UPLC法測(cè)定不同基源淫羊藿中11種有效成分的含量*

成麗媛 ，霍香香 ，楊莉 ，張玥 ，2，周昆 ，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim.、箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum（Sieb.etZucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescens Maxim.或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉，巫山淫羊藿為《中國(guó)藥典》單列出的源自淫羊藿屬的中藥，為小檗科植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying的干燥葉，兩者均具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，可用于治療腎陽(yáng)虛衰、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛等癥。其化學(xué)成分主要包括淫羊藿總黃酮類、木質(zhì)素、多糖類成分及生物堿類成分等[1-2]?，F(xiàn)代臨床可用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合征、乳房腫塊、高血壓、早產(chǎn)兒卵巢功能不全等疾病[3-5]。中藥淫羊藿在全國(guó)各地用藥差異大，且存在偽品、混淆品問(wèn)題[6]。

本研究用超高效液相色譜（UPLC）法對(duì)不同基源、共計(jì)23批次的淫羊藿和巫山淫羊藿中所含11種主要成分（包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷I）進(jìn)行含量測(cè)定，并使用主成分分析（PCA）對(duì)3種基源的淫羊藿和巫山淫羊藿進(jìn)行成分含量的對(duì)比分析，為區(qū)分和鑒別藥典收載的不同品種淫羊藿與巫山淫羊藿藥材提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 受試藥 23批次藥材，來(lái)自東北、甘肅、四川等地，其中包括柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿、淫羊藿共19批，以及巫山淫羊藿4批。經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.、朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai和巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying的干燥葉。采收原藥材經(jīng)自然干燥、粉碎、過(guò)篩后，置自封袋中，室溫密封保存?zhèn)溆?。藥材詳?xì)信息見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿樣品信息

1.2 儀器 LC30超高效液相儀（日本島津公司）；Micro 17離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；VORTEXGENIE 2渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；Concentrator plus離心濃縮儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Milli-Q型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 試劑 甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司），甲酸（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）。

箭藿苷A，批號(hào)：18011905；箭藿苷B，批號(hào)：18011907；淫羊藿苷，批號(hào)：18012906；綠原酸，批號(hào)：18071907；新綠原酸，批號(hào)：19042305；隱綠原酸，批號(hào)：19042402；木蘭花堿，批號(hào)：18111302；寶藿苷Ⅰ，批號(hào)：18111903；朝藿定 A，批號(hào)：17022003，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

朝藿定 B，批號(hào)：MUST-16071403；朝藿定 C，批號(hào)：MUST-16070705，以上標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 LC30超高效液相儀（日本島津公司），色譜柱：Shim-pack GISS C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），流速：0.3 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積 5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 270nm。洗脫梯度：0～4min，2%～5%B；4～12min，5%B；12～15 min，5%～25.2%B；15～23 min，25.2%B；23～25 min，25.2%～30%B；25～28 min，30%～40%B。28～32 min，40%～60%B；32～33 min，60%～2%B，33～45 min，2%B。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I、箭藿苷A、箭藿苷B、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、淫羊藿苷、木蘭花堿約1 mg，加甲醇，渦旋振蕩，配制成濃度為1 mg/mL的對(duì)照品母液。精確吸取各對(duì)照品母液適量，加甲醇配置成含綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A 10 μg/mL，含朝藿定 B、箭藿苷 A、箭藿苷 B、寶藿苷 I 20 μg/mL，含朝藿定 C、淫羊藿苷50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，4℃冰箱存儲(chǔ)備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取淫羊藿粗粉0.2 g于錐形瓶中，加70%乙醇20 mL，稱質(zhì)量，超聲提取30 min，放至室溫，補(bǔ)足失重，搖勻，取上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，稀釋5倍，4℃冰箱存儲(chǔ)備用。

2.3 多指標(biāo)成分含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.3.1 特異性考察 11種對(duì)照品溶液和淫羊藿樣品UPLC色譜圖見(jiàn)圖1。通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間對(duì)比，確定淫羊藿樣品色譜圖中1～11號(hào)色譜峰分別為：新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷 I。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋 2、5、10、25、50、100倍得7個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”色譜條件分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），計(jì)算各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。11種化合物線性方程見(jiàn)表2，11種成分的相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，此結(jié)果表明11種成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷I的RSD值分別為2.54%，1.44%，4.01%，0.25%，0.25%，0.13%，0.19%，0.18%，1.91%，0.60%，0.93%，表明該方法精密度良好。2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下，分別在 0、3、6、9、12、24、48 h 進(jìn)樣，計(jì)算各成分峰面積的RSD值。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷I的RSD值分別為0.47%，0.51%，1.36%，4.52%，0.48%，0.09%，0.69%，0.18%，1.55%，3.22%，1.65%，表明供試品溶液在48 h穩(wěn)定性良好。

圖1 對(duì)照品和淫羊藿樣品色譜圖

表2 11種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分峰面積的RSD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為溶液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷I的RSD值分別為2.88%，2.79%，3.44%，2.93%，3.13%，3.14%，3.04%，3.28%，4.85%，1.86%，3.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知各成分含量的同一供試品溶液1 mL，加入等量各成分與樣品濃度相等的混合對(duì)照品溶液，平行配制6份，在“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各成分的加樣回收率和RSD值。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷I的平均加樣回收率分別為99.97%、88.67%、98.37%、103.78%、91.99%、104.46%、97.84%、101.90%、102.67%、95.97%、102.59%；RSD值分別為 8.34%、9.44%、8.19%、15.23%、8.21%、6.50%、5.24%、6.62%、2.47%、4.18%、7.25%。

2.4 淫羊藿樣品多指標(biāo)成分含量測(cè)定 3種基源的淫羊藿和巫山淫羊藿、共計(jì)23個(gè)批次樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木蘭花堿、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、箭藿苷A、箭藿苷B、寶藿苷I成分各百分含量結(jié)果見(jiàn)圖 2。使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)23批次淫羊藿樣品各成分含量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 23個(gè)批次淫羊藿和巫山淫羊藿中11種成分的百分含量

在不同基源樣品的11個(gè)成分中，綠原酸含量在朝鮮淫羊藿與柔毛淫羊藿中有顯著性差異（P＜0.05），與淫羊藿相比有亦顯著性差異（P＜0.01）；朝藿定C在巫山淫羊藿中含量最高，在朝鮮淫羊藿中朝藿定C含量最低，其次為淫羊藿、柔毛淫羊藿，朝鮮淫羊藿和淫羊藿與巫山淫羊藿相比均有顯著差異（P＜0.05），柔毛淫羊藿與朝鮮淫羊藿相比亦有顯著性差異（P＜0.05）；寶藿苷I在柔毛淫羊藿與巫山淫羊藿相比存在顯著性差異（P＜0.05）。此外，朝藿定C在巫山淫羊藿和柔毛淫羊藿中的含量普遍高于淫羊藿苷含量，與淫羊藿和朝鮮淫羊藿恰好相反。不同基源的淫羊藿樣品中以上11種主要成分含量詳細(xì)見(jiàn)表3。

表3 不同基源淫羊藿藥材中各成分含量 mg/g

9批淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的總量為0.27～2.84%，3批柔毛淫羊藿中的質(zhì)控成分總量為2.91～3.54%；7批朝鮮淫羊藿中的質(zhì)控成分總量為0.65～2.05%。

2.5 樣品的主成分分析 對(duì)23批淫羊藿藥材11個(gè)成分含量采用主成分分析（PCA）進(jìn)行降維處理，第一組主成分PC1的貢獻(xiàn)率為37.8%，第2組主成分PC2的貢獻(xiàn)率為27.7%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率為65.5%，可作為不同基源淫羊藿之間對(duì)比分析指標(biāo)。PCA分析顯示，巫山淫羊藿與柔毛淫羊藿相似度較高，僅從目前檢測(cè)的成分來(lái)說(shuō)難以區(qū)分，而這兩者與朝鮮淫羊藿差異明顯，可以進(jìn)行區(qū)分；淫羊藿則正好居于其他3種之間。

3 討論

淫羊藿含有的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等成分具有骨保護(hù)作用、心血管系統(tǒng)保護(hù)作用和生殖系統(tǒng)保護(hù)作用等，臨床多用于治療骨質(zhì)疏松等癥[7-12]，綠原酸類成分主要具有抗菌、抗病毒及抗炎、抗氧化等作用[13-14]。目前藥典中收載的淫羊藿藥材有不同基源，而淫羊藿藥材真?zhèn)位煊矛F(xiàn)象使得用藥劑量與藥效關(guān)系成為一個(gè)問(wèn)題，若臨床用藥劑量一致，而主要藥效成分的含量明顯不同，必定會(huì)造成療效的差異。因此，有必要進(jìn)一步合理規(guī)范淫羊藿藥材的分類及用量與用途的關(guān)系，以保證其臨床療效。

圖3 4種基源淫羊藿的主成分分析圖

本文針對(duì)目前存在的不同基源淫羊藿的分類問(wèn)題，采用PCA法對(duì)19批淫羊藿和4批巫山淫羊藿中11種成分的含量進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)分析比較，不同批次、不同基源的淫羊藿的有效成分存在差異。巫山淫羊藿與柔毛淫羊藿較為相似，但與朝鮮淫羊藿有明顯差異，淫羊藿則與其他3種基源淫羊藿之間均產(chǎn)生交叉，不易區(qū)分。這一結(jié)果可一定程度反應(yīng)藥典將幾個(gè)基源的淫羊藿藥材歸屬變化的內(nèi)在道理。

研究結(jié)果顯示，朝鮮淫羊藿藥材中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的總量為0.65～2.05%，含量較其他基源的淫羊藿藥材較低，這與2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定一致，同時(shí)PCA分析結(jié)果也顯示，朝鮮淫羊藿藥材與其他基源藥材存在明顯差異。另外，柔毛淫羊藿藥材中朝藿定C含量為1.55～2.16%，遠(yuǎn)高于淫羊藿中朝藿定C的0.14～0.82%，和朝鮮淫羊藿藥材中朝藿定C的0.15～0.26%。且PCA分析結(jié)果顯示柔毛淫羊藿與淫羊藿、朝鮮淫羊藿差異較大，與巫山淫羊藿相似度較高。根據(jù)此次結(jié)果，建議單獨(dú)為柔毛淫羊藿制定質(zhì)控指標(biāo)，當(dāng)然，這還需要更多藥學(xué)、藥理學(xué)和臨床研究的支持證明。此外，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿和巫山淫羊藿藥材中朝藿定C、寶藿苷I和綠原酸等含量差異較大，對(duì)這些差異性成分進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)定可進(jìn)一步合理規(guī)范淫羊藿藥材的品種篩選，完善淫羊藿藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)上述分析比較得出，不同批次、不同基源淫羊藿的有效成分存在一定差異，針對(duì)淫羊藿存在混用現(xiàn)象，且質(zhì)量控制難的問(wèn)題，應(yīng)對(duì)不同基源的淫羊藿進(jìn)行更加系統(tǒng)的質(zhì)量分析，完善不同基源淫羊藿的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本研究可以為淫羊藿藥材的合理分類和質(zhì)量控制提供一定的參考。