YTHDF2通過(guò)誘導(dǎo)IGFBP7的mRNA衰變激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的研究

刁新峰，李新茂，候 亮，魏志玄

1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 南陽(yáng) 473000；2.武安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 武安 056300

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤之一，占腦部腫瘤的80%以上［1］。盡管可采用手術(shù)和放化療等多模式綜合治療，但GBM患者的預(yù)后仍然較差［2］。GBM形成和發(fā)展過(guò)程中的復(fù)雜分子變化使得識(shí)別參與GBM病理生理學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵靶點(diǎn)具有重要意義。

表觀遺傳修飾與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，RNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是一種可逆的動(dòng)態(tài)表觀遺傳學(xué)改變［3］。據(jù)研究［4］報(bào)道，YTHDF2作為m6A修飾過(guò)程的重要識(shí)別蛋白，能夠?qū)Y(jié)合m6A修飾的RNA進(jìn)行識(shí)別，進(jìn)而促進(jìn)RNA降解，如YTHDF2通過(guò)識(shí)別m6A甲基化調(diào)節(jié)的OCT4基因進(jìn)而影響OCT4的mRNA表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。YTHDF2可能通過(guò)靶向不同基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物對(duì)不同的癌癥發(fā)揮作用，而YTHDF2及其新靶點(diǎn)在GBM發(fā)展中的作用仍需要進(jìn)一步闡明。胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）能夠參與細(xì)胞生長(zhǎng)，并受一組IGF結(jié)合蛋白及其受體調(diào)控，IGF結(jié)合蛋白7（IGF binding protein 7，IGFBP7）是一種分泌性蛋白，可作為IGF依賴(lài)和非依賴(lài)的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)而發(fā)揮作用［5］。IGFBP7被發(fā)現(xiàn)在GBM中表達(dá)顯著降低，具有腫瘤抑制特性［6］。然而，IGFBP7在GBM中的分子機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在探討YTHDF2是否通過(guò)影響m6A修飾的方式調(diào)節(jié)IGFBP7的mRNA穩(wěn)定性，明確YTHDF2在GBM進(jìn)展中的重要作用及其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

人GBM細(xì)胞系（LN229和U251細(xì)胞）和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系（NHA細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。100 μg/mL鏈霉素-100 U/mL青霉素混合溶液購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司。LipofectamineTM3000試劑購(gòu)自賽因百奧生物技術(shù)（北京）有限公司。RIPA裂解緩沖液購(gòu)自上海尚寶生物科技有限公司。放線菌素D和二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)祖生物科技有限公司。YTHDF1、IGFBP1、p-磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、PI3K、p-蛋白激酶B（protein kinase，AKT）、AKT、β-actin、m6A、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和HRP結(jié)合的二級(jí)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。超敏型電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）底物試劑盒購(gòu)自上海炎熙生物科技有限公司。TRIzol試劑購(gòu)自上海博湖生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。YTHDF2、IGFBP7和GAPDH的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。SYBR Green Realtime PCR Master Mix購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。PolyATtract?mRNA純化系統(tǒng)購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）試劑盒購(gòu)自廣州伯信生物科技有限公司。MeRIP試劑盒購(gòu)自上海玉博生物科技有限公司。碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京盛科信德科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

GEPIA網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn）用于預(yù)測(cè)基因在GBM中的表達(dá)水平及相關(guān)性分析。GSCA網(wǎng)站（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/）用于預(yù)測(cè)基因在GBM中可能參與的生物學(xué)過(guò)程。CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cgga.org.cn）用于預(yù)測(cè)YTHDF2的表達(dá)水平與GBM患者臨床特征的相關(guān)性。從UALCAN網(wǎng)站（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）獲取與YTHDF2在GBM具有負(fù)相關(guān)性的基因。從StarBase網(wǎng)站（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）獲取可與YTHDF2結(jié)合的mRNA。通過(guò)RMVAR數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rmvar.renlab.org/index.html）預(yù)測(cè)IGFBP7的m6A修飾位點(diǎn)及識(shí)別蛋白。LinkedOmics網(wǎng)站（http://www.linkedomics.org/admin.php）用于預(yù)測(cè)YTHDF2與PTEN在GBM中表達(dá)的相關(guān)性。

1.3 樣本采集

從2020年3月—2021年3月于南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院確診為GBM的患者中收集40對(duì)腫瘤組織及匹配的癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣≥2 cm）。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療等治療。手術(shù)結(jié)束后，立即將組織冷凍在液氮中，于-80 ℃保存。本研究得到南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者在研究開(kāi)始前均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

LN229、U251和NHA細(xì)胞均保存在DMEM培養(yǎng)基中，添加10%FBS和100 μg/mL鏈霉素-100 U/mL青霉素混合溶液，細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的加濕培養(yǎng)箱中。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

構(gòu)建并合成靶向YTHDF2的小干擾RNA（si-YTHDF2）、siRNA陰性對(duì)照（si-NC）、IGFBP7 shRNA（shIGFBP7）和shRNA陰性對(duì)照（shRNA）。將U251細(xì)胞接種在96孔板中，待細(xì)胞融合至80%，將上述siRNA或shRNA通過(guò)LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸浮在含有10%FBS的磷酸緩沖鹽溶（phosphate-buffered saline，PBS）中，在室溫下將細(xì)胞固定在無(wú)水乙醇中24 h。在室溫下以3 000×g離心30 s，棄上清液。將細(xì)胞懸浮在100 μL RNase A溶液（1 mg/mL）中，在37 ℃下消化10 min。在黑暗中使用400μL PI（50 μg/mL）在室溫下對(duì)細(xì)胞染色10 min，采用流式細(xì)胞術(shù)分析G0/G1、S和G2/M期細(xì)胞的比例。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化。將轉(zhuǎn)染后的U251細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后在室溫下以1000×g離心5 min。棄上清液，將細(xì)胞重新懸浮在200 μL結(jié)合緩沖液中。用10 μL膜聯(lián)蛋白Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在4 ℃避光條件下培養(yǎng)30 min。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并使用CXP2.1軟件進(jìn)行分析。通過(guò)早期和晚期凋亡細(xì)胞的百分比計(jì)算凋亡率。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

使用RIPA裂解緩沖液從組織和細(xì)胞中分離總蛋白，使用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。50 μg蛋白質(zhì)裂解物經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉 在室溫下封閉1h。將蛋白條帶與YTHDF1（1∶1000）、IGFBP1（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、AKT（1∶1000）和β-actin（1∶1000）抗體在4 ℃下溫育過(guò)夜。棄一抗，加入含吐溫-20磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffed saline with Tween-20，PBST）洗滌3次。在室溫下與HRP結(jié)合的二級(jí)抗體（1∶2000）溫育2 h。通過(guò)超敏型ECL底物試劑盒顯色，使用Image Lab軟件進(jìn)行定量分析。

1.9 RIP實(shí)驗(yàn)

使用RIP試劑盒進(jìn)行RIP分析。IP裂解緩沖液用于裂解U251細(xì)胞。細(xì)胞裂解物與涂有5 μg特異性抗體（YTHDF2抗體或IgG抗體）的磁珠在4 ℃下溫育過(guò)夜。洗滌后，裂解物用蛋白酶K消化，純化與免疫沉淀蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA。使用RTFQPCR測(cè)定IGFBP7的mRNA表達(dá)水平。

1.10 mRNA穩(wěn)定性檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染si-NC或si-YTHDF2的U251細(xì)胞接種于6孔板中，用放線菌素D（5 μg/mL）處理細(xì)胞0、3或6 h。通過(guò)RTFQ-PCR測(cè)定IGFBP7的mRNA表達(dá)水平。

1.11 RTFQ-PCR

使用TRIzol試劑從GBM組織和細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix進(jìn)行RTFQ-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參。相對(duì)表達(dá)水平使用2－ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)中使用的PCR引物序列如下：YTHDF2的上游引物序列為5′-CATGAATGGGAAGGGTCCCG-3′，下游引物序列為5′-GACGAATGTGTCGCAGT TGG-3′；IGFBP7的上游引物序列為5′-TGG AACAAGGTAAAAAGGGGT-3′，下游引物序列為5′-TGGTATTTCATGTAAGGCATAC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CGCTCTGCTCC TGTTTC-3′，下游引物序列為5′-ATCCGTT GATCCGACCTTCAC-3′。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較兩組之間的差異。方差分析或Kruuskal-Wallis檢驗(yàn)用于多組間的比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YTHDF2在GBM組織和細(xì)胞中高表達(dá)

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估正常和GBM樣本中m6A識(shí)別蛋白（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2）的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與正常大腦組織樣本相比，GBM組織樣本中的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3表達(dá)較高（圖1A）。在GSCA網(wǎng)站對(duì)YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2在GBM進(jìn)展中參與的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，僅YTHDF2在GBM中參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程（圖1B）。此外，在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)得到Y(jié)THDF2的表達(dá)與GBM患者的組織學(xué)分級(jí)（P=9.8×10-38）、世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級(jí)（P＝1.8×10-24）和IDH突變（P＝2×10-10）顯著相關(guān)（圖1C）。RTFQ-PCR和Western blot顯示，與正常組相比，GBM組織中的YTHDF2表達(dá)水平顯著升高（圖1D、1E，P＜0.05），與NHA細(xì)胞相比，LN229和U251細(xì)胞中的YTHDF2也呈高表達(dá)（P均＜0.05，圖1F）。由于YTHDF2在U251細(xì)胞中的表達(dá)最為顯著，因此選用U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 YTHDF2在GBM組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)Fig.1 The expression of YTHDF2 is up-regulated in GBM tissue and cells

2.2 敲減YTHDF2可誘導(dǎo)GBM細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡

為探究YTHDF2在GBM細(xì)胞中的作用，用si-YTHDF2和si-NC轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞。與si-NC組相比，si-YTHDF2組的YTHDF2表達(dá)降低（P＜0.05，圖2A）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞的細(xì)胞周期，si-YTHDF2組較si-NC組的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期減少（P＜0.05，圖2B、2C）。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC組相比，si-YTHDF2組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05，圖2D、2E），

圖2 敲減YTHDF2可誘導(dǎo)GBM細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡Fig.2 Knockdown of YTHDF2 can induce GBM cell cycle arrest and apoptosis

2.3 YTHDF2能夠識(shí)別m6A修飾的IGFBP7進(jìn)而促進(jìn)其降解

為探究YTHDF2的下游靶點(diǎn)，將StarBase網(wǎng)站獲取的可與YTHDF2結(jié)合的mRNA與UALCAN網(wǎng)站獲取的與YTHDF2在GBM具有負(fù)相關(guān)性的基因取交集（圖3A），結(jié)果為CYBA、TMEM223、RNASEK、IGFBP7、ATP6V0E1和PNKD，將IGFBP7納入本研究。RTFQ-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IGFBP7在GBM組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均低于癌旁組織和NHA細(xì)胞（P均＜0.05，圖3B、3C）。在RMVAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到IGFBP7上存在多個(gè)m6A修飾位點(diǎn)，其中YTHDF2可作為RBP識(shí)別IGFBP7的m6A修飾位點(diǎn)（圖3D）。RIP分析證實(shí)了U251細(xì)胞中YTHDF2和IGFBP7 mRNA之間的相互作用（P＜0.05，圖3E）。此外，敲減YTHDF2可增加U251細(xì)胞中IGFBP7的mRNA表達(dá)和蛋白水平（P均＜0.05，圖3F～3H）。對(duì)U251細(xì)胞進(jìn)行mRNA穩(wěn)定性分析，與si-NC組細(xì)胞相比，si-YTHDF2組細(xì)胞中IGFBP7的中位半衰期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05，圖3I）。

圖3 YTHDF2識(shí)別m6A修飾的IGFBP7進(jìn)而促進(jìn)IGFBP7降解Fig.3 YTHDF2 promotes the degradation of IGFBP7 via recognizing m6A modified IGFBP7

2.4 下調(diào)IGFBP7可部分地挽救敲減YTHDF2對(duì)GBM細(xì)胞周期分布和凋亡的調(diào)控作用

進(jìn)一步研究YTHDF2調(diào)控IGFBP7在GBM細(xì)胞活性中的潛在作用。首先采用RTFQ-PCR確認(rèn)IGFBP7在si-YTHDF2+shIGFBP7組細(xì)胞中的表達(dá)較si-YTHDF2+shNC組降低（P＜0.05，圖4A）。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-YTHDF2+shNC組相比，si-YTHDF2+shIGFBP7組細(xì)胞在G0/G1期比例減少。在細(xì)胞分裂的S和G2/M期，si-YTHDF2+shIGFBP7組細(xì)胞增加（P＜0.05，圖4B、4C）。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，與轉(zhuǎn)染shNC的細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率在轉(zhuǎn)染shIGFBP7后明顯降低（P＜0.05，圖4D、4E）。上述結(jié)果表明，抑制IGFBP7可部分地挽救敲減YTHDF2誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞周期阻滯和凋亡增加。

圖4 下調(diào)IGFBP7可部分挽救敲減YTHDF2對(duì)GBM細(xì)胞周期分布和凋亡的調(diào)控作用Fig.4 Downregulation of IGFBP7 could partially rescue the regulatory effects of YTHDF2 knockdown on GBM cell cycle distribution and apoptosis

2.5 YTHDF2通過(guò)抑制IGFBP7誘導(dǎo)PI3K/AKT活化

由圖1B得知，YTHDF2可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)GBM的發(fā)生。在GEPIA和LinkedOmics網(wǎng)站得到IGFBP7與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因PIK3CA在GBM中顯著負(fù)相關(guān)，而與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)調(diào)節(jié)因子PTEN正相關(guān)（圖5A、5B）。在U251細(xì)胞中用Western blot檢測(cè)p-AKT、AKT、p-PI3K和PI3K蛋白水平，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IGFBP7可降低p-AKT和p-PI3K的蛋白水平，抑制IGFBP7則相反（P均＜0.05）。進(jìn)一步分析YTHDF2和IGFBP7是否能調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，結(jié)果表明，p-AKT和p-PI3K的蛋白水平因敲減YTHDF2而顯著降低，因抑制IGFBP7而部分恢復(fù)（P均＜0.05，圖5E、5F）。上述數(shù)據(jù)表明，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能由YTHDF2通過(guò)IGFBP7進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3 討 論

RNA的m6A修飾是研究GBM的一個(gè)新興領(lǐng)域［7］。先前研究［8］表明，m6A“寫(xiě)入器”、“擦除器”和“識(shí)別器”的表達(dá)與GBM的惡性進(jìn)展和預(yù)后高度相關(guān)。本研究中，作為m6A“識(shí)別器”的YTHDF2在GBM組織和細(xì)胞中表達(dá)升高。敲減YTHDF2基因能夠通過(guò)提高IGFBP7的mRNA表達(dá)，抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)GBM細(xì)胞周期阻滯和凋亡率升高。

據(jù)研究［9］報(bào)道，YTHDF2對(duì)GBM細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤的發(fā)生具有促進(jìn)作用。YTHDF2通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中的靶mRNA穩(wěn)定性降低來(lái)執(zhí)行其功能，如YTHDF2介導(dǎo)腫瘤抑制因子的mRNA降解，促進(jìn)前列腺癌的惡性進(jìn)展［10］。YTHDF2下調(diào)IRS1的mRNA水平在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用［11］。本研究借助一系列生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)YTHDF2在GBM中表達(dá)升高，并通過(guò)RTFQ-PCR和Western blot得以證實(shí)。通過(guò)CSCA網(wǎng)站預(yù)測(cè)YTHDF2可能參與調(diào)控GBM細(xì)胞周期進(jìn)展和凋亡過(guò)程，本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，敲減YTHDF2在GBM細(xì)胞中的表達(dá)可有效地抑制GBM細(xì)胞的周期分布，增加細(xì)胞凋亡，提示YTHDF2可作為GBM中的有效治療靶點(diǎn)。

借助StarBase和UALCAN網(wǎng)站獲取YTHDF2可特異性結(jié)合的mRNA和與YTHDF2在GBM中具有負(fù)相關(guān)性的基因，篩選得到IGFBP7。IGFBP7先前被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中充當(dāng)腫瘤抑制因子發(fā)揮作用［12-14］。研究［15］表明，IGFBP7在GBM中的低表達(dá)與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。IGFBP7在GBM組織和細(xì)胞系中的低表達(dá)水平通過(guò)RTFQPCR得到證實(shí)。在RMVAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到Y(jié)THDF2可識(shí)別IGFBP7的m6A修飾位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RIP分析證實(shí)YTHDF2可特異性地結(jié)合GBM細(xì)胞中的IGFBP7，敲減YTHDF2可有效地提高IGFBP7的mRNA穩(wěn)定性。功能性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，敲減YTHDF2對(duì)GBM細(xì)胞周期分布的抑制和凋亡的促進(jìn)可通過(guò)敲減IGFBP7實(shí)現(xiàn)部分消除，表明YTHDF2通過(guò)抑制IGFBP7的表達(dá)在GBM中發(fā)揮促癌作用。此外，CSCA網(wǎng)站還顯示，YTHDF2可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與GBM進(jìn)程。既往研究［16］表明，m6A水平的降低激活致癌的PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性表型。抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可抑制GBM細(xì)胞增殖和耐藥性增加［17］。本研究采用Western blot檢測(cè)證實(shí)，敲減YTHDF2可降低p-PI3K和p-AKT的蛋白水平。IGFBP7先前被報(bào)道可抑制PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［18］。IGFBP7抑制甲狀腺癌中的AKT活性來(lái)抑制癌細(xì)胞增殖［19］。此外，GEPIA和LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，IGFBP7與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因PIK3CA在GBM中顯著負(fù)相關(guān)，而與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路負(fù)調(diào)節(jié)因子PTEN呈正相關(guān)［20］。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IGFBP7可降低p-PI3K和p-AKT蛋白水平，敲減IGFBP7則相反。此外，下調(diào)IGFBP7可部分地挽救因敲減YTHDF2降低的p-PI3K和p-AKT蛋白水平，提示YTHDF2可能通過(guò)抑制IGFBP7激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)GBM進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)的局限性在于未對(duì)YTHDF2在GBM中的作用展開(kāi)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。此外，下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用也有待進(jìn)一步探索。本研究證實(shí)，敲減YTHDF2可通過(guò)識(shí)別m6A修飾的IGFBP7，降低其mRNA的穩(wěn)定性，阻斷PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，抑制GBM細(xì)胞周期分布，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)初步闡明了m6A“識(shí)別器”調(diào)控GBM腫瘤發(fā)生的潛在機(jī)制，有望為GBM的有效治療提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。中國(guó)癌癥雜志,2020,30(5):328-334.