時(shí)間分辨熒光免疫層析法同時(shí)定量檢測(cè)糧食中玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素

張少波，鄧常繼，張海濤，朱啟思

（1. 廣東省糧食和物資儲(chǔ)備保障中心，廣東 廣州 510050；2. 廣東省糧食科學(xué)研究所，廣東 廣州 510050；3. 江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無(wú)錫 214000）

糧食在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中，受氣候、季節(jié)、加工不當(dāng)?shù)纫蛩赜绊?，極易發(fā)生霉變而產(chǎn)生霉菌毒素[1]。全球每年約有25%的糧食受到霉菌毒素的污染，造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)千億美元[2]。我國(guó)同樣遭受嚴(yán)重的霉菌毒素污染問(wèn)題，每年因此造成的糧食損失高達(dá)110億kg[3]。更為嚴(yán)重的是，霉菌毒素可通過(guò)飼料或食品進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)器官的損傷[4]。

霉菌毒素種類繁多，其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）是糧食中最常見的2種霉菌毒素。玉米赤霉烯酮又稱F-2毒素，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生[5]，具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性和基因毒性[6]，被FAO和WHO確定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生的食品污染物之一。嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要由鐮刀菌屬產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的免疫抑制和細(xì)胞毒性，被歐盟列為三級(jí)致癌物[7]。近年來(lái)，ZEN和DON超標(biāo)事件屢見報(bào)道，引起社會(huì)廣泛關(guān)注。受霉菌毒素污染的糧食尚無(wú)有效的去毒方法，因此，加強(qiáng)糧食中霉菌毒素的監(jiān)測(cè)成為降低其危害的重要途徑。時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)因其靈敏度高、檢測(cè)速度快、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為霉菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，并在食品檢測(cè)行業(yè)得到應(yīng)用[8]。

時(shí)間分辨熒光免疫分析法是一種微量分析方法，利用免疫反應(yīng)的高度特異性和標(biāo)記示蹤物的高度靈敏性相結(jié)合而建立的一類非放射性的檢測(cè)技術(shù)，是目前最靈敏的超微量分析技術(shù)之一[9]。目前，該技術(shù)的應(yīng)用主要集中在單個(gè)霉菌毒素的快速定量檢測(cè)，多種毒素特別是ZEN、DON的同時(shí)檢測(cè)報(bào)道較少。本文擬建立同時(shí)測(cè)定糧食中ZEN和DON含量的時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)方法，為其進(jìn)一步推廣使用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

SW-2型時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)儀、ZEN和DON時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)卡：江蘇省蘇微微生物研究有限公司；AL204-IC型電子天平：梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；3310型盤式實(shí)驗(yàn)粉碎磨：波通瑞華科學(xué)儀器有限公司；Multi Reax型旋渦混勻器：德國(guó)Heidolph公司；MINI-7K型微型離心機(jī)：杭州米歐儀器有限公司；Milli-Q型超純水儀：美國(guó)密理博公司；20 ~ 200 μL和100 ~ 1 000 μL單道可調(diào)移液器：德國(guó)Eppendorf公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；ZEN、DON免疫親和柱、樣品稀釋液：江蘇省蘇微微生物有限公司；玉米全粉中嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）100383]、全麥粉中玉米赤霉烯酮成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）100384]、糙米粉中嘔吐毒素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）100608]、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品[GBW（E）100301]及DON標(biāo)準(zhǔn)品[GBW（E）100304]：國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)原理

玉米赤霉烯酮/嘔吐毒素時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)二聯(lián)卡運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析的原理，樣本中若含有ZEN、DON，則在側(cè)向移動(dòng)的過(guò)程中會(huì)與熒光微球標(biāo)記的特異性單克隆抗體反應(yīng)，抑制抗體和NC膜檢測(cè)線上ZEN-BSA與DON-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。隨著樣本中ZEN與DON含量的升高，結(jié)合于檢測(cè)線上的抗體量減少，相應(yīng)的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度也隨之變?nèi)?。使用專用時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)儀讀數(shù)，可定量地測(cè)出樣本中ZEN與DON的含量。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g粉碎樣品（稻谷樣品需壟谷）于50 mL離心管中，加入10 mL 60%甲醇水至50 mL離心管中，渦旋提取2 min，7 000 r/min離心5 min，取上清液。

1.2.3 樣品檢測(cè)

測(cè)試前，將未開封的檢測(cè)卡及試劑平衡至25 ℃。將檢測(cè)卡平放，用移液器定量吸取100 μL上清液加入500 μL樣本稀釋液，反復(fù)吸打5次以充分混勻，吸取100 μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，于20 ~ 25 ℃下反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)卡放入時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)儀中檢測(cè)；在儀器感應(yīng)區(qū)中放置對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線智能卡，在主界面的“測(cè)量”菜單中點(diǎn)擊讀取智能卡后，點(diǎn)擊“樣品測(cè)量”進(jìn)行檢測(cè)儀器讀數(shù)完成后會(huì)自動(dòng)計(jì)算出被檢樣本中的ZEN和DON含量，可選擇儲(chǔ)存及打印結(jié)果。

若環(huán)境溫度不在20 ~ 25 ℃范圍內(nèi)，則需在測(cè)樣前進(jìn)行一次校準(zhǔn)，即取100 μL DON-ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)卡反應(yīng)10 min，再將此卡放入儀器中，在儀器主界面的“測(cè)量”菜單中點(diǎn)擊“標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量”按鈕，進(jìn)行校準(zhǔn)；若環(huán)境溫度在該范圍內(nèi)，則無(wú)需校準(zhǔn)。

1.2.4 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

（1）線性范圍與定量曲線：DON標(biāo)準(zhǔn)品與ZEN標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇定容配制成1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；采用0.4%的吐溫-PBS（pH 7.2，0.01 mol/L）稀釋成0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取100 μL加至層析卡的樣品孔中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，由低濃度到高濃度進(jìn)行檢測(cè)，記錄時(shí)間分辨熒光儀檢測(cè)T1、T2線熒光強(qiáng)度與C線熒光強(qiáng)度，計(jì)算T1/C與T2/C值。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對(duì)數(shù)值（InC）為橫坐標(biāo)，以各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T0/C0值的比值所得百分比為縱坐標(biāo)，制圖、選擇線性范圍，并建立定量曲線。

（2）檢出限與定量限：取20組獨(dú)立的陰性玉米樣品（ZEN、DON均未檢出），用玉米赤霉烯酮/嘔吐毒素時(shí)間分辨熒光免疫層析二聯(lián)卡對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。檢出限（LOD）等于20次測(cè)定結(jié)果的均值（）加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)差（s），即＋3s；定量限（LOQ）等于＋10s。

（3）準(zhǔn)確度：按照1.2.2的前處理方法，在陰性玉米或小麥樣品中分別加入低、中、高濃度的ZEN/DON標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定加標(biāo)回收率，評(píng)估方法的準(zhǔn)確度。

（4）精密度：分別選擇接近于方法定量限、標(biāo)準(zhǔn)最高允許限量和本方法線性范圍內(nèi)適當(dāng)含量水平的3種濃度的ZEN-DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度水平10次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）。

（5）批間穩(wěn)定性：采用接近于標(biāo)準(zhǔn)最高允許限量的ZEN-DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，測(cè)試10個(gè)批次的二聯(lián)卡，每個(gè)批次測(cè)定3次，批內(nèi)測(cè)定取平均值，計(jì)算二聯(lián)卡批間變異系數(shù)。

（6）與液相色譜法的對(duì)比試驗(yàn)：取不同基質(zhì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，先用液相色譜法測(cè)定，再使用時(shí)間分辨熒光免疫層析法測(cè)定，并對(duì)比驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍與定量曲線

由圖1、圖2可以發(fā)現(xiàn)，橫坐標(biāo)采用的是濃度的自然對(duì)數(shù)，通過(guò)繪制得到的依然是平滑的S曲線，這與免疫競(jìng)爭(zhēng)得到的曲線是一致的。同時(shí)，DON在0.5 ~ 50.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，該段曲線接近于直線，分析其線性回歸相關(guān)系數(shù)R2= 0.990 1；ZEN在0.2 ~ 5.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，同樣為一段接近于直線的曲線，分析其線性回歸相關(guān)系數(shù)R2= 0.992 2。由此，選定DON定量曲線的線性范圍為0.5 ~ 50.0 ng/mL，ZEN定量曲線的線性范圍為0.2 ~ 5.0 ng/mL，并以此作為以下試驗(yàn)的線性濃度，建立定量曲線如圖3、圖4所示。

圖1 不同濃度DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.2～50.0 ng/mL）的平滑曲線

圖2 不同濃度ZEN標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.2～50.0 ng/mL）的滑曲線

圖3 DON定量曲線

圖4 ZEN定量曲線

2.2 檢出限和定量限

由表1可知，ZEN的檢出限和定量限分別為7.92、15.10 μg/kg，DON的檢出限和定量限分別為71.9、146.1 μg/kg，滿足GB 2761—2017規(guī)定的糧食樣品ZEN、DON的限量要求。

表1 方法的檢出限和定量限（n=20） μg/kg

2.3 準(zhǔn)確度

根據(jù)GB 2761—2017標(biāo)準(zhǔn)限量，設(shè)定3個(gè)涵蓋低、中、高濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，其中ZEN加標(biāo)濃度分別為30、60、120 μg/kg，DON加標(biāo)濃度分別為500、1 000、1 500 μg/kg，用二聯(lián)卡重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果如表2、表3所示?？芍?，本方法加標(biāo)回收率在91% ~ 106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，滿足檢驗(yàn)的要求。

表2 ZEN加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 DON加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度

參照LS/T 6112—2015附錄A的方法，配置3種濃度的ZEN/DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算二聯(lián)卡批內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果見表4、表5。可知，ZEN批內(nèi)變異系數(shù)在8.02% ~ 12.53%，DON批內(nèi)變異系數(shù)在7.11% ~ 14.03%，均小于20%，說(shuō)明該方法精密度良好。

表4 ZEN精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

表5 DON精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

2.5 批間穩(wěn)定性

配置ZEN/DON標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2.4（5）進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明（表6），ZEN批間變異系數(shù)為13.53%，DON批間變異系數(shù)為11.17%，均小于20%，說(shuō)明該方法批間差異不大，穩(wěn)定性良好。

表6 批間穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=10）

2.6 與液相色譜法的對(duì)比試驗(yàn)

分別采用液相色譜法和時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測(cè)玉米全粉中嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、全麥粉中玉米赤霉烯酮成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、糙米粉中嘔吐毒素成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，重復(fù)測(cè)定5次，將兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖5、圖6所示。兩種方法的ZEN和DON檢測(cè)結(jié)果線性回歸系數(shù)（R2）分別為0.991 5和0.990 5，且所測(cè)結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值內(nèi)。說(shuō)明在不同的糧食基質(zhì)中，時(shí)間分辨熒光免疫層析法檢測(cè)值與液相色譜法檢測(cè)值較為一致，結(jié)果準(zhǔn)確有效。

圖5 HPLC法與時(shí)間分辨熒光免疫層析法測(cè)定ZEN的相關(guān)性

圖6 HPLC法與時(shí)間分辨熒光免疫層析法測(cè)定DON的相關(guān)性

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定糧食中ZEN和DON含量的時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)方法。該法對(duì)糧食中ZEN、DON的檢出限分別為7.92、71.90 μg/kg，定量限為15.10、146.10 μg/kg，線性范圍為0.2 ~ 5.0、0.5 ~ 50.0 ng/mL，不同水平的加標(biāo)回收率在91% ~ 106%，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于20%。選取不同基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)試，本試驗(yàn)建立的方法與液相色譜法檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性，且在所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足使用要求，且具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，適用于玉米、小麥、稻谷等糧食的ZEN和DON快速定量檢測(cè)。