中華絨螯蟹卵巢發(fā)育期間兩種雌激素受體在卵巢和肝胰腺的分布及變化

柳梅梅吳旭干劉智俊陳 浩成永旭, 2

(1. 上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái), 上海 201306)

中華絨螯蟹卵巢發(fā)育期間兩種雌激素受體在卵巢和肝胰腺的分布及變化

柳梅梅1吳旭干1劉智俊1陳 浩1成永旭1, 2

(1. 上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái), 上海 201306)

大量脊椎動(dòng)物的研究結(jié)果表明, 雌激素是通過(guò)和靶器官中的雌激素受體(ER)結(jié)合來(lái)直接和間接調(diào)控卵巢發(fā)育[10]。有研究表明, 甲殼動(dòng)物卵巢、肝胰腺、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種組織中存在ER或ER類(lèi)似物, 且免疫活性與卵巢發(fā)育階段具有相關(guān)性, 推測(cè)認(rèn)為甲殼動(dòng)物的雌激素可能也是通過(guò)與 ER結(jié)合來(lái)調(diào)控卵巢發(fā)育[11—14]。中華絨螯蟹簡(jiǎn)稱(chēng)河蟹, 是我國(guó)重要的養(yǎng)殖蟹類(lèi), 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 其養(yǎng)殖過(guò)程中存在一齡蟹性早熟和二齡成蟹卵巢發(fā)育不良等問(wèn)題, 這嚴(yán)重影響著河蟹養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[15, 16], 而河蟹性早熟和卵巢發(fā)育不良可能與雌二醇分泌有關(guān)[6, 17]。盡管雌二醇存在于河蟹雌體的卵巢和肝胰腺等多種組織中, 且其含量與卵巢發(fā)育階段有關(guān)[4, 17],但是有關(guān)其對(duì)卵巢發(fā)育的作用機(jī)制不詳。鑒于此, 本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法對(duì)河蟹的 ER進(jìn)行了識(shí)別與定位, 較系統(tǒng)研究了河蟹卵巢發(fā)育周期內(nèi)ER在卵巢和肝胰腺內(nèi)的分布與變化, 旨在為進(jìn)一步探討雌激素及其受體在河蟹卵巢發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與暫養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用蟹均取自于上海海洋大學(xué)崇明河蟹實(shí)驗(yàn)基地。采樣時(shí)間為2013年7月—2014年1月, 每月挑選5—10只肢體健全的雌蟹用于實(shí)驗(yàn), 體重為 47—135 g, 甲殼長(zhǎng)為4.3—6.1 cm。實(shí)驗(yàn)用蟹均活體運(yùn)輸至上海海洋大學(xué)甲殼動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)繁殖實(shí)驗(yàn)室, 在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)兩周后用于實(shí)驗(yàn), 暫養(yǎng)水族箱體積為178 L (長(zhǎng)×寬×高為75 cm×53 cm×45 cm), 水體體積為120 L左右, 箱底部鋪5 cm厚的細(xì)沙供蟹潛伏, 同時(shí)放置2段無(wú)毒PVC管(直徑18 cm, 長(zhǎng)25 cm) 作為隱蔽物, 每箱放2—3只蟹, 暫養(yǎng)期間每日下午 19:00按照蟹體重的 3%—5%投喂配合飼料,次日上午10點(diǎn)清理殘餌和糞便, 水源為曝氣后的自來(lái)水,自然光照, 實(shí)驗(yàn)期間水溫為14—24℃, pH 7.0—9.0, 溶氧＞5 mg/L; 氨氮＜0.5 mg/L, 亞硝酸鹽＜0.10 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)取樣與卵巢分期

實(shí)驗(yàn)用蟹暫養(yǎng)后進(jìn)行活體解剖。解剖前先用電子天平稱(chēng)重, 然后測(cè)量其甲殼長(zhǎng)、甲殼寬。解剖后取出所有的卵巢組織, 準(zhǔn)確稱(chēng)重并記錄卵巢顏色, 據(jù)此計(jì)算卵巢指數(shù)(GSI/%=100×卵巢質(zhì)量/蟹質(zhì)量) 。同時(shí)取小塊卵巢、肝胰腺和肌肉, PBS漂洗后固定在Bouin氏液中。根據(jù)文獻(xiàn)[18, 19]的分期方法將河蟹的卵巢發(fā)育分為 5期, 每個(gè)卵巢分期發(fā)育階段均重復(fù)固定 3—5只蟹的相關(guān)組織, 以用于后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要試劑

1938年4月3日，熊式輝曾向蔣介石提出:“本黨成立將近三十年，由革命黨改為政黨，現(xiàn)在卻一不像美之共和民主等政黨，二不像蘇俄之共產(chǎn)革命專(zhuān)政黨，三不像德意之納粹黨及法西斯黨，實(shí)際并以上三種性質(zhì)兼有而不俱全，以此來(lái)與民社等政黨及憑借武力革命之共產(chǎn)黨相周旋，一切政治施為，固難求其適應(yīng)?！?蔣介石侍從室的高級(jí)幕僚唐縱在1944年4月28日的日記中也提到，“目今黨何以不能在政治上起領(lǐng)導(dǎo)作用?黨的上層干部，對(duì)于主義政策的認(rèn)識(shí)，并不徹底。由革命到取得政權(quán)，思想和觀念已為之大變，現(xiàn)在大家的觀念是現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。上級(jí)干部在追求權(quán)位，下級(jí)同志在追求生活。主義、政治、革命，都已忘卻了! 消失了!”?

免疫印跡試劑 一抗分別為兔抗人的雌激素 α受體(ERα, 抗C端20個(gè)氨基酸,編號(hào):sc-543)和雌激素β受體(ERβ, 抗N端1—150氨基酸,編號(hào)sc-8974),兩種多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz生物公司; 二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(編號(hào)HSA0004)、彩色預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(編號(hào)PRT0670)購(gòu)于上海麥約爾生物技術(shù)有限公司; 凝膠配置試劑盒(編號(hào) WB0130)購(gòu)于維奧(上海)生物科技有限公司; 全蛋白提取試劑盒(編號(hào)AR0101-30)、RIPA裂解液(編號(hào) WB0103)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(編號(hào)AR1112)、TBS (編號(hào)AR0193)、TBST (編號(hào)AR0195)、PBS (10 mmol/L, pH 7.2—7.6, 編號(hào)AR0030)、DAB試劑盒(編號(hào)AR1021)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。免疫印跡緩沖液包括SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、TBS及TBST。

免疫組化試劑 一抗同免疫印跡, 二抗 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液(編號(hào)PV-9001)和一抗稀釋液(編號(hào) ZLI-9028) 購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)公司, 3%雙氧水(編號(hào) AR1108)、DAB顯色試劑盒(編號(hào) AR1022)、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0, 編號(hào) AR0024)和0.01 mol/L的PBS緩沖液(pH7.2—7.6, 編號(hào)AR0030)購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化緩沖液包括PBS與枸櫞酸鹽緩沖液。

1.4 免疫印跡

分別取卵巢處于Ⅱ期的雌蟹卵巢和肌肉(約 0.1 g左右)加入1 mL蛋白提取液(編號(hào) AR0101-30)提取蛋白, 提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 蛋白提取液離心后采用微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào) Q5000, 美國(guó) Quawell公司生產(chǎn))測(cè)定蛋白濃度, 然后用于免疫印跡或保存于–70℃冰箱中備用。

將蛋白提取物與上樣緩沖液按4︰1 (體積比)混合后沸水變性10min, 分別取樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白20 μL及5 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 濃縮膠濃度為5%, 電壓為90V; 分離膠濃度為10%, 電壓為110 V, 電泳后分離膠用轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào): BG-VER-Mini, 北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)) 在150 mA電流下轉(zhuǎn)膜70—100min, 然后將膜用TBS浸洗后置于 5%的脫脂奶粉溶液中, 室溫下用搖床搖動(dòng)封閉 1h, TBST浸洗后, 加入一抗(稀釋體積比1︰200) 4℃下?lián)u動(dòng)孵育 12h; TBST浸洗后, 加二抗(稀釋體積比 1︰800), 在37℃下孵育2h; TBST浸洗后用DAB顯色, 數(shù)碼相機(jī)拍照后采用BioRad imagelab V3.0軟件計(jì)算ER分子量。

1.5 免疫組化

取 Bouin氏液固定 24h后的組織進(jìn)行酒精梯度脫水,二甲苯透明, 石蠟包埋后采用 Leica切片機(jī)(型號(hào) Leica RM2125RTS, 德國(guó)Leica公司生產(chǎn))進(jìn)行連續(xù)切片, 切片厚度為 5—7 μm。切片常規(guī)脫蠟至水后, 浸入枸櫞酸鹽緩沖液中在94℃條件下保持15min進(jìn)行抗原熱修復(fù), 自然冷卻至室溫后取出切片用PBS洗滌3次(2—5 min/次)。再用3%的雙氧水室溫處理 20min 以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性, PBS洗滌3次(2—5 min/次)后滴加ER抗體(稀釋體積比1︰50), 4℃孵育過(guò)夜(18h)。PBS漂洗3次后(2—5 min/次)滴加二抗工作液一, 在37℃條件下孵育20min; PBS漂洗3次后(2—5 min/次), 滴加二抗工作液二, 37℃條件下孵育20min; DAB顯色15min后于顯微鏡下觀察顯色效果。顯色后的切片用蒸餾水洗滌后采用酒精梯度脫水, 二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片后在Leica DM2500顯微鏡下觀察和拍照。根據(jù)染色的深淺, 將陽(yáng)性強(qiáng)弱分為強(qiáng)陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性, 分別記為“+++”、“++”、 “+”和“–”。

2 結(jié)果

2.1 ER的免疫印跡

為了防止ERα和ERβ的交叉反應(yīng), 本研究分別采用基于ERα蛋白C端(對(duì)應(yīng)于其基因的E/F區(qū)) 氨基酸殘基設(shè)計(jì)的兔抗人ERα多克隆抗體和基于ERβ蛋白N端(對(duì)應(yīng)于其基因的A/B區(qū))氨基酸殘基設(shè)計(jì)的ERβ多克隆抗體, ERα和 ERβ這兩段氨基酸殘基的序列差異較大, 因此這兩者發(fā)生交叉反應(yīng)的概率較低。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,河蟹卵巢中分別存在 ERα和ERβ的免疫陽(yáng)性條帶各一條,其分子量約為70和80 kD左右(圖1)。分別采用牛血清蛋白和河蟹肌肉作為同步對(duì)照, 結(jié)果均為陰性。

2.2 ER在卵巢中的分布和變化

在卵巢發(fā)育過(guò)程中, ERα主要分布于卵巢中的濾泡細(xì)胞、中期卵母細(xì)胞胞質(zhì)(Ⅱ-Ⅳ期)和后期卵母細(xì)胞核(Ⅲ-Ⅴ期), 不同卵巢發(fā)育階段卵巢中ERα的分布和陽(yáng)性強(qiáng)度也有所不同(表 1)。Ⅰ期卵巢中以卵原細(xì)胞為主, 卵原細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn) ERα陽(yáng)性, 此期生發(fā)區(qū)間可見(jiàn)濾泡細(xì)胞, 濾泡細(xì)胞呈ERα中等陽(yáng)性(圖版Ⅰ-1); Ⅱ期卵巢中以內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞(EN)和卵黃合成前卵母細(xì)胞(PRO)為主, 生發(fā)區(qū)間的濾泡細(xì)胞已開(kāi)始向生發(fā)區(qū)內(nèi)遷移, 部分已分布于卵母細(xì)胞周?chē)? 此期卵母細(xì)胞的胞質(zhì)呈 ERα強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),濾泡細(xì)胞仍為 ERα中等陽(yáng)性(圖版Ⅰ-2, 3);Ⅲ期卵巢中以外源性卵母細(xì)胞(EX)為主, 此時(shí)濾泡細(xì)胞已完成對(duì)卵母細(xì)胞的包裹, 此階段 ERα陽(yáng)性物質(zhì)主要分布于濾泡細(xì)胞和EX的細(xì)胞質(zhì), EX的細(xì)胞核為ERα弱陽(yáng)性反應(yīng)(圖版Ⅰ-4, 4a); Ⅳ期卵巢中以近成熟期卵母細(xì)胞(NO)為主, 濾泡細(xì)胞緊貼在NO周?chē)? 此時(shí)EX細(xì)胞質(zhì)的ERα免疫陽(yáng)性減弱至弱陽(yáng)性, 而細(xì)胞核中增強(qiáng)至中等陽(yáng)性(圖版Ⅰ-5, 5b); Ⅴ期卵巢中主要為成熟的卵母細(xì)胞(MO), 此期卵母細(xì)胞僅核中呈 ERα弱陽(yáng)性, 此期由于Ⅴ期卵巢中的濾泡細(xì)胞和細(xì)胞膜融合, 故切片中很難發(fā)現(xiàn)(圖版Ⅰ-6)。

在卵巢發(fā)育過(guò)程中, ERβ免疫陽(yáng)性的變化規(guī)律和ERα有所不同, 其免疫陽(yáng)性強(qiáng)度明顯低于ERα (表2)。Ⅰ期卵巢中濾泡細(xì)胞呈ERβ弱陽(yáng)性(圖版Ⅰ-7); Ⅱ期卵巢中卵母細(xì)胞胞質(zhì)中呈 ERβ的中等陽(yáng)性反應(yīng)(圖版Ⅰ-8, 9), 濾泡細(xì)胞仍為ERβ弱陽(yáng)性; Ⅲ期卵巢中的ERβ陽(yáng)性物質(zhì)主要分布于EX的細(xì)胞核和EN的細(xì)胞質(zhì)(圖版Ⅰ-10); Ⅳ期卵巢中的濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞質(zhì)均呈ERβ弱陽(yáng)性, 卵母細(xì)胞核則為ERβ中等陽(yáng)性(圖版Ⅰ-11, 11c); Ⅴ期成熟卵母細(xì)胞(MO)質(zhì)中基本無(wú)ERβ陽(yáng)性, 卵母細(xì)胞核中為ERβ弱陽(yáng)性(圖版Ⅰ-12)。

圖1 中華絨螯蟹卵巢和肌肉中ER的免疫印跡分析Fig.1 Western blotting results of two ERs in the ovary and muscle of the ovarian stage Ⅱ Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

表1 中華絨螯蟹卵巢發(fā)育期間卵巢和肝胰腺細(xì)胞中的ERα分布和變化Tab. 1 The distribution and change of ERα on the ovary and hepatopancreas during the ovarian development of Eriocheir sinensis

2.3 ER在肝胰腺中的分布和變化

在卵巢發(fā)育過(guò)程中, ERα免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要分布于F細(xì)胞和R細(xì)胞核(表1, 圖版Ⅱ-1－6)。Ⅰ期肝胰腺中R細(xì)胞核呈 ERα中等陽(yáng)性, F細(xì)胞為弱陽(yáng)性(圖版Ⅱ-1); Ⅱ期肝胰腺R細(xì)胞核為ERα強(qiáng)陽(yáng)性, F細(xì)胞呈ERα中等陽(yáng)性(圖版Ⅱ-2); Ⅲ期肝胰腺R細(xì)胞核為ERα中等陽(yáng)性, F細(xì)胞為ERα弱陽(yáng)性(圖版Ⅱ-3); Ⅳ期和Ⅴ期肝胰腺F細(xì)胞及R細(xì)胞核均呈ERα弱陽(yáng)性(圖版Ⅱ-4－6)。

在卵巢發(fā)育過(guò)程中, 肝胰腺中 ERβ免疫陽(yáng)性的變化規(guī)律和ERα略有相似, 但又有所不同(表2, 圖版Ⅱ-7－12)。Ⅰ期肝胰腺中R細(xì)胞核為弱陽(yáng)性, F細(xì)胞為中等陽(yáng)性(圖版Ⅱ-7), 這與ERα在Ⅰ期肝胰腺的陽(yáng)性強(qiáng)度不同;Ⅱ期肝胰腺的R細(xì)胞核和F細(xì)胞均為ERβ中等陽(yáng)性(圖版Ⅱ-8); Ⅲ期肝胰腺R細(xì)胞核和F細(xì)胞均為ERβ強(qiáng)陽(yáng)性(圖版Ⅱ-9); Ⅳ期肝胰腺F細(xì)胞及R細(xì)胞核中的ERβ免疫活性減為中等陽(yáng)性(圖版Ⅱ-10); Ⅴ期肝胰腺中 F細(xì)胞和 R細(xì)胞核中 ERβ陽(yáng)性進(jìn)一步降低, 為弱陽(yáng)性(圖版Ⅱ-11,12)。

3 討論

3.1 ER的種類(lèi)及分子量

脊椎動(dòng)物的雌激素核受體包含ERα、ERβ和ERγ三種亞型, 它們可能都是由原始的ER基因通過(guò)復(fù)制進(jìn)化而來(lái)的, 其中ERγ為硬骨魚(yú)類(lèi)特有, ERα和ERβ在魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)中廣泛存在, 對(duì)其生殖調(diào)控具有極其重要的作用[20]。大量研究表明, 哺乳動(dòng)物的ERα 和 ERβ的組織分布和生理功能有所不同[21, 22], 小鼠的ERα主要影響乳腺發(fā)育和泌乳, 而 ERβ主要調(diào)控排卵效率[23]。而有關(guān)甲殼動(dòng)物 ER的研究較少, 且主要集中于ERα的免疫組化[11—14]。本實(shí)驗(yàn)采用兔抗人的ERα和ERβ多克隆抗體分別進(jìn)行免疫印跡分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在河蟹卵巢組織中分別存在一個(gè)ERα和ERβ免疫條帶, 其分子量分別為70和80 kD左右, 這與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) Erα (53 kD)和Erβ (120 kD) 的分子量有一定的差異[24], 河蟹 ERα的分子量與歐洲淡水螯蝦(Cherax albidus)和鉤蝦(Gammaridae fossarum)的較為接近, 后兩者ERα的分子量分別為67和62 kD分子量[11, 25]。不同物種同一 ER亞型的分子量差異可能是由于其基因進(jìn)化過(guò)程中的剪切和變異造成的[23]。盡管ERα和ERβ在某些結(jié)構(gòu)域上高度相似, 如DNA結(jié)合區(qū)(C/D區(qū)), 但是其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(A/B區(qū))和配體結(jié)合區(qū)(E/F區(qū))差異較大, 小鼠 ERα

和ERβ在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相似度僅為53%和30%[26]。本實(shí)驗(yàn)所選用的兔抗人ERα和ERβ抗體, ER抗原分別是依據(jù)C端20個(gè)氨基酸殘基(E/F區(qū))和N端1—150氨基酸殘基(A/B區(qū))設(shè)計(jì)而成, 由于ERα和ERβ的這兩段氨基酸殘基差異較大, 因此在本實(shí)驗(yàn)中ERα和ERβ的特異性相對(duì)較強(qiáng), 可以避免兩者免疫印跡的交叉反應(yīng)。

3.2 ER在卵巢和肝胰腺中的分布變化與卵巢發(fā)育的關(guān)系本研究結(jié)果表明河蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中卵巢和肝胰腺中存在ERα和ERβ, 且免疫陽(yáng)性與卵巢發(fā)育階段有關(guān), 但是兩者免疫活性的變化規(guī)律略有不同。在整個(gè)河蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中, 生殖細(xì)胞中的ERα和ERβ均由胞質(zhì)向胞核遷移, 兩者在胞核中的最大免疫陽(yáng)性均出現(xiàn)在Ⅳ期(卵黃發(fā)生旺期)。造成以上現(xiàn)象的可能原因?yàn)? 雌激素與ER結(jié)合后必需與細(xì)胞核中的雌激素反應(yīng)元件(Estrogen response element, ERE)結(jié)合才能啟動(dòng)卵黃蛋白原(Vg)等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[25], 因此ER需要從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移從而啟動(dòng)基因組調(diào)控模式, 因此其細(xì)胞核中的最高免疫陽(yáng)性出現(xiàn)在卵黃發(fā)生旺期(Ⅳ期卵巢)。先前的研究表明, 河蟹卵巢中雌激素的最高含量通常出現(xiàn)在Ⅲ-Ⅳ期[6], 且外源雌二醇活體注射實(shí)驗(yàn)也證實(shí)雌二醇主要促進(jìn)河蟹Ⅲ期卵巢發(fā)育, 而河蟹ERα和ERβ的最高免疫陽(yáng)性主要出現(xiàn)在Ⅳ期,

這與雌二醇的含量峰值出現(xiàn)時(shí)間相比具有一定滯后性。這可能因?yàn)槁殉仓写贫颊T導(dǎo)ER基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)需要一個(gè)過(guò)程, 此外雌二醇除了通過(guò)ER調(diào)控卵黃發(fā)生外, 還具有其他多種生理功能[1], 因此河蟹卵巢中的雌激素含量峰值與其受體的最大免疫陽(yáng)性出現(xiàn)時(shí)間并不完全一致。

卵巢組織的濾泡細(xì)胞中始終存在 ERα免疫陽(yáng)性, 且免疫活性與卵巢發(fā)育階段關(guān)系不大, 推測(cè)其原因?yàn)? (1)濾泡細(xì)胞可能是甲殼動(dòng)物雌二醇和卵黃蛋白原的合成位點(diǎn)或中轉(zhuǎn)位點(diǎn)之一[27—29], 肝胰腺合成的卵黃蛋白原通過(guò)血淋巴運(yùn)輸至濾泡細(xì)胞并進(jìn)行加工, 然后通過(guò)濾泡細(xì)胞將卵黃物質(zhì)間接傳遞給卵母細(xì)胞[6, 30]; (2)由于卵巢發(fā)育過(guò)程中濾泡細(xì)胞中始終存在雌二醇, 因此雌二醇誘導(dǎo)濾泡細(xì)胞中ER的合成, ER可能進(jìn)一步通過(guò)與濾泡細(xì)胞中的雌激素反應(yīng)元件(Estrogen response element, ERE)結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控卵黃蛋白原合成等功能[31]。此外, 整體上河蟹卵巢組織中的 ERα的免疫陽(yáng)性強(qiáng)于 ERβ, 這與哺乳動(dòng)物中的結(jié)果一致, 這可能是由于ERα和ERβ在卵巢發(fā)育過(guò)程中承擔(dān)的生理功能不同造成的[32]。

表2 中華絨螯蟹卵巢發(fā)育期間卵巢和肝胰腺細(xì)胞中的ERβ分布和變化Tab. 2 The distribution and change of ERβ on the ovary and hepatopancreas during the ovarian development of Eriocheir sinensis

甲殼動(dòng)物的肝胰腺不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和儲(chǔ)存器官, 且在生殖內(nèi)分泌方面也扮演著重要的作用[33, 34]。有研究表明河蟹肝胰腺是外源性卵黃發(fā)生期(Ⅲ-Ⅳ期)卵黃蛋白原的主要合成場(chǎng)所, 但尚不清楚肝胰腺中何種細(xì)胞可以合成Vg[30, 35]。本研究結(jié)果表明, ER陽(yáng)性物質(zhì)分布在肝胰腺的F細(xì)胞和R細(xì)胞中, 這可能是因?yàn)镕細(xì)胞和R細(xì)胞均是河蟹外源Vg的合成位點(diǎn), 類(lèi)似的現(xiàn)象已經(jīng)在三疣梭子蟹中被基本證實(shí)[24]。盡管ERα和ERβ在肝胰腺兩種細(xì)胞中的免疫陽(yáng)性均呈先上升后下降趨勢(shì), 但是兩者的免疫陽(yáng)性峰值發(fā)生階段有所不同, ERβ最高峰值出現(xiàn)在Ⅲ期(外源性卵黃合成期, 肝胰腺中大量合成 Vg), 這暗示ERβ在肝胰腺中的免疫陽(yáng)性增強(qiáng)可能與 Vg合成有關(guān)[35]; ERα最高免疫陽(yáng)性出現(xiàn)在Ⅱ期, 此時(shí)肝胰腺處于Vg合成前的準(zhǔn)備階段, 但此階段肝胰腺中無(wú) Vg合成, 其功能由此前的消化吸收和營(yíng)養(yǎng)代謝過(guò)渡到增加了卵巢發(fā)育的調(diào)控功能[19], 因此ERα在肝胰腺中可能不直接參與Vg的合成調(diào)控, 而是通過(guò)其他途徑調(diào)控卵巢發(fā)育。另外, 在卵巢發(fā)育過(guò)程中, 各期肝胰腺的F細(xì)胞和R細(xì)胞中均存在ERα 和ERβ, 這也暗示著這兩種ER在河蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中起著廣泛的生理作用。

3.3 雌激素及ER對(duì)卵巢發(fā)育的作用機(jī)制

眾所周知, 在脊椎動(dòng)物中, 雌激素只有與ER結(jié)合才能行使一系列的生理功能[25]。經(jīng)典的雌激素生殖調(diào)控機(jī)制為ER基因組調(diào)控模式, 它包括配體依賴(lài)途徑和非配體依賴(lài)途徑兩種[36, 37]。配體依賴(lài)途徑(Ligand-dependent) 是指核內(nèi)的ER與配體結(jié)合后, 形成活化的同源二聚體, 該二聚體與核內(nèi)的雌激素反應(yīng)元件(Estrogen response element, ERE)結(jié)合, 由于ERE通常是靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的增強(qiáng)子,因此ER可以通過(guò)與配體結(jié)合參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[38]; 非配體依賴(lài)途徑(Ligand-independent) 是指動(dòng)物體內(nèi)一些多肽激素也能激活ER而促進(jìn)靶基因表達(dá), 如: 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和胞內(nèi)信使類(lèi)似物等[36]。近年來(lái), 非基因組調(diào)控模式在魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物中也被報(bào)道, 非基因組調(diào)控模式也稱(chēng)為膜受體作用模式, 是指雌激素通過(guò)與細(xì)胞膜上的ER結(jié)合后, 在幾分種甚至幾秒內(nèi)直接激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路, 如改變細(xì)胞內(nèi)的cAMP、MAKP和Ca2+等第二信使的濃度, 從而改變細(xì)胞內(nèi)蛋白功能和調(diào)控基因表達(dá), 最終影響卵巢發(fā)育, 這種雌激素受體稱(chēng)之為膜受體(mER)[37]。迄今為止, 有關(guān)雌激素對(duì)甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育的研究主要集中在外源雌激素對(duì)卵巢發(fā)育和卵黃發(fā)生的影響,

有關(guān)其作用機(jī)制尚停留在推測(cè)和探討階段[4, 9, 31]。近 10

年來(lái), 通過(guò)采用哺乳動(dòng)物的ER核受體進(jìn)行免疫組化定位,

已經(jīng)在多種甲殼動(dòng)物的卵巢、肝胰腺、神經(jīng)組織和內(nèi)分泌器官等多種組織中發(fā)現(xiàn) ERα廣泛存在, 且免疫陽(yáng)性強(qiáng)度和卵巢發(fā)育階段有關(guān)[11, 13, 14, 24], 這暗示甲殼動(dòng)物體內(nèi)可能存在 ERα, 且參與了卵巢發(fā)育的調(diào)控[12, 31]。本研究結(jié)果表明, 在河蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中, 卵巢和肝胰腺中始終存在ERα和ERβ的免疫陽(yáng)性, 且肝胰腺中兩者陽(yáng)性強(qiáng)度的變化模式有所不同。這暗示ERα和ERβ可能都參與了河蟹的卵巢發(fā)育調(diào)控, 它們除了促進(jìn) Vg合成外, 可能還具有其他作用, 但ERα和ERβ在河蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中的生理功能可能存在差異。根據(jù)河蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中, 卵巢中的ERα和ERβ的免疫陽(yáng)性由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移, 且免疫陽(yáng)性和卵巢發(fā)育階段密切相關(guān)的事實(shí), 作者推測(cè)河蟹ER對(duì)其卵巢發(fā)育的調(diào)控可能屬于ER核受體的基因組調(diào)控模式。

[1] Nagaraju G P. Reproductive regulators in decapod crustaceans: an overview [J]. The Journal of Experimental Biology, 2011, 214(1): 3—16

[2] Lu J F, Zhao W X. Effect and regulation of reproductive hormones on ovary in decapod crustacean [J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 2001, 10(2): 166—171 [陸劍鋒, 趙維信. 十足目甲殼動(dòng)物生殖激素對(duì)卵巢的作用及其調(diào)控. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 10(2): 166—171]

[3] Janer G, Porte C. Sex steroids and potential mechanisms of non-genomic endocrine disruption in invertebrates [J]. Ecotoxicology, 2007, 16(1): 145—160

[4] Shen B J, Yang X Z, Wu X G, et al. The effects of exogenous 17β-estradiol on ovary development and on the level of endogenous 17β-estradiol in Eriocheir sinensis [J]. Journal of Shanghai Ocean University, 2010, 19(3): 289—295 [沈蓓杰,楊筱珍, 吳旭干, 等. 外源17β-雌二醇對(duì)中華絨螯蟹Ⅲ-Ⅳ期卵巢發(fā)育以及內(nèi)源雌激素水平的影響. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 19(3): 289—295]

[5] Quinitio E, Hara A, Yamauchi K, et al. Changes in the steroid hormone and vitellogenin levels during the gametogenic cycle of the giant tiger shrimp, Penaeus monodon [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 1994, 109(1): 21—26

[6] Lu J F, Chang G L, Wu X G, et al. Hormonal regulations of ovarian development and vitellogenesis in Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) feed on two different diets [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2010, 41(4): 505—512[陸劍鋒, 常國(guó)亮, 吳旭干, 等. 兩組不同飼料對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢發(fā)育及卵黃發(fā)生的激素調(diào)控.海洋與湖沼, 2010, 41(4): 505—512]

[7] Zhao W X, An M. In vitro induction effects of exogenous hormones and eyestalk extracts on the oocytes of Macrobrachium rosenbergii [J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 1996, 5(4): 221—225 [趙維信, 安苗. 外源激素和眼柄提取物對(duì)羅氏沼蝦卵母細(xì)胞的離體誘導(dǎo)作用. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 5(4): 221—225]

[8] Rodríguez E, Medesani D, Greco L, et al. Effects of some steroids and other compounds on ovarian growth of the red swamp crayfish, Procambarus clarkii, during early vitellogenesis [J]. The Journal of Expermental Zoology, 2002, 292(1): 82—87

[9] Yano I, Hoshino R. Effects of 17 ?-estradiol on the vitellogenin synthesis and oocyte development in the ovary of kuruma prawn (Marsupenaeus japonicus) [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2006, 144(1): 18—23

[10] Zhan X Q, Wang X Z, Zhang J H. Progress on estrogen receptor and female reproduction [J]. Progress in Veterinary Medicine, 2005, 26(12): 35—39 [詹曉慶, 王鮮忠, 張家驊.雌激素受體和雌性生殖研究進(jìn)展. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2005, 26(12): 35—39]

[11] Paolucci M, Cristo C D, Cosmo A D. Immunological evidence for progesterone and estradiol receptors in the freshwater crayfish Austropotamobius pallipes [J]. Molecular Reproduction and Development, 2002, 63(1): 55—62

[12] Han S Z, Chen X L, Ye H H, et al. Immunorecognition of estrogen receptor in the optic ganglion of Scylla serrata [J]. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2006, 45(6): 741—742 [韓師昭, 陳學(xué)雷, 葉海輝, 等. 雌激素受體在鋸緣青蟹視神經(jīng)節(jié)的免疫識(shí)別. 廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 45(6): 741—742]

[13] Ye H H, Huang H Y, Li S J, et al Immunorecognition of estrogen and androgen receptors in the brain and thoracic ganglion mass of mud crab, Scylla paramamosain [J]. Progress in Natural Science, 2008, 18(6): 691–695

[14] Yang X Z, Zhao L L, Cheng Y X, et al. Immunolocalization of estrogen receptor α in Neomysis japonica oocytes and follicle cells during ovarian development [J]. Tissue and Cell, 2012, 44(2): 95—100

[15] Wu X G, Cheng Y X, Sui L Y, et al. Biochemical composition of pond-reared and lake-stocked Chinese mitten crab Eriocheir sinensis (H.Milne-Edwards) broodstock [J]. Aquaculture Research, 2007, 38(14): 1459—1467

[16] Wu X G, Wang Z K, Cheng Y X, et al. Effect of dietary phospholipid and highly unsaturated fatty acids on the precocity, survival and growth of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) [J]. Aquaculture Research, 2011, 42(3): 457—468

[17] Wei W, Wei H, Liu Q. Effect of estradiol in hemolymph and gonad on precociousness of Eriocheir sinensis [J]. Journal of Fisheries of China, 2005, 29(6): 862—865 [魏薇, 魏華, 劉青. 中華絨螯蟹體內(nèi)的雌二醇對(duì)性早熟的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2005, 29(6): 862—865]

[18] Xue L Z, Du N S, Lai W. Histology of female reproductive system in Chinese mitten-handed crab, Eriocheir sinensis [J]. Journal of East China Normal University (Natural Science), 1987, (3): 88—97 [薛魯征, 堵南山, 賴(lài)偉. 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) 雌性生殖系統(tǒng)的組織學(xué)研究. 華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1987, (3): 88—97]

[19] Wu X G, Chen H, Liu Z J, et al. Immunorecognition and distribution of progesterone receptors in the Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) during ovarian development [J]. Journal of Shellfish Research, 2014, 33(1): 1—9

[20] Thornton J W. Evolution of vertebrate steroid receptors from an ancestral estrogen receptor by ligand exploitation and serial genome expansions [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(10): 5671—5676

[21] Rong S X. Research Advances on estrogen receptor [J]. Occupational Health & Emergency Rescue, 2005, 23(1): 11—14 [榮順興. 雌激素受體的研究進(jìn)展. 職業(yè)衛(wèi)生與應(yīng)急救援, 2005, 23(1): 11—14]

[22] Wang P, Yang Z J. The related research advances on estrogen receptor [J]. Journal of Chengde Medical College, 2009, 26(1): 68—70 [王陪, 楊振軍. 雌激素的相關(guān)研究進(jìn)展. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 26(1): 68—70]

[23] Zhang J Q, Cai W Q. Research Advances on β-estrogen receptor [J]. Progress In Physiological Sciences, 2001, 32(1): 68—70 [張吉強(qiáng), 蔡文琴. 雌激素β受體的研究進(jìn)展. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2001, 32(1): 68—70]

[24] Liu Z J. The study on the distribution and change of estrogen receptor during the ovarian development and estrogen modulation in vitro ovarian tissue culture of female swimming crab, Portunus trituberculatus [D]. Thesis for the Doctor degree of Shanghai Ocean University, Shanghai. 2013 [劉智俊. 三疣梭子蟹卵巢發(fā)育期間雌激素受體分布變化及雌激素離體調(diào)控的研究. 上海海洋大學(xué)博士論文,上海. 2013]

[25] K?hler H R, Kloas W, Schirling M, et al. Sex steroid receptor evolution and signalling in aquatic invertebrates [J]. Ecotoxicology, 2007, 16(1): 131—143

[26] Dechering K, Boersma C, Mosselman S. Estrogen Receptors alpha and beta Two Receptors of a Kind [J]. Current Medicinal Chemistry, 2000, 7(5): 561—576

[27] Summavielle T, Monteiro P R R, Reis-Henriques M A, et al. In vitro metabolism of steroid hormones by ovary and hepatopancreas of the crustacean Penaeid shrimp Marsupenaeus japonicus [J]. Scientia Marina, 2003, 67(3): 299—306

[28] Cheng Y X, Li S Q, Wang G Z, et al. Structural modulation of the area between oocytes and follicular cells during vitellogensis of the mud crab (Scylla serrata) [J]. Acta Zoologica Sinica, 2002, 48(1): 80—92 [成永旭, 李少菁, 王桂忠, 等. 鋸緣青蟹卵黃發(fā)生期卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)變化. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2002, 48(1): 80—92]

[29] Yang X Z, Wu X G, Yao G G, et al. Ultrastructure of oocytes and follicular cells of Portunus trit uberculatus during the first reproductive cycle [J]. Journal of Fudan University (Natural Sxience), 2007, 6(46): 963—967 [楊筱珍, 吳旭干,姚桂桂, 等. 三疣梭子蟹第一次卵巢發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察. 復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 6(46): 963—967]

[30] Du N S, Lai W, Chen P C, et al. Studies on vitellogenesis of Eriocheir sinesis [J]. Acta Zoologica Sinica, 1999, 45(1): 88—92 [堵南山, 賴(lài)偉, 陳鵬程, 等. 中華絨螯蟹卵黃形成的研究. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 1999, 45(1): 88—92]

[31] Coccia E, Lisa E, Cristo C, et al. Effects of estradiol and progesterone on the reproduction of the freshwater crayfish Cherax albidus [J]. The Biological Bulletin, 2010, 218(1): 36—47

[32] Bai H, Tao Y. Distribution of estrogen receptors in mammalian fetal gonads [J]. Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2010, 42(2): 88—91 [白海, 陶勇. 雌激素受體在哺乳動(dòng)物胎兒性腺中的分布. 畜牧與獸醫(yī), 2010, 42(2): 88—91]

[33] Rosa R, Nunes M. Biochemical changes during the reproductive cycle of the deep-sea decapod Nephrops norvegicus on the south coast of Portugal [J]. Marine Biology, 2002, 141(6): 1001—1009

[34] Wang W, Wu X, Liu Z J, et al. Insights into hepatopancreantic functions of nutrition metabolism and ovarian development in the swimming crab Portunus trituberculatus: gene discovery in the comparative transcriptome of different stage hepatopancreas [J]. PloS ONE, 2014, 9(1): e84921

[35] Li K, Chen L Q, Zhou Z L, et al. The site of vitellogenin synthesis in Chinese mitten-handed crab Eriocheir sinensis [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2006, 143(4): 453—458

[36] Ueda S, Tsuda H, Sato K, et al. Alternative tyrosine phospho-rylation of signaling kinases according to hormone receptor status in breast cancer overexpressing the insulin-like growth factor receptor type 1 [J]. Cancer Science, 2006, 97(7): 597—604

[37] Thomas P C, Tubbs H, Berg G. Sex steroid hormone receptors in fish ovaries [A]. In: Babin P J, Cerdà D J, Lubzens E (Eds.), The Fish Oocyte: From Basic Studies to Biotechnological Applications [C]. Springer Netherlands: Berlin. 2007, 203—233

[38] Klein-Hitpass L, Ryffel G U, Heitlinger E, et al. A 13 bp palindrome is a functional estrogen responsive element and interacts specifically with estrogen receptor [J]. Nucleic Acids Research, 1988, 16(2): 647—663

DISTRIBUTION AND CHANGES OF TWO ESTROGEN RECEPTORS IN THE OVARIES AND HEPATOPANCREAS DURING THE OVARIAN DEVELOPMENT OF CHINESE MITTEN CRAB ERIOCHEIR SINENSIS

LIU Mei-Mei1, WU Xu-Gan1, LIU Zhi-Jun1, CHEN Hao1and CHENG Yong-Xu1, 2
(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Universities Knowledge Service Platform, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

中華絨螯蟹; 雌激素受體; 免疫定位; 卵巢發(fā)育; 肝胰腺

Eriocheir sinensis; Estrogen receptor; Immunolocalization; Ovarian development; Hepatopancreas

圖版Ⅰ 中華絨螯蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中各期卵巢中ER的陽(yáng)性分布PlateⅠ The distribution of positive ER in the ovary during the ovarian development of E. sinensis

圖版Ⅱ 中華絨螯蟹卵巢發(fā)育過(guò)程中各期肝胰腺中ER的陽(yáng)性分布PlateⅡ The distribution of positive ER in the hepatopancreas during the ovarian development of E. sinensis

Q958.8

A

1000-3207(2015)04-0822-09

10.7541/2015.108

2014-09-29;

2015-02-05

863高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A409-5); 上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(13231203504, 13DZ2280500); 上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2012-62-0908)江蘇省科技廳蘇北科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(BN2013007)資助

柳梅梅(1990—), 女, 安徽人; 碩士研究生; 主要從事甲殼動(dòng)物繁殖生物學(xué)的研究。E-mail: 15105517287@163.com

成永旭(1964—), Tel: 021-61900417, E-mail: yxcheng@shou.edu.cn