超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定小麥中黃曲霉毒素B1

高曉芳，胡婷婷，洪 冰，弓浩然，鄭婷婷，董磅礴，蘇淼冉

（鄭州市糧食科學(xué)研究所，河南 鄭州 450001）

小麥在儲存過程中因儲存方式不當(dāng)會導(dǎo)致黃曲霉毒素污染[1]。據(jù)報(bào)道[2]，溫度30 ℃、相對濕度80%、谷物水分在14% 以上的條件最適合黃曲霉繁殖和生長，并且在24～34 ℃，黃曲霉的產(chǎn)毒量最高。研究表明，黃曲霉毒素具有肝臟毒性[3-4]，并且具有免疫抑制作用[5]，是一種能夠致癌、致畸、致突變的真菌毒素，被世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為1A類致癌物，受到了全世界各個(gè)國家的廣泛關(guān)注[6-7]。目前報(bào)道的黃曲霉毒素有20多種，其中黃曲霉毒素B1最為常見。為了保障谷物及其制品的安全，國際食品法典委員會（CAC）、歐盟、美國等均制定了糧食中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)[8]，我國也在GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中對黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)作了明確的規(guī)定，每1 kg小麥中黃曲霉毒素B1不得超過5 μg[9]。目前，GB 5009.22—2016推薦的黃曲霉檢測方法主要有同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-柱前衍生法、高效液相色譜-柱后衍生法和酶聯(lián)免疫吸附法。其中，高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD法）是最常用的方法[10-11]，但此方法操作比較繁瑣，并且耗時(shí)長。本文采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測，并且對直接稀釋法和免疫親和柱純化法兩種前處理方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，以期建立一種快捷、便利的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測黃曲霉毒素B1的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

I-Class/XEVO TQ-S型超高液相色譜儀-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀聯(lián)用儀：WATERS公司；MLI104型水分磨：法國Chopin公司；PL-2002型電子天平（1/100）：瑞士梅特勒-托利多公司；TGL-10C型高速臺式離心機(jī)：上海市安亭電子儀器廠。

1.2 樣品

小麥：鄭州市庫存小麥。

1.3 試劑

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1（純度≥98%）：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國默克公司；乙酸銨（色譜純）、甲酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.4 溶液制備

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

（1）中間標(biāo)準(zhǔn)工作液：取適量黃曲霉毒素B1母液（2 μg/mL），用甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度為100 ng/mL的黃曲霉毒素B1中間標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（2）同位素內(nèi)標(biāo)工作液：取適量同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1（0.5 μg/mL），用甲醇稀釋至100 ng/mL。

（3）標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素 B1中間標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/mL） 10、50、100、200、500、800、1 000 μL至10 mL容量瓶中，加入200 μL 100 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動相定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 待測樣品溶液制備

取樣量1 kg，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過篩（粒徑小于2 mm）。稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液，振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 mL乙腈—水溶液（84+16），置于渦旋振蕩器中振20 min，6 000 r/min離心10 min，玻璃纖維濾紙過濾，取上清液備用。

1.5 試樣的凈化

準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入46 mL水，混勻，上免疫親和柱，用2×10 mL水淋洗柱子，然后用1 mL甲醇洗脫親和柱，收集全部洗脫液至試管中，并在50 ℃下氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動相，渦旋1 min溶解殘留物，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)。

1.6 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

1.6.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：鹽溶液（A），含0.1%甲酸的4.0 mmol/L乙酸銨溶液，甲醇（B）；流速：0.3 mL / min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

1.6.2 質(zhì)譜條件

（1） 離子源控制條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；檢測方式為ESI+，MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式；毛細(xì)管電壓2.5 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度150 ℃；錐孔反吹氣流量150 L/h；霧化氣溫度450 ℃；質(zhì)譜接口溫度（HSID）280 ℃。

（2） 離子參數(shù)優(yōu)化：將黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋定容至1 μg/mL，通過色譜柱-質(zhì)譜進(jìn)樣法，分別評估正、負(fù)離子模式下黃曲霉毒素B1的電離情況。結(jié)果顯示，在正離子模式下，黃曲霉毒素B1有較好的響應(yīng)，并采用正離子模式優(yōu)化質(zhì)譜條件參數(shù)，參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 離子選擇參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 相關(guān)系數(shù)和線性范圍檢測

配置質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的黃曲霉毒素B1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的液質(zhì)聯(lián)用檢測條件下進(jìn)行測定，在1.72 min時(shí)檢測到目標(biāo)峰，總離子色譜圖見圖1。以黃曲霉毒素B1色譜峰與13C17-黃曲霉毒素 B1色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素 B1質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1在0.1～10.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：If=1.777c + 0.005 23，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1 總離子色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢出限和定量限

將空白小麥樣品獨(dú)立測試10次，樣品空白平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差確定方法的檢出限（LOD）為0.004 μg/kg，樣品空白平均值加上10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差確定方法的定量限（LOQ）為0.01 μg/kg。檢出限與定量限均小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限與定量限要求，能夠滿足小麥中黃曲霉毒素B1的檢測要求[12]。

2.3 精密度和正確度(回收率)

選取不含黃曲霉毒素B1的小麥樣品進(jìn)行精密度和加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，分別在空白樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使黃曲霉毒素B1最終濃度分別為0.1、4.5、9.0 μg/kg，在同樣 的 液 質(zhì)聯(lián)用檢測條件下進(jìn)行測定。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和回收率結(jié)果見表3。由表3可知，3個(gè)濃度水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%～11.50%，加標(biāo)回收率為91.7%～100.9%，符合GB/T 27404附錄F的要求。

表3 小麥中黃曲霉毒素B1的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率

2.4 直接稀釋法和免疫親和柱純化法對檢測結(jié)果的影響

考慮到免疫親和純化法耗時(shí)長、費(fèi)用高，且小麥基質(zhì)中物質(zhì)比較單一，雜質(zhì)少、干擾少的特點(diǎn)，在前處理中，采用將提取液直接稀釋后上機(jī)檢測的方法，即準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移4 mL提取液于另一15 mL離心管中，加入4 mL水，渦旋混勻后，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測，并對兩種前處理方法的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。由此可知，直接稀釋法檢測結(jié)果的精密度為3.49%，回收率為93.8%，免疫親和柱純化法檢測結(jié)果的精密度為3.10%，回收率為92.2%，采用兩種不同前處理方法的檢測結(jié)果均符合GB/T 27404附錄F的要求。

表4 兩種前處理方法的檢測結(jié)果比較

直接稀釋法相較于免疫親和柱純化法更節(jié)省時(shí)間，節(jié)約成本，且減少了前處理過程中目標(biāo)化合物的損失，因此直接稀釋法更適合大批量樣品的檢測。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)基于GB 5009.22—2016中黃曲霉毒素B1檢測方法——同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，并對樣品的前處理方法、色譜及質(zhì)譜條件作了優(yōu)化，建立了快速準(zhǔn)確定量分析小麥中黃曲霉毒素B1的同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。還考察了該方法的相關(guān)系數(shù)和線性范圍，檢測了方法的檢出限和定量限，并通過加標(biāo)回收試驗(yàn)檢測了方法的精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果均符合GB/T 27404附錄F的要求，滿足實(shí)驗(yàn)室快速、準(zhǔn)確定量分析大批量小麥中黃曲霉毒素B1的檢測需求。