太子參水煎液對(duì)T2DM大鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響

黃雅婷，闞永軍，朱妍錦，胡 娟*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122；2.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福州 350003）

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性代謝性疾病之一，我國糖尿病患病人群以T2DM（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）為主，T2DM是由于胰島β細(xì)胞分泌的缺陷和胰島素抵抗導(dǎo)致機(jī)體糖代謝異常引起血糖升高的疾病[1]。有研究表明，腸道菌群對(duì)宿主代謝的有益影響通常被認(rèn)為是由短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）所介導(dǎo)的；SCFAs的增加可能是預(yù)防或緩解T2DM的潛在治療方法[2]。

近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腸道菌群深入研究，發(fā)現(xiàn)T2DM的發(fā)生/發(fā)展與腸道菌群有著密切關(guān)系，腸道微生物穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致菌群多樣性遭到破壞，進(jìn)而引起腸黏膜慢性炎癥反應(yīng)，干擾葡萄糖的吸收與代謝，進(jìn)而影響T2DM的發(fā)生/發(fā)展[3]。SCFAs是腸道微生物重要代謝產(chǎn)物，主要存在于結(jié)腸，包括乙酸，丙酸，丁酸等[4]。大量研究證明SCFAs與機(jī)體的代謝過程息息相關(guān)，在維持機(jī)體能量代謝方面起著重要作用[5]。丙酸在肝臟中被代謝為乙酰輔酶a，進(jìn)入TCA循環(huán)轉(zhuǎn)化為ATP和NADH促進(jìn)葡萄糖產(chǎn)生，調(diào)控機(jī)體糖異生[6]。Perry R J等證實(shí)乙酸被腸道吸收后，通過血液循環(huán)進(jìn)入血腦屏障，增強(qiáng)大腦循環(huán)的能力，激活副交感神經(jīng)刺激β細(xì)胞胰島素的分泌[7]。SCFAs被視為機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，SCFAs的變化間接反映腸道微生物代謝狀態(tài)[8]。

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterohylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根。具有益氣生津、補(bǔ)氣潤肺的功效，主要用于脾虛體倦、氣陰不足等癥[9]。補(bǔ)氣養(yǎng)陰是中醫(yī)治療消渴病的途徑之一，因此太子參被廣泛應(yīng)用于抗糖尿病的藥方中[10]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，太子參可以降低T2DM大鼠空腹血糖、血清IL-6、TNF-α含量，升高IL-10水平，增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[11-13]。中藥多以湯劑的形式進(jìn)行口服給藥，主要經(jīng)胃腸道吸收，發(fā)揮療效[14]。本研究擬通過腹腔注射STZ聯(lián)合高脂高糖飼料喂養(yǎng)建立T2DM大鼠模型，灌胃給予太子參水煎液，采用氣相色譜法測(cè)定結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs的含量，探討太子參水煎液對(duì)T2DM大鼠結(jié)腸內(nèi)容物SCFAs代謝的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GC-2014型氣相色譜儀（日本島津公司）；AE240S型分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；STRATOS型低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；DK-98-ⅡA型水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；色譜柱HP-INNOWAX（30 m×0.25μm×0.32 mm），DW-86L728J超低溫冰箱（青島海爾）。

1.2 試劑

乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、2-乙基丁酸均為色譜純（上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；水為超純水。

1.3 藥材

太子參藥材（柘參3號(hào)，批號(hào)：ZS3-202001）購于海誠藥業(yè)太子參種植基地。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 太子參水煎液的制備

稱取太子參藥材150 g，剪成0.3~0.8 cm小段，加超純水800 mL，浸泡30 min，武火加熱煮沸10 min后改文火加熱1 h，稍冷后過濾，濾渣再加超純水800 mL，同法煎煮1 h，過濾后合并兩次濾液，濾液減壓濃縮至500 mL，得太子參水煎液，濃度為0.3 g/mL。

2.2 給藥與分組

取SPF級(jí)Wistar大鼠20只，體重（220±20）g，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。隨機(jī)選取5只作為正常對(duì)照組，正常自由飲食飲水，其余大鼠以高脂高糖飼料和普通育成飼料梯度混合后進(jìn)行適應(yīng)性過渡飼養(yǎng)7 d后，腹腔注射1%STZ（0.35 mL/100 g），誘導(dǎo)T2DM大鼠模型。3 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水4 h，尾靜脈取血檢測(cè)血糖水平，血糖＞11.1 mmo1/L，則判定為T2DM大鼠模型。剔除造模未成功的大鼠，將造模成功大鼠分為模型組和太子參水煎液組，每組不少于5只，太子參水煎液組每日給予太子參水煎液（1 mL/100 g），模型組和正常對(duì)照組給予相同容量生理鹽水，持續(xù)干預(yù)時(shí)間為45 d。

2.3 結(jié)腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的測(cè)定

2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇定容，得到濃度分別為50、33.2、8.32、33.2、16.6、25、50和5.6 mg/mL單標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，另外配制0.125 mg/mL的2-乙基丁酸（內(nèi)標(biāo)）溶液，分別精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋定容，得到濃度為乙酸2.5 mg/mL、丙酸1.66 mg/mL、異丁酸0.0416 mg/mL、丁酸1.66 mg/mL、異戊酸0.083 mg/mL、戊酸0.125 mg/mL、己酸0.25 mg/mL、庚酸0.028 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，逐級(jí)稀釋，得到一系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.2 樣品采集與供試品制備

結(jié)腸內(nèi)容物的采集：腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，無菌環(huán)境采集結(jié)腸內(nèi)容物，采集的樣本立刻放置于液氮內(nèi)，后轉(zhuǎn)移至-80°C低溫冰箱保存。

供試品制備：精密稱取0.1000 g腸內(nèi)容物于EP管中，加入1 mL甲醇和100μL 0.125 mg/mL的2-乙基丁酸，渦旋30 s，離心5 min（10000 rpm，4°C）；取上清液于EP管，加入100μL 50 mmol/L鹽酸，渦旋30 s，離心5 min（10000 rpm，4°C），取上清液，供氣相色譜儀分析。

2.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25μm×0.32 mm）；進(jìn)樣口溫度：250°C；進(jìn)樣體積：0.5μL；載氣：高純氮?dú)猓ā?9.999%），載氣流速3.0 mL/min；檢測(cè)器（FID）溫度：280°C；升溫條件：初始溫度70°C，保持2.5 min后，以4°C/min的速度上升至200°C，保持5 min；分流模式：不分流。

2.4 方法學(xué)考察

精密度：取同一份混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%；

重復(fù)性：取同一份樣品，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)條件下分析，記錄各成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%；

穩(wěn)定性：取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8和12 h時(shí)進(jìn)樣，在“2.3.3”項(xiàng)條件下分析，記錄各成分的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%；

加樣回收率：精密稱取樣品0.0500 g，分別按已測(cè)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%加入8種SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制供試品溶液，平行制備6份，在“2.3.3”項(xiàng)條件下分析，記錄各成分的峰面積，計(jì)算加樣回收率平均值及加樣回收率RSD%。

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的GC圖譜

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的氣相色譜（GC）圖譜如圖1和圖2所示，8種SCFAs及內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸分離度良好，分離度大于1.5，符合GC色譜含量測(cè)定的要求。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的氣相色譜圖

圖2 供試品溶液的氣相色譜圖

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

8種SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍如表1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)擬合系數(shù)R2均大于0.998，表明8種SCFAs在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 8種SCFAs的線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

3.1.3 精密度試驗(yàn)

8種SCFAs峰面積的RSD值在0.77%~2.50%之間，均小于5%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

8種SCFAs峰面積的RSD值在0.48%~2.41%之間，均小于5%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

8種SCFAs峰面積的RSD在1.30%~2.33%之間，均小于5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

3.1.6 加樣回收試驗(yàn)

結(jié)果如表2所示，8種SCFAs的平均回收率在93.65%~100.94%之間，RSD為1.24%~2.60%。

表2 8種SCFAs的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3.2 太子參水煎液對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs含量的影響

SCFAs與腸道健康和代謝密切相關(guān)。表3和圖3反映了太子參水煎液對(duì)T2DM大鼠腸內(nèi)容物中SCFAs的影響；各組大鼠腸道內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸的含量最高。模型組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、己酸含量顯著低于空白組（P＜0.05）；與模型組相比，水煎液組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸含量顯著增加（P＜0.05）。

圖3 太子參水煎液對(duì)T2DM大鼠腸內(nèi)容物中SCFAs的影響

表3 大鼠腸道內(nèi)容物中SCFAs的含量（ng/mg）（n=5,±s）

表3 大鼠腸道內(nèi)容物中SCFAs的含量（ng/mg）（n=5,±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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研究顯示，丁酸濃度與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的增加呈負(fù)相關(guān)，丁酸是腸上皮細(xì)胞的主要能量來源，同時(shí)可以抑制炎癥因子的釋放，減少腸道慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，維持腸道微生態(tài)的平衡[15,16]；而太子參水煎液可以顯著增加丁酸含量（P＜0.05）。乙酸是腸道厭氧菌的主要代謝物，參與機(jī)體的糖代謝[15,17]；丙酸參與肝臟脂肪酸代謝，抑制膽固醇合成[18-20]，太子參水煎液對(duì)T2DM大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸含量并無影響。

4 討論

SCFAs具有較強(qiáng)的揮發(fā)性、親水性等特點(diǎn)，因此選擇合適的SCFAs前處理的方法尤為重要。對(duì)SCFAs樣品進(jìn)行前處理的方法有：水提法、超濾法、萃取法等[21,22]。為了能夠減少樣品在前處理過程中的損失，并快速準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs樣品的含量，本文經(jīng)過反復(fù)摸索，對(duì)SCFAs提取方法進(jìn)行優(yōu)化，采用酸水提取法；該方法操作簡(jiǎn)單，省去了樣品衍生化的繁瑣步驟，節(jié)省了樣品前處理時(shí)間。本研究建立GC方法測(cè)定T2DM大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs的含量并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示，8種SCFAs均具有良好的線性，且精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性均符合氣相色譜法的分析要求，說明該方法可用于T2DM大鼠腸內(nèi)容物中SCFAs的含量測(cè)定。

大量研究表明，SCFAs與T2DM之間存在著一定的聯(lián)系，SCFAs經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)一步參與肝臟的葡萄糖代謝和脂肪酸代謝[23]；脂肪酸代謝發(fā)生異常，會(huì)降低胰島素敏感性，引起胰島素抵抗的發(fā)生，從而對(duì)T2DM產(chǎn)生影響[24]。丁酸通過誘導(dǎo)GLP-1的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)胰島素的分泌，改善血糖的穩(wěn)態(tài)，延緩T2DM的病程[25]；Xu等探討了丁酸對(duì)2型糖尿病潛在的治療作用，結(jié)果表明丁酸鹽可以通過恢復(fù)腸道微生物組成以及腸道屏障的完整性來改善T2DM癥狀[26]。研究顯示，腸內(nèi)容物中SCFAs含量的減少，會(huì)改變腸道微生物的生態(tài)平衡，影響機(jī)體各項(xiàng)代謝活動(dòng)[27]；糖尿病小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的含量顯著低于正常組，降糖治療后，糖尿病小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸的含量顯著提高[28]。SCFAs在維持健康和疾病發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、己酸含量顯著降低（P＜0.05），太子參水煎液可顯著增加T2DM大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸的含量（P＜0.05），表明太子參水煎液可影響T2DM大鼠結(jié)腸內(nèi)容物中SCFAs的代謝；而SCFAs是腸道微生物重要代謝產(chǎn)物，因此太子參水煎液的干預(yù)可能影響T2DM大鼠腸道微生物的多樣性和穩(wěn)定性。然而，太子參水煎液通過何種途徑影響腸道菌群，進(jìn)而影響SCFAs的代謝，尚需進(jìn)一步探討研究。