液相色譜法測定超高溫滅菌乳中蛋白含量

蘭 麗，張彩霞，高萬東，余志寶，徐 紅，唐振鑫，范 敏，楊明陽，田加美，張雪嬌，張 晶，賀曉鳴，郭素芳

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

牛乳蛋白質(zhì)是人體優(yōu)質(zhì)的食物蛋白來源，乳蛋白的深入研究是行業(yè)良性發(fā)展的必然需求。牛乳的主要蛋白成分為酪蛋白與乳清蛋白，其中，酪蛋白包括α-、β-、κ-酪蛋白，乳清蛋白包括α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）等[1-3]，有些蛋白成分含量與產(chǎn)品組織狀態(tài)密切相關(guān)，而傳統(tǒng)的凱氏定氮法只能通過總氮含量間接測定蛋白質(zhì)的含量，已無法滿足特性蛋白的檢測需求。因此，建立合理、穩(wěn)定的乳蛋白評價方法對乳質(zhì)量評價具有重要意義。

目前有關(guān)乳制品中蛋白質(zhì)分析的方法有毛細管電泳法[4-5]、免疫學方法[6-7]、平板凝膠電泳法[8-9]、液相色譜法[10]、核磁共振磷譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜法等[12-15]，就目前檢測A2β-酪蛋白的液相色譜-質(zhì)譜法而言，其主要基于酶解后的肽段含量來測定蛋白，不能直接反應(yīng)蛋白含量的變化。基于檢測成本及設(shè)備考量，建立一種能一次性進樣并滿足超高溫（ultra high temperature，UHT）滅菌乳中α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的液相色譜檢測法，監(jiān)測UHT乳中蛋白含量，旨在為后續(xù)工藝改善、生產(chǎn)過程控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售強化A2β-酪蛋白系列牛乳；市售普通UHT滅菌乳。

β-酪蛋白標準品（純度≥98.0%）、κ-酪蛋白標準品（純度≥70.0%）、α-酪蛋白標準品（純度≥70.0%）、β-乳球蛋白標準品（純度≥90.0%） 美國Sigma公司；α-乳白蛋白標準品（純度≥85.0%）、三氟乙酸（質(zhì)譜級） 德國CNW公司；雙[三(羥甲基)氨基甲烷]（BisTris） 上海源葉生物科技有限公司；鹽酸胍上海泰坦化學有限公司；檸檬酸鈉 天津福晨化學試劑有限公司；二硫蘇糖醇 河北百靈威超精細材料有限公司；乙腈（色譜純） 成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260液相色譜儀（配備紫外檢測器） 美國安捷倫有限公司；Biofuge Stratos低溫高速離心機 德國Sigma公司；KS501渦旋振蕩器 德國IKA公司；MILLI-Q超純水機 美國Millipore公司；分析天平（十萬分之一）瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

溶液Ⅰ：稱取2.092 4 g BisTris、57.318 g鹽酸胍、0.157 g檸檬酸鈉、0.300 79 g二硫蘇糖醇，置于容量瓶中，加水定容至100 mL（含0.1 mol/L BisTris、6 mol/L鹽酸胍、5.37 mmol/L檸檬酸鈉、19.5 mmol/L二硫蘇糖醇），現(xiàn)用現(xiàn)配。

溶液Ⅱ：稱取42.988 5 g鹽酸胍，加入100 μL三氟乙酸，用水定容至100 mL（含體積分數(shù)0.1%三氟乙酸、4.5 mol/L鹽酸胍），現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 標準溶液配制

β-酪蛋白工作液配制：用天平（十萬分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gβ-酪蛋白標準品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。κ-酪蛋白工作液配制：用天平（十萬分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gκ-酪蛋白標準品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。α-酪蛋白工作液配制：用天平（十萬分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gα-酪蛋白標準品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。α-乳白蛋白工作液配制：用天平（十萬分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gα-乳白蛋白標準品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。β-乳球蛋白工作液配制：用天平（十萬分之一）分別稱取0.001 00、0.002 00、0.005 00、0.010 00、0.015 00 gβ-乳球蛋白標準品于10 mL離心管中，各加400 μL超純水。

1.3.3 樣品測定

1.3.3.1 試樣制備與處理

吸取400 μL牛乳，加入400 μL溶液Ⅰ，渦旋混勻，室溫靜置1 h，將混合溶液12 000 r/min、4 ℃離心10 min，用槍頭將表層乳脂移開，吸取底層溶液300 μL于新的離心管中，加入900 μL溶液Ⅱ，渦旋混勻，用0.45 μm水相濾膜過濾待測[16-18]。

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1.3.3.2 標準工作液處理

將制備好的標準工作液中加入400 μL溶液Ⅰ，渦旋混勻，室溫靜置1 h，將混合溶液12 000 r/min、4 ℃離心10 min，吸取溶液300 μL于新的離心管中，加入900 μL溶液Ⅱ，渦旋混勻，用0.45 μm水相濾膜過濾待測。

1.3.3.3 液相色譜條件

色譜柱：菲羅門-Venus C18（300 ?，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：流動相A為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流動相B為體積分數(shù)0.1%三氟乙酸，梯度洗脫；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長214 nm；梯度洗脫程序如表1所示[16,19]。

表 1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

1.3.4 結(jié)果計算

試樣中蛋白含量按下式計算。

待測試樣蛋白質(zhì)量濃度測定方法：測定5 個系列質(zhì)量濃度的各蛋白標準溶液，以各蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標（x），對應(yīng)峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，得到各蛋白線性方程及相關(guān)系數(shù)，將樣品峰面積代入曲線，得到相應(yīng)質(zhì)量濃度。

對于含有不同亞型的蛋白（如κ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白），采取峰面積占比形式計算各亞型含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Agilent ChemStation儀器數(shù)據(jù)分析軟件和Excel軟件對圖譜和數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的確定

為了選擇合適的前處理方法，本研究對國內(nèi)外目前乳制品中蛋白的液相色譜法測定進行分析，一般包括2 種方法，一是基于等電點沉淀提取酪蛋白，洗滌沉淀進行檢測。劉夢云等[10]運用此方法進行乳粉中酪蛋白的定量檢測。二是基于用尿素、鹽酸胍、二硫蘇糖醇、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等試劑破壞酪蛋白膠束，打開蛋白二硫鍵等方式，使蛋白變性，檢測蛋白含量。王浩等[20]運用此種方法對乳制品進行定量分析，分離出7 種主要蛋白成分（包括酪蛋白）。豆劍偉等[21]運用此方法對3 種酪蛋白標準品進行分離。Bonfatti等[22]運用此方法對水牛乳蛋白組分和遺傳變異體進行分離和定量。

基于等電點沉淀提取酪蛋白的方式較為復雜，且不能同時檢測乳清蛋白。經(jīng)過研究，結(jié)合實際實驗操作，選擇鹽酸胍和二硫蘇糖醇等搭配無機鹽配制緩沖溶液進行實驗，可以充分溶解蛋白質(zhì)，展開蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，且操作簡單、耗時短。

2.2 各蛋白標品譜圖

通過單標及曲線線性確定蛋白保留時間。由圖1～5可知，各蛋白具有較好的分離度，β-酪蛋白包含3 個變異體，依據(jù)出峰次序依次為B型、A1型、A2型β-酪蛋白，κ-酪蛋白包含3 個變異體，依據(jù)出峰次序依次為κ1型、κ2型、κ3型κ-酪蛋白，β-乳球蛋白包含2 個變異體，依據(jù)出峰次序依次為B型、A型β-乳球蛋白。

2.3 標準曲線及相關(guān)系數(shù)

參照GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F“檢測方法確認的技術(shù)要求”，對于確證方法，相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。由表2可知，各蛋白線性方程相關(guān)系數(shù)（r）為0.995以上，能滿足檢測要求?；跐M足信噪比（RS/N）≥3的要求，得出檢出限。

表 2 各蛋白亞型的標準曲線擬合方程及檢出限Table 2 Calibration curve equations and detection limits for milk proteins

需要特別強調(diào)的是，β-酪蛋白標準品、κ-酪蛋白標準品、α-酪蛋白標準品純度無法達到100%，例如，β-酪蛋白標準品的色譜帶會含有少量κ-酪蛋白，故實驗時，β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-酪蛋白曲線繪制時標準溶液需要單獨配制，不能配制混標。

2.4 樣品檢測譜圖

分別對市售普通UHT乳及A2β-酪蛋白牛乳運用上述方法進行檢測。由圖6～7可知，在保留時間30.0 min處為β-酪蛋白，普通UHT乳β-酪蛋白處有3 個峰，分別為B型、A1型、A2型，A2β-酪蛋白牛乳保留時間31.5 min處只有A2型β-酪蛋白，該方法可以對此類滅菌乳鑒定提供檢測手段。

2.5 各蛋白加標回收率（準確度）

在待測樣品中加入一定量的標準樣品，混合均勻后，按照相同的檢驗方法進行測定，比較加入標準樣品后的含量和理論加標量，計算加標回收率。

參照GB/T 27404—2008附錄F“檢測方法確認的技術(shù)要求”，樣品中被測組分含量大于100 mg/kg時，回收率為95%～105%，本研究測定的各蛋白含量均大于100 mg/kg。由表3可知，樣品6 次加標實驗的回收率為95.2%～105.0%，能滿足檢測要求。

表 3 市售UHT乳各蛋白的加標回收率Table 3 Recoveries of milk proteins spiked into commercially available UHT milk

2.6 方法精密度

重復性是指在重復性條件下所測得的相互獨立的實驗結(jié)果之間的符合程度。重復性條件是指在同一實驗室內(nèi)，由同一操作者使用新建色譜定量分析方法，在較短時間間隔內(nèi)使用同一儀器對相同樣品進行分析測定。

參照GB/T 27404—2008附錄F“檢測方法確認的技術(shù)要求”，樣品中被測組分含量≤1%，變異系數(shù)≤2.7%。本研究測定的蛋白含量＜1%，由表4可知，6 次重復性實驗的相對標準偏差為0.78%～2.70%，能滿足檢測要求。

表 4 各蛋白平行測定結(jié)果及相對標準偏差（n=6）Table 4 Results and relative standard deviations of determination of milk proteins (n = 6)

2.7 樣品測定及不同方法間測定結(jié)果比較

運用本研究的液相色譜法對市售A2β-酪蛋白牛乳樣品進行檢測，結(jié)果如表5所示；同時，運用高效液相色譜-質(zhì)譜法[12-13]對市售3 批次A2β-酪蛋白牛乳中的A2型β-酪蛋白進行貨架期跟蹤監(jiān)測，以進行結(jié)果比較，結(jié)果如表6所示。

表 5 某市售A2β-酪蛋白牛乳不同放置時間各蛋白含量測定結(jié)果（液相色譜法）Table 5 Contents of κ-casein, β-casein, α-lactalbumin and β-lactoglobulin in commercial A2 β-casein-fortified milk stored for different periods determined by the LC method g/100 mL

表 6 市售3 批A2β-酪蛋白牛乳中A2型β-酪蛋白含量檢測結(jié)果（高效液相色譜-質(zhì)譜法）Table 6 Contents of A2 β-casein-fortified in three lots of commercial A2 β-casein-fortified milk determined by HPLC-MS g/100 mL

目前，檢測牛乳蛋白分型無國標方法，檢測A2β-酪蛋白也沒有國標及行標方法，公認較為準確的方法為液相色譜-質(zhì)譜法，質(zhì)譜檢測技術(shù)的引入使得蛋白質(zhì)分析得到重大改進[23-24]。由表5～6可知，放置60 d樣品，液相色譜法檢測結(jié)果與高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測結(jié)果接近，液相色譜法檢測結(jié)果隨放置時間延長有輕微降低現(xiàn)象，高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測結(jié)果無此變化趨勢，這可能是由于乳蛋白發(fā)生糖基化[25-26]，液相色譜法無法檢測糖基化蛋白或由于乳中固有酶類[27-28]導致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得液相色譜法無法檢出，原因還需進一步研究分析。在實際運用過程中，液相色譜法可以進行蛋白分型檢測，此方法可以實現(xiàn)UHT乳中的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的一次性檢測并定量，操作方法簡單，試劑廉價易得，設(shè)備易于推廣，但只適用于UHT乳較短貯藏期內(nèi)的蛋白含量監(jiān)測，且單次分析時間較長，高效液相色譜-質(zhì)譜法通過特異性肽段建立標準曲線對蛋白進行定量，方法較為精準，但每種蛋白的特異性肽段不同，依據(jù)蛋白特性檢測的前處理可能不同，實現(xiàn)幾種蛋白的共同檢測需要進一步研究，且肽段需要人工合成，肽段純度定量較為困難，試劑成本昂貴，對操作人員要求較高，且設(shè)備不易推廣。

3 結(jié) 論

明確乳制品中蛋白質(zhì)的組分和含量是評價乳制品營養(yǎng)價值、致敏特性等的基礎(chǔ)，本研究提供了一種液相色譜方法檢測UHT乳中的蛋白含量，方法簡便，易于推廣，為企業(yè)工藝改善研究、新產(chǎn)品研究或監(jiān)測產(chǎn)品中蛋白含量提供了一種檢測手段。