母基因中有10 個基因已報道與酵母乙酸耐受性密切相關(guān)，具體包括液泡膜H+-ATP 酶VMA3和VMA6、分離酶ESP1、蛋白激酶GCN2、硫胺素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄激活因子THI2、細(xì)胞分裂周期蛋白CDC37、轉(zhuǎn)醛酶TAL1、線粒體內(nèi)膜蛋白MDM32、磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PPT2 基因及絮凝基因FLO1，其中VMA3、VMA6、ESP1、GCN2、THI2、CDC37、MDM32、PPT2基因缺失可導(dǎo)致酵母乙酸耐受性顯著下降[26-30]，TAL1和FLO1基因過表達(dá)可提高酵母乙酸耐受性[31-32]。大量乙酸耐受性密切相關(guān)基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙酰化修飾水平的改變，表明組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椩谡{(diào)控酵母乙酸脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。此外，已有研究表明，乙酸會抑制線粒體呼吸作用，引發(fā)能量危機(jī)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，線粒體合成酶ATP12和ATP20基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椝桨l(fā)生顯著改變，提示組蛋白H4 K16位點乙?；揎梾⑴c了乙酸脅迫條件下酵母細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，大量功能未知基因（YBR141W-A、YAR047C、YEL020C-B、YJL070C、YKL202W、YNL050C、YOL118C、YOR034CA、YOR385W）的啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椝桨l(fā)生了改變，后續(xù)深入解析這些基因的功能以及組蛋白H4 K16 位點乙酰化修飾對其功能的影響，將有助于進(jìn)一步揭示酵母乙酸耐受機(jī)制?？傊陨辖Y(jié)果可增加從表觀遺傳學(xué)角度（組蛋白乙?；揎棧湍敢宜崮褪軝C(jī)制的全新認(rèn)識，為選育適用于代謝木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物的高乙酸耐受菌株提供理論基礎(chǔ)。
組蛋白賴氨酸的乙?；?去乙酰水平處于動態(tài)變化中，主要由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶的共同調(diào)節(jié)完成[34]。最新研究發(fā)現(xiàn)，NAD 依賴的組蛋白去乙酰化酶Sir2中與自身谷胱甘肽化修飾相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸（363 位半胱氨酸、469 位半胱氨酸和513位半胱氨酸）突變，會引起酵母細(xì)胞乙酰輔酶A 合成酶活性升高，進(jìn)而促進(jìn)乙酸向乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致酵母乙酸耐受性升高[35]。此外，CHENG 等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母組蛋白H3 乙?；D(zhuǎn)移酶Rtt109 缺失可提高酵母乙酸耐受性和乙酸脅迫條件下的乙醇發(fā)酵性能，其主要機(jī)制可能涉及HSP12等脅迫環(huán)境應(yīng)答基因表達(dá)水平增加和過氧化氫酶等抗氧化酶活性的升高。本研究結(jié)果與以上結(jié)果一致，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了組蛋白乙?；揎椷^程與酵母乙酸耐受性的相關(guān)性，表明通過基因工程手段改變組蛋白乙?；揎椷^程是提高酵母乙酸耐受性的新途徑。
此外，除以乙酸為代表的有機(jī)酸類抑制物外，木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中還會產(chǎn)生呋喃類和酚類等抑制物[37-39]。本研究可為開展酵母耐受其他木質(zhì)纖維素水解抑制物的高通量表觀遺傳學(xué)分析提供借鑒，加速木質(zhì)纖維素水解抑制物毒性機(jī)制研究，進(jìn)而促進(jìn)以釀酒酵母代謝木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇為方向的農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用。
猜你喜歡
抑癌蛋白p53乙?；揎椀恼{(diào)控網(wǎng)絡(luò)中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(2022年8期)2022-09-08 00:39:50 染色質(zhì)開放性與動物胚胎發(fā)育關(guān)系的研究進(jìn)展畜牧獸醫(yī)學(xué)報(2022年3期)2022-03-30 02:29:20 哺乳動物合子基因組激活過程中的染色質(zhì)重塑中國畜牧獸醫(yī)(2022年1期)2022-02-15 10:46:40 4個地被菊新品系對濕熱脅迫的耐受性研究園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:18 染色質(zhì)可接近性在前列腺癌研究中的作用現(xiàn)代泌尿外科雜志(2019年10期)2019-10-31 07:31:54 “哺乳動物卵母細(xì)胞生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型的研究進(jìn)展”一文附圖生物學(xué)通報(2019年2期)2019-06-15 01:33:42 巴氏醋桿菌核酸修復(fù)酶UvrA對大腸桿菌耐受性的影響天津科技大學(xué)學(xué)報(2016年1期)2016-02-28 16:59:44 慢性支氣管哮喘小鼠肺組織中組蛋白H3乙?；揎椩鰪?qiáng)中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53 miR-29b通過靶向PI3K/Akt信號通路降低胃癌細(xì)胞對順鉑的耐受性中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(2015年5期)2015-03-01 04:03:37 組蛋白去乙?；敢种苿┑难芯窟M(jìn)展中國當(dāng)代醫(yī)藥(2015年16期)2015-03-01 02:03:13
馬 田，王玉婧，程 爽，張小華，劉向勇
（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺 264003）
隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和世界人口的不斷增加，化石能源的消耗與日俱增。但化石能源為不可再生資源，同時在大量使用過程中產(chǎn)生空氣污染、溫室效應(yīng)等環(huán)境問題，尋求可再生的環(huán)保型新能源成為亟待解決的社會問題。
高效、清潔、可再生能源燃料乙醇被認(rèn)為是化石能源最有潛力的替代品。木質(zhì)纖維素具有成本低、可再生、原料豐富等優(yōu)點，其中農(nóng)業(yè)廢棄物（秸稈、玉米芯、蔗渣等）是木質(zhì)纖維素材料的主要來源。近年來，利用釀酒酵母代謝木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇成為生物質(zhì)資源開發(fā)利用的研究熱點[1-2]。但木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中會伴隨產(chǎn)生大量有毒抑制物，嚴(yán)重影響微生物的發(fā)酵性能，是制約生物燃料乙醇規(guī)?；a(chǎn)的重要因素[3-4]。
乙酸是木質(zhì)纖維素水解液中主要抑制物之一，可導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)酸化，抑制細(xì)胞正常代謝與生長，甚至引發(fā)細(xì)胞死亡[5-8]。因此，深入解析酵母乙酸耐受機(jī)制，選育高乙酸耐受菌株，對推動纖維素乙醇發(fā)酵的規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。
組蛋白是構(gòu)成真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，其可與DNA 緊密結(jié)合組成核小體。組蛋白中某些特定的氨基酸位點在相關(guān)酶（如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等）作用下可發(fā)生乙?；?、甲基化、ADP 核糖基化等表觀遺傳學(xué)修飾[9]。已有研究表明，這些組蛋白修飾可通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)、影響基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[9-14]。
釀酒酵母組蛋白H4 中的16 位賴氨酸（K16）是已知的重要乙?；揎椢稽c[15-19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母組蛋白H4 K16 位點突變（賴氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚┛蓪?dǎo)致酵母乙酸耐受性升高，表明組蛋白H4 K16 位點與酵母乙酸耐受性相關(guān)[20]。為深入揭示組蛋白H4 K16 位點在酵母乙酸脅迫應(yīng)答的作用，采用染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片（Chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-chip）技術(shù)分析乙酸脅迫條件下釀酒酵母全基因組啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎椀淖兓?，進(jìn)一步解析酵母乙酸耐受機(jī)制，為推進(jìn)釀酒酵母代謝木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物，生產(chǎn)燃料乙醇提供理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
野生型釀酒酵母菌株BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）由日本酵母遺傳中心惠贈。釀酒酵母培養(yǎng)采用液體酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，pH值調(diào)整為4.5或6.8，115 ℃高溫滅菌30 min。
1.2 試驗方法
1.2.1 釀酒酵母乙酸脅迫處理 接種釀酒酵母BY4741 單菌落于10 mL YPD（pH 值6.8）液體培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)接至100 mL 新鮮YPD（pH 值4.5）液體培養(yǎng)基中，酵母菌體起始量為OD600=0.1。搖床培養(yǎng)至酵母菌體進(jìn)入對數(shù)生長階段（OD600=0.6～0.7），將酵母培養(yǎng)物平均分為2份（每份50 mL），分別標(biāo)記為對照組和乙酸脅迫處理組。在乙酸脅迫處理組中，添加347 μL乙酸（8.7 mol/L，pH 值4.5），至乙酸終濃度為60 mmol/L，對照組添加等體積無菌水。30 ℃、100 r/min 搖床繼續(xù)培養(yǎng)30 min，離心收集酵母細(xì)胞。乙酸脅迫處理組和對照組均設(shè)置2個生物學(xué)重復(fù)。
1.2.2 釀酒酵母全基因組ChIP-chip 分析 酵母細(xì)胞經(jīng)甲醛（終質(zhì)量體積比為1%）化學(xué)交聯(lián)后，采用Diagenode bioruptor UCD-200 非接觸式超聲波破碎儀（Diagenode公司，比利時）隨機(jī)切割酵母細(xì)胞染色質(zhì)DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測超聲破碎效果。在經(jīng)超聲處理的酵母染色質(zhì)DNA 提取物中取出一部分作為Input DNA（ChIP-chip 的內(nèi)參對照），另一部分加入組蛋白H4 K16 乙?；禺愋钥贵w（Active motif 公司，美國）和Protein A/G 免疫沉淀磁珠（Santa cruz 公司，美國）進(jìn)行交聯(lián)染色質(zhì)的免疫沉淀。免疫沉淀復(fù)合物經(jīng)NaCl（終濃度為0.2 mol/L）處理解交聯(lián)后，采用QIAGEN DNA 純化試劑盒（Qiagen 公司，德國）回收免疫沉淀DNA。免疫沉淀DNA 經(jīng) GenomePlex?complete whole genome amplification kit（Sigma-aldrich 公司，美國）擴(kuò)增后，采用QIAquick PCR purification kit（Qiagen 公司，德國）進(jìn)行DNA 純化。純化的DNA 經(jīng)NanoDrop ND-1000（Thermo scientific?公司，美國）定量后，使用NimbleGen dual-color DNA labeling kit 進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記DNA 與Agilent yeast whole genome array芯片（型號：G48104-14810，Agilent公司，美國）雜交之后，采用Agilent scanner G2505C 進(jìn)行芯片掃描。芯片數(shù)據(jù)經(jīng)軟件Agilent feature extraction software（version 11.0.1.1）和Bioconductor packages分析后，使用NimbleScan v2.5 軟件（Roche-NimbleGen 公司，美國）篩選位于釀酒酵母基因組啟動子區(qū)域的組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椄淖儯ㄉ呋蚪档停└患濉＝M蛋白H4 K16 乙?；揎棽町愇稽c最終選取在2個生物學(xué)重復(fù)試驗結(jié)果中呈現(xiàn)相同變化趨勢的富集峰區(qū)域。采用在線基因富集分析工具WebGestalt（http://www.webgestalt.org/）[21]和 Saccharomyces genome database（http://www.yeastgenome.org）數(shù)據(jù)庫對啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎棸l(fā)生差異變化的基因進(jìn)行功能聚類分析。
1.2.3 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 以免疫沉淀DNA 和Input DNA 為模板，采用適用于SYBR GreenⅠ熒光法檢測的實時定量PCR 預(yù)混液SYBR Green Real-Time PCR Master Mix（Arraystar 公司，美國），在QuantStudio ?5 Real-Time PCR System（Applied biosystems 公司，美國）中進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增。染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 所用引物見表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；40 個PCR 循環(huán)[95 ℃，10 s；60 ℃，60 s（收集熒光）]。染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 數(shù)據(jù)采用Percent input（%input）=2（CtInputDNA-Ct免疫沉淀DNA）×稀釋倍數(shù)×100%法[22]分析。染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR試驗結(jié)果以2個獨立生物學(xué)重復(fù)測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示。
表1 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR所用引物信息Tab.1 Primer sequences used for chromatin immunoprecipitation with quantitative real-time PCR
2 結(jié)果與分析
2.1 酵母染色質(zhì)DNA片段化分析
染色質(zhì)DNA 片段化的效果是影響染色質(zhì)免疫沉淀試驗質(zhì)量的重要因素。通過瓊脂糖凝膠電泳分別檢測釀酒酵母乙酸脅迫處理組和對照組中經(jīng)超聲波片段化的酵母染色質(zhì)DNA。結(jié)果（圖1）顯示，乙酸脅迫處理組和對照組中的酵母染色質(zhì)DNA片段介于250～1 000 bp，能夠滿足后續(xù)染色質(zhì)免疫沉淀試驗的要求。
圖1 超聲切割酵母細(xì)胞染色質(zhì)DNA大小的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Determination of sheared yeast chromatin DNA size through agarose gel electrophoresis
2.2 釀酒酵母全基因組ChIP-chip分析
ChIP-chip 分析結(jié)果顯示，與對照組相比，酵母細(xì)胞經(jīng)60 mmol/L 乙酸脅迫處理30 min 后，73 個酵母基因的啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎棸l(fā)生了改變（表2）。其中，組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椛仙?9 個，組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椣陆祷?4個。
表2 乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；l(fā)生差異變化的酵母基因Tab.2 Yeast genes with differentially altered acetylation levels of histone H4 K16 in the promoter regions under acetic acid stress
進(jìn)一步對組蛋白H4 K16 乙?；揎棽町愇稽c的染色體分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。組蛋白H4 K16 乙酰化修飾上升基因主要分布在2、4、5、7、13、15、16 號染色體上，其中7 號染色體上基因數(shù)量最多（12 個）；組蛋白H4 K16 乙酰化修飾下降基因主要分布在1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16 號染色體上，其中15 號染色體上基因數(shù)量最多（10個）。
圖2 乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；l(fā)生差異變化基因的染色體分布Fig.2 Chromosome distribution of genes with differentially altered acetylation levels of histone H4 K16 in the promoter regions under acetic acid stress
利用在線基因富集分析網(wǎng)站W(wǎng)ebGestalt（http://www.webgestalt.org/）和釀酒酵母全基因組數(shù)據(jù)庫（Saccharomyces genome database）（http： www.yeastgenome.org），對乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16 乙酰化發(fā)生差異變化基因的功能進(jìn)行分析。結(jié)果（圖3）顯示，按生物學(xué)過程分類基因功能主要富集在堿基切除修復(fù)、細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞周期進(jìn)程和含蛋白質(zhì)的復(fù)合物組裝；按細(xì)胞組分分類基因功能主要富集在DNA聚合酶復(fù)合體、液泡質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)V-型ATP 酶、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)雙扇區(qū)ATP 酶復(fù)合物/質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)域、有絲分裂紡錘體和核染色體；按分子功能分類基因功能主要富集在單鏈DNA 3′—5′外脫氧核糖核酸酶活性、蛋白酶體結(jié)合、ATP 酶活性/耦聯(lián)離子跨膜運(yùn)動。
圖3 乙酸脅迫條件下啟動子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎棸l(fā)生差異變化基因的功能分類Fig.3 Functional classification of genes with differentially altered acetylation levels of histone H4 K16 in the promoter regions under acetic acid stress
2.3 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR驗證
為進(jìn)一步驗證ChIP-chip 試驗結(jié)果，隨機(jī)選取3個啟動子區(qū)組蛋白H4 K16 乙?；揎棸l(fā)生差異變化的基因（ATP12、VPS55、DLT1），進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 檢測。試驗結(jié)果（表3）表明，染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR 結(jié)果與ChIP-chip試驗結(jié)果（表2）一致，酵母細(xì)胞經(jīng)乙酸脅迫處理后ATP12和VPS55基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 乙酰化修飾下降，而DLT1基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16乙?；揎椛仙?。
表3 染色質(zhì)免疫沉淀-實時定量PCR結(jié)果Tab.3 Result of chromatin immunoprecipitation with quantitative real-time PCR
3 結(jié)論與討論
木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的乙酸會對酵母細(xì)胞的生長代謝及發(fā)酵能力產(chǎn)生抑制作用[23-25]，深入揭示酵母乙酸耐受機(jī)制對提高酵母乙酸耐受性和乙醇發(fā)酵產(chǎn)量具有重要意義。已有研究表明，酵母細(xì)胞會啟動多種機(jī)制應(yīng)答乙酸脅迫環(huán)境，如通過細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)和細(xì)胞膜成分調(diào)整來減少乙酸分子向胞內(nèi)擴(kuò)散、增加細(xì)胞膜和液泡膜上質(zhì)子泵對細(xì)胞質(zhì)中過量H+的外排，加速細(xì)胞質(zhì)pH 值恢復(fù)到正常水平、調(diào)整碳水化合物代謝途徑以應(yīng)對乙酸脅迫引發(fā)的能量限制，以及促進(jìn)大量乙酸脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活化（例如Haa1p）并激活下游靶基因等[5-8]。
雖然人們對酵母乙酸耐受機(jī)制的認(rèn)識不斷深入，但是對其可能涉及的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制至今卻知之甚少。表觀遺傳學(xué)是一種不涉及DNA 序列變化的可逆的基因表達(dá)調(diào)控方式，組蛋白乙?；揎検亲钇毡榈谋碛^遺傳調(diào)控機(jī)制之一。研究表明，酵母組蛋白H4 K16 位點的乙?；揎椬饔门c細(xì)胞壽命、染色質(zhì)組裝、DNA 損傷修復(fù)、基因沉默、DNA 復(fù)制等密切相關(guān)[15-19]。在前期研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H4 K16位點突變可導(dǎo)致酵母乙酸耐受性升高的基礎(chǔ)上[20]，進(jìn)一步采用染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞經(jīng)乙酸脅迫處理（60 mmol/L、30 min）后，與對照組相比，73 個酵母基因的啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椝桨l(fā)生了改變（乙?；揎椛仙?9 個、下降基因54 個），并且廣泛分布于多條染色體上。后續(xù)基因功能分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3個不同層面均有基因的顯著富集并涉及多種功能類別。以上73 個酵母基因中有10 個基因已報道與酵母乙酸耐受性密切相關(guān)，具體包括液泡膜H+-ATP 酶VMA3和VMA6、分離酶ESP1、蛋白激酶GCN2、硫胺素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄激活因子THI2、細(xì)胞分裂周期蛋白CDC37、轉(zhuǎn)醛酶TAL1、線粒體內(nèi)膜蛋白MDM32、磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PPT2 基因及絮凝基因FLO1，其中VMA3、VMA6、ESP1、GCN2、THI2、CDC37、MDM32、PPT2基因缺失可導(dǎo)致酵母乙酸耐受性顯著下降[26-30]，TAL1和FLO1基因過表達(dá)可提高酵母乙酸耐受性[31-32]。大量乙酸耐受性密切相關(guān)基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙酰化修飾水平的改變，表明組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椩谡{(diào)控酵母乙酸脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。此外，已有研究表明，乙酸會抑制線粒體呼吸作用，引發(fā)能量危機(jī)[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，線粒體合成酶ATP12和ATP20基因啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椝桨l(fā)生顯著改變，提示組蛋白H4 K16位點乙?；揎梾⑴c了乙酸脅迫條件下酵母細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，大量功能未知基因（YBR141W-A、YAR047C、YEL020C-B、YJL070C、YKL202W、YNL050C、YOL118C、YOR034CA、YOR385W）的啟動子區(qū)域組蛋白H4 K16 位點乙?；揎椝桨l(fā)生了改變，后續(xù)深入解析這些基因的功能以及組蛋白H4 K16 位點乙酰化修飾對其功能的影響，將有助于進(jìn)一步揭示酵母乙酸耐受機(jī)制?？傊陨辖Y(jié)果可增加從表觀遺傳學(xué)角度（組蛋白乙?；揎棧湍敢宜崮褪軝C(jī)制的全新認(rèn)識，為選育適用于代謝木質(zhì)纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物的高乙酸耐受菌株提供理論基礎(chǔ)。
組蛋白賴氨酸的乙?；?去乙酰水平處于動態(tài)變化中，主要由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶的共同調(diào)節(jié)完成[34]。最新研究發(fā)現(xiàn)，NAD 依賴的組蛋白去乙酰化酶Sir2中與自身谷胱甘肽化修飾相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸（363 位半胱氨酸、469 位半胱氨酸和513位半胱氨酸）突變，會引起酵母細(xì)胞乙酰輔酶A 合成酶活性升高，進(jìn)而促進(jìn)乙酸向乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致酵母乙酸耐受性升高[35]。此外，CHENG 等[36]的研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母組蛋白H3 乙?；D(zhuǎn)移酶Rtt109 缺失可提高酵母乙酸耐受性和乙酸脅迫條件下的乙醇發(fā)酵性能，其主要機(jī)制可能涉及HSP12等脅迫環(huán)境應(yīng)答基因表達(dá)水平增加和過氧化氫酶等抗氧化酶活性的升高。本研究結(jié)果與以上結(jié)果一致，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了組蛋白乙?；揎椷^程與酵母乙酸耐受性的相關(guān)性，表明通過基因工程手段改變組蛋白乙?；揎椷^程是提高酵母乙酸耐受性的新途徑。
此外，除以乙酸為代表的有機(jī)酸類抑制物外，木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中還會產(chǎn)生呋喃類和酚類等抑制物[37-39]。本研究可為開展酵母耐受其他木質(zhì)纖維素水解抑制物的高通量表觀遺傳學(xué)分析提供借鑒，加速木質(zhì)纖維素水解抑制物毒性機(jī)制研究，進(jìn)而促進(jìn)以釀酒酵母代謝木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇為方向的農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用。
猜你喜歡
中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(2022年8期)2022-09-08 00:39:50
畜牧獸醫(yī)學(xué)報(2022年3期)2022-03-30 02:29:20
中國畜牧獸醫(yī)(2022年1期)2022-02-15 10:46:40
園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:18
現(xiàn)代泌尿外科雜志(2019年10期)2019-10-31 07:31:54
生物學(xué)通報(2019年2期)2019-06-15 01:33:42
天津科技大學(xué)學(xué)報(2016年1期)2016-02-28 16:59:44
中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志(2016年4期)2016-02-27 11:15:53
中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(2015年5期)2015-03-01 04:03:37
中國當(dāng)代醫(yī)藥(2015年16期)2015-03-01 02:03:13
