SRSF1通過調(diào)控VEGFA mRNA可變剪接促進食管鱗狀細胞癌Eca9706細胞增殖、侵襲和遷移

段玉青，夏 寧，賈云瀧，鄭文雅，劉麗華

河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤免疫科，河北 石家莊 050035

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，也是導致腫瘤相關死亡的主要原因［1］。食管癌的病理學類型主要分為食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）和食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）［2］。中國是食管癌高發(fā)地區(qū)，主要病理學類型為ESCC，占所有食管癌類型的90%［3］。ESCC具有高度侵襲性等惡性臨床特征，易出現(xiàn)腫瘤局部復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移［4］，其5年生存率為25%～30%［5］。因此，研究ESCC的惡性生物學行為及其機制，對探索ESCC的新診斷方法和治療靶點具有重要意義。

可變剪接是前體mRNA通過選擇不同的剪接位點進行剪接調(diào)控，從而產(chǎn)生不同mRNA剪接異構體的過程，是調(diào)節(jié)基因和蛋白表達的重要機制［6］?；蚣艚诱{(diào)控的紊亂與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［7-8］。絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1（serine/arginine-rich splicing factor 1，SRSF1）屬于可變剪接因子家族成員，可通過調(diào)控腫瘤相關基因可變剪接影響腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［9-10］。但SRSF1在食管癌中的作用及其分子機制罕見報道。因此，本研究檢測SRSF1在ESCC組織和細胞系中的表達，并通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術降低SRSF1表達水平，進一步研究其對ESCC細胞增殖、侵襲和遷移的影響，并初步探討SRSF1在ESCC中的作用機制，旨在為ESCC的診斷和治療提供新的信息。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

隨機選取2020年1月—2021年12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院行根治性切除術的40例ESCC患者的癌及癌旁組織（取自距離癌灶邊緣5 cm以外）標本。納入標準：患者術前未行任何抗腫瘤治療，并于術后經(jīng)病理學檢查確診為ESCC。本研究患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗材料、試劑

人ESCC細胞系Eca9706、Kyse170、TE1、Yes-2和Kyse150來自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院東院科研中心。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。TRIzol試劑購自北京索萊寶科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）Mix購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。SRSF1、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、VEGFA Iso8a、VEGFA Iso8b、GADPH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司。LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑購自大連美侖生物技術有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。SRSF1和β-actin抗體購自英國Abcam公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自北京西美杰科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色

用4%多聚甲醛溶液固定標本，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗?？乖迯秃蟛捎蒙窖蜓宸忾]液室溫封閉20 min，直接加入SRSF1特異性抗體（1∶100），4 ℃冰箱過夜。第2天，室溫下放置30 min，滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃溫育60 min，PBS清洗3次，DAB顯色，蘇木精復染及脫水，中性樹膠封片。采用兩級評分法進行判定。根據(jù)染色細胞計數(shù)百分比 ＜1%、1%～10%、10%～50%、50%～80%、＞80%分別判定為0、1、2、3、4分；根據(jù)染色強度按無著色、淡黃色、棕黃色、褐棕色分別判定為0、1、2、3分。根據(jù)兩項積分之和判定結果，0～3分為陰性，4～7分為陽性。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)ESCC細胞，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)細胞，視細胞生長情況換液，待細胞生長至80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗研究。

1.3.3 RTFQ-PCR檢測ESCC細胞中SRSF1、VEGFA Iso8a和Iso8b的表達水平

TRIzol試劑提取ESCC細胞系Eca9706、Kyse170、TE1、Yes-2及Kyse150細胞的總RNA，以1 μg總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件為：40 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，75 ℃5 min。后以1 μL cDNA配置RTFQ-PCR體系，GAPDH作為內(nèi)參，SRSF1上游引物序列為5′-AGGAGGATTGAGGAGGATCAG-3′，下游引物序列為5′-CGCTCCATGAATCCTGGTAA-3′。VEGFA Iso8a上游引物序列為5′-TTCCTGC AAAAACACAGACTCGC-3′，下游引物序列為5′-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′。VEGFA Iso8b上游引物序列為5′-TTCCTGCAAAAAC ACAGACTCGC-3′，下游引物序列為5′-TC AGTCTTTCCTGGTGAGAGATCTGCA-3′。GAPDH上游引物序列為5′-GGACCTGACCTG CCGTCTAG-3′，下游引物序列為5′-GTAGCCC AGGATGCCCTTGA-3′。RTFQ-PCR擴增條件設定為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 32 s，共40個循環(huán)。擴增結束后，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.3.4 細胞轉(zhuǎn)染

篩選ESCC細胞系中SRSF1高表達的ESCC細胞株進行后續(xù)研究。取對數(shù)生長期的Eca9706細胞接種于6孔板中，1×105個/孔，培養(yǎng)24 h后分為轉(zhuǎn)染組（siRNA-SRSF1組）及空白對照組（siRNA-NC組）。SRSF1干擾片段分別命名為實驗組siRNA-SRSF1（5′-GCUAUGAUUACGAUGGGUATT-3′）和對照組siRNA-NC（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU TT-3′）。將LipofectamineTM2000及siRNA-SRSF1以5 μL∶5 μL的比例形成轉(zhuǎn)染試劑混合物，轉(zhuǎn)染至Eca9706細胞中，并分別轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000和siRNA-NC形成轉(zhuǎn)染復合物作為對照組。

1.3.5 RTFQ-PCR和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）實驗檢測SRSF1轉(zhuǎn)染效率

上述1.3.4轉(zhuǎn)染的Eca9706細胞置于培養(yǎng)箱中5 h，棄去含轉(zhuǎn)染復合物的無血清培養(yǎng)基，加入含血清新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后提取各組細胞內(nèi)的總RNA，采用RTFQ-PCR檢測各組細胞中的SRSF1 mRNA表達，48 h后提取各組細胞內(nèi)的總蛋白，采用Western blot檢測各組細胞中的SRSF1蛋白水平。

1.3.6 CCK-8法檢測細胞增殖能力

制備轉(zhuǎn)染后24 h各組Eca9706細胞懸液，分為對照組和實驗組，以1×103個/孔接種于96孔板中，每組設4個平行復孔，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下連續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72及96 h。每個檢測時間點加入10 μL/孔的CCK-8試劑，培養(yǎng)1 h后用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度（D）值。

1.3.7 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

Transwell小室模型置于24孔板中，將轉(zhuǎn)染細胞懸浮于無血清的細胞培養(yǎng)液中，于小室的上層加入4×104個細胞/200 μL，下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組細胞重復2個小室。在37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦凈上室細胞，PBS清洗后，用4%多聚甲醛溶固定30 min，用0.1%結晶紫染色30 min，沖洗后晾干，在顯微鏡下觀察并拍照，比較實驗組和對照組細胞遷移數(shù)量。

1.3.8 Matrigel基質(zhì)膠實驗檢測細胞侵襲能力

以不含血清的DMEM培養(yǎng)基1 ∶7 稀 釋Matrigel基質(zhì)膠后，加入20 μL到預冷的Transwell上室，于37 ℃培養(yǎng)箱中放置約2 h使Matrigel基質(zhì)膠凝固。后續(xù)實驗操作步驟與1.3.7相同。

1.3.9 Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后Eca9706細胞中SRSF1的蛋白水平

轉(zhuǎn)染步驟同1.3.4，48 h后收取實驗組和對照組的細胞懸液，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g離心30 min，取上清液，采用二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，后將樣品進行12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h，加入一抗SRSF1/β-actin（1∶1 000），在4 ℃環(huán)境下溫育過夜，含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（Tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，加入二抗（1∶10 000），37 ℃溫育1 h，采用電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）進行放射顯影。β-actin作為內(nèi)參蛋白，與各個檢測蛋白條帶的灰度值之比表示蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。采用GraphPad Prism 8對實驗數(shù)據(jù)進行相關圖片的繪制。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SRSF1在ESCC組織和細胞系中的表達水平

免疫組織化學染色結果顯示，ESCC組織中SRSF1表達水平明顯高于癌旁組織（P=0.013 6），提示SRSF1在ESCC中可能發(fā)揮致癌作用（圖1A和表1）。進一步采用RTFQ-PCR（圖1B）和Western blot（圖1C）檢測，結果顯示，SRSF1 mRNA表達和蛋白水平在ESCC Eca9706細胞系中最高，其次分別為Kyse170、TE1、Yes-2、Kyse150（F=593.2，P＜0.01vsF=4.944，P=0.0185）。鑒于Eca9706細胞的表達水平最高，遂選用Eca9706細胞系進行后續(xù)實 驗。

表1 ESCC組織和癌旁組織中SRSF1染色水平Tab.1 Expression of SRSF1 staining between ESCC tissues and matched paracancerous tissues ［n（%）］

圖1 SRSF1在ESCC組織和細胞中表達水平Fig.1 Expression level of SRSF1 in ESCC tissues and cells

2.2 成功構建SRSF1低表達的ESCC Eca9706細胞系

siRNA沉默ESCC Eca9706細胞中的SRSF1基因表達，RTFQ-PCR（圖2A）和Western blot（圖2B）檢測結果顯示，與siRNA-NC組比較，siRNA-SRSF1組Eca9706細胞中的SRSF1 mRNA表達和蛋白水平均顯著降低（t=36.91，P=0.000 7vst=5.031，P=0.007 3），提示本研究成功構建了SRSF1低表達的ESCC Eca9706細胞系。

圖2 RTFQ-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染siRNA-SRSF1后Eca9706細胞中的SRSF1 mRNA表達和蛋白水平Fig.2 mRNA expression and protein level of SRSF1 in Eca9706 cells after transfection of siRNA-SRSF1 by RTFQ-PCR and Western blot

2.3 SRSF1對ESCC Eca9706細胞增殖的影響

CCK-8法結果顯示，與siRNA-NC組相比，沉默SRSF1表達在48、72和96 h的Eca9706細胞增殖能力顯著低于對照組，分別為2.920、5.547和8.626（P=0.0432、0.0051和0.0009，圖3），提示沉默SRSF1表達可抑制Eca9706細胞增殖能力。

圖3 SRSF1促進Eca9706細胞增殖能力Fig.3 SRSF1 promotes proliferation of Eca9706 cells

2.4 SRSF1對ESCC Eca9706細胞遷移的影響

Transwell實驗檢測結果顯示，siRNA-SRSF1轉(zhuǎn)染組細胞遷移數(shù)目與siRNA-NC組相比明顯減少（t=6.954，P=0.0022，圖4），提示SRSF1在體外可提高ESCC細胞遷移能力。

圖4 SRSF1提高Eca9706細胞遷移能力Fig.4 SRSF1 enhanced migration of Eca9706 cells

2.5 SRSF1對ESCC Eca9706細胞侵襲的影響

Matrigel基質(zhì)膠侵襲實驗結果顯示，與siRNANC組相比，siRNA-SRSF1組Eca9706細胞侵襲能力明顯下降（t=12.91，P=0.000 2，圖5），提示SRSF1在體外可提高ESCC細胞侵襲能 力。

圖5 SRSF1提高Eca9706細胞的侵襲能力Fig.5 SRSF1 enhanced invasion activity of Eca9706 cells

2.6 SRSF1對ESCC Eca9706細胞VEGFA可變剪接調(diào)控的影響

檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中VEGFA表達明顯高于食管正常組織（圖6A，P＜0.05）。進一步檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ESCC中SRSF1與VEGFA的表達呈正相關（圖6B），且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006 2）。RTFQ-PCR檢測結果顯示，Eca9706細胞VEGFA Iso8a亞型表達明顯高于VEGFA Iso8b亞型（t=21.39，P＜0.000 1，圖6C）。進一步檢測SRSF1對ESCC Eca9706細胞VEGFA可變剪接調(diào)控的影響，結果表明，敲低SRSF1后，VEGFA Iso8a亞型表達顯著降低，VEGFA Iso8b亞型表達明顯提高（t=21.82，P＜0.000 1，圖6D）。上述結果提示，SRSF1可能通過作用于VEGFA可變剪接影響ESCC細胞的生物學行為。

圖6 SRSF1對ESCC Eca9706細胞VEGFA可變剪接調(diào)控作用Fig.6 Regulation of SRSF1 on VEGFA alternative splicing in ESCC Eca9706 cell

3 討 論

近年來，隨著免疫治療的不斷發(fā)展，程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）抗體獲批用于ESCC治療，可延長晚期ESCC患者的無進展生存期和總生存期［11-12］，但由于ESCC缺乏早期特異性標志物且具有高度侵襲性，其總體預后仍然不理想。因此，尋找ESCC早期診斷和判斷預后的分子標志物，并探討ESCC發(fā)生、發(fā)展的相關分子機制，對ESCC臨床治療具有重大意義。SRSF1作為可變剪接因子家族的代表性成員，參與前體mRNA剪接、加工和mRNA運輸，并調(diào)控細胞周期及凋亡等生理功能［13-14］。另有研究［10，15］表明，SRSF1在多種腫瘤中表達上調(diào)，通過調(diào)控癌癥相關基因的可變剪接促進腫瘤的發(fā)展。

本研究首先通過免疫組織化學法證實ESCC組織中的SRSF1表達水平顯著增高，與本課題組前期研究［16］結果一致。進一步從細胞水平探討SRSF1在ESCC細胞系中的表達和功能。RTFQPCR檢測ESCC細胞系中的SRSF1 mRNA表達水平，結果顯示，Eca9706細胞系中的SRSF1表達豐度最高，明顯高于Kyse170、TE1、Yes-2和Kyse150細胞系。另外，通過Western blot檢測SRSF1蛋白在ESCC細胞系中的水平，結果顯示，SRSF1在Eca9706細胞系中高表達，與前期SRSF1基因表達結果一致。為研究SRSF1在ESCC細胞中的作用，選擇Eca9706細胞進行后續(xù)的相關研究。通過siRNA技術轉(zhuǎn)染Eca9706細胞，RTFQ-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后的SRSF1基因表達和蛋白水平，結果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染si-SRSF1后，Eca9706細胞中的SRSF1基因表達和蛋白水平顯著降低，證實成功構建低表達SRSF1的Eca9706細胞系。CCK-8實驗顯示，SRSF1可提高Eca9706細胞增殖能力，同時transwell和Matrigel基質(zhì)膠實驗顯示，SRSF1可提高Eca9706細胞遷移和侵襲能力。綜上所述，SRSF1在ESCC細胞中高表達，體外可促進ESCC細胞增殖、侵襲和遷移能力，進一步提示SRSF1可作為癌基因參與ESCC細胞的惡性生物學行為，進而促進ESCC的發(fā)生、發(fā)展。

可變剪接涉及基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯及翻譯后修飾，在細胞發(fā)育和分化過程中發(fā)揮至關重要的作用［6］。多項研究［17-18］表明，異常的可變剪接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。SRSF1作為可變剪接因子家族的代表性成員，可通過mRNA可變剪接作用參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［10，19］。本課題組前期研究［20］發(fā)現(xiàn)，SRSF1在非小細胞肺癌細胞系中表達水平升高，并通過可變剪接上調(diào)BIN1+12A亞型的表達，進而抑制BIN1的抗腫瘤作用。另有研究［21］顯示，circSMARCA5通過結合SRSF1可變剪接調(diào)控VEGFA前體mRNA的剪接，促進促血管生成亞型（VEGFA Iso8a）的升高和抗血管生成亞型（Iso8b）的降低，進而影響腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展。為進一步探討SRSF1在ESCC中的分子調(diào)控作用，本研究通過檢索TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，VEGFA在ESCC組織中高表達，并發(fā)現(xiàn)SRSF1與VEGFA成正相關。綜上，我們推測SRSF1可能通過調(diào)節(jié)VEGFA信號轉(zhuǎn)導通路影響ESCC的發(fā)展。

VEGFA作為VEGF家族成員，是腫瘤生長過程中血管生成的關鍵性調(diào)節(jié)因子，可以促進腫瘤的轉(zhuǎn)移、增殖、血管生成和誘導耐藥等［22-23］。有研究［24］報道，VEGFA異?？勺兗艚涌蓪е陆Y腸癌中促血管生成亞型與抗血管生成亞型比例的改變，進而影響結腸癌的進展。通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA在ESCC組織中高表達。進一步采用RTFQ-PCR檢測VEGFA Iso8a和VEGFA Iso8b亞型在Eca9706細胞系中的表達，結果顯示，促血管生成亞型（Iso8a）的表達水平明顯高于抗血管生成亞型（Iso8b），證實VEGFA Iso8a在ESCC中發(fā)揮重要的促腫瘤作用。有研究［25］報道，SRSF1靶向調(diào)控VEGFA前體mRNA可變剪接發(fā)揮惡性生物學作用。本研究進一步探討SRSF1在ESCC中對VEGFA的剪接調(diào)控作用。采用RTFQPCR檢測轉(zhuǎn)染SRSF1后對VEGFA Iso8a和VEGFA Iso8b亞型表達的影響，結果表明，敲低SRSF1后，VEGFA Iso8a亞型的表達水平顯著下降，而VEGFA Iso8b亞型的表達明顯升高，表明SRSF1可以促進VEGFA的剪接調(diào)控進而影響ESCC的發(fā)生、發(fā)展。但SRSF1在ESCC中對VEGFA下游信號轉(zhuǎn)導通路的具體作用機制目前尚未清楚，需要后續(xù)深入研究。

綜上所述，SRSF1在ESCC組織和細胞中高表達，沉默SRSF1可促進ESCC細胞增殖、侵襲和遷移，可能是通過影響VEGFA可變剪接調(diào)控進進而發(fā)揮促癌作用，這可能成為ESCC臨床治療的新靶點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。