基于斑馬魚模型的茶多酚及兒茶素單體降糖作用研究

譚蓉 ，劉均 ，李強(qiáng) *

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2 浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

茶是一種天然綠色飲料， 自古以來被稱為百病之藥，飲茶不僅可以防老、養(yǎng)生，還能夠增強(qiáng)神經(jīng)興奮、消食利尿。 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)步入了整體和系統(tǒng)醫(yī)學(xué)時代， 向世界介紹茶葉的功效，需要開展現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)研究，促進(jìn)茶葉療效具象化辨析論證。 當(dāng)前研究已經(jīng)證實(shí)茶葉中含有豐富的功能活性物質(zhì)， 如茶多酚（Tea polyphenols，TP）、茶多糖、茶色素等，這些功能活性成分?jǐn)z入后對身體健康有益。 TP 在腸道內(nèi)可以抑制淀粉酶活性[1-2]。 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）進(jìn)入腸道內(nèi)可以抑制脂質(zhì)消化吸收[3]，進(jìn)入體內(nèi)可以促進(jìn)脂肪氧化利用[4]、抑制糖異生[5]，降低胰島素拮抗[3，6]；除多酚類外，咖啡堿、茶黃素等也具有健康干預(yù)效應(yīng)。 咖啡堿攝入可以促進(jìn)脂肪消耗、降低脂肪沉積[7]，茶黃素降低HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)沉積、促進(jìn)脂肪酸氧化等[8-9]。

糖尿病是一種世界性疾病， 可以分為胰島素分泌缺陷和胰島素作用障礙型兩種糖尿病類型，但兩者的共同特點(diǎn)是持續(xù)高血糖可造成多種臟器衰竭，嚴(yán)重?fù)p害眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)。 目前，在糖尿病基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)主要是以大小鼠為對象構(gòu)建病理模型為主， 但以大小鼠為對象開展的實(shí)驗(yàn)研究，普遍存在試驗(yàn)周期長、試驗(yàn)費(fèi)用高等特點(diǎn)， 較難滿足當(dāng)前對于高通量藥物篩選及評價的實(shí)驗(yàn)需求。 斑馬魚（Zebrafish）生物模型因而正式進(jìn)入了科研視野， 并已成為生命科學(xué)研究的新寵。斑馬魚是一種脊椎模式生物，與人類基因具有高度相似性。利用斑馬魚構(gòu)建的人類疾病模型，如構(gòu)建糖尿病[10-11]、高血脂[12-13]、高尿酸癥[14-15]、失眠[16-17]等，不僅具有試驗(yàn)周期短、成本低等顯著優(yōu)勢，而且可以有效開展靶向藥物篩選以及藥物安全與毒理評價研究。 此外，通過斑馬魚在體實(shí)驗(yàn)研究，還可以有效彌補(bǔ)體外細(xì)胞試驗(yàn)和大小鼠哺乳類動物實(shí)驗(yàn)之間的生物學(xué)斷層， 完善現(xiàn)有藥物研發(fā)及評價體系。在糖尿病斑馬魚模型研究方面，采用的建模方式與糖尿病大小鼠的建模方式相近， 方法如下：腹腔注射四氧嘧啶或鏈脲佐菌素[18-19]溶液；四氧嘧啶與葡萄糖溶液聯(lián)用誘導(dǎo)[20]；采用過度飼喂法建立胰島素抵抗型糖尿病[21]，但這些模型主要是以斑馬魚成魚為對象構(gòu)建， 以斑馬魚幼魚為對象開展的糖尿病模型建設(shè)較為鮮見。 研究團(tuán)隊經(jīng)過前期研究，以斑馬魚幼魚為對象，采用葡萄糖與四氧嘧啶聯(lián)用成功構(gòu)建了胰島素依賴型糖尿?。↖nsulin-dependent diabetes mellitus， IDDM）斑馬魚模型[22]，為糖尿病病理研究和藥物篩選提供了多方案參考。

當(dāng)前細(xì)胞和大小鼠實(shí)驗(yàn)表明茶可能具有降糖效應(yīng)[23-24]，研究以茶葉提取物及其主要功能成分為主，如TP 和EGCG 等。TP 是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，包括黃烷醇類、花色苷、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等，以黃烷醇（兒茶素）類為主，其主要單體包括 EGCG、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）。文章采用研究團(tuán)隊自建的IDDM 斑馬魚模型為基礎(chǔ)[22]，重點(diǎn)關(guān)注并開展了TP 及其四種主要兒茶素單體的降糖效應(yīng)評估與比較研究，為科學(xué)茶飲、茶葉健康知識普及， 以及為茶及代用茶健康功效評價提供新的策略與視野。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器及試劑

（1）主要儀器：水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（Multiskan SkyHigh，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；手持式高速勻漿機(jī)（MY-20，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；全自動智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱（天津市宏諾儀器有限公司）；精密電子天平（AL-204，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；離心機(jī)（3K1S，德國 sigma 離心機(jī)公司）。

（2）試驗(yàn)試劑：TP 及兒茶素單體（浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制），葡萄糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）， 四氧嘧啶 （CAS 號：2244-11-3，純度≥98.0%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司），阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司），三卡因甲磺酸（CAS 號：886-86-2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.02，南京建成生物工程研究所）。 葡萄糖檢測試劑盒（葡萄糖氧化酶法，南京建成生物工程研究所）。

（3） 儲備液制備：5 mg/mL TP 及兒茶素單體儲備液（以生藥量計）制備：稱取0.5 g TP 及兒茶素單體分別用蒸餾水溶解定容至100 mL，于4 ℃冷藏備用。 按照GB/T 8313—2018 規(guī)定的檢測方法檢測，TP 純度為 83.70%， 含 33.45% EGCG、7.73% ECG、3.55% EGC、2.80% EC 和 0.88%咖啡堿；EGCG 純度為 77.89%；EC 純度為 86.29%；EGC 純度為 77.75%；ECG 純度為 84.32%。

220 mg/mL 葡萄糖儲備液制備： 稱取44 g 葡萄糖于燒杯中， 用蒸餾水溶解定容至200 mL，冷藏備用。 1 mmol/L 四氧嘧啶儲備液制備： 稱量0.0144 g 四氧嘧啶于燒杯中， 加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙獠⒍ㄈ萦?00 mL，冷藏備用。50 mg/mL ACA（以生藥量計）儲備液制備：稱取5 g ACA 于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙膺^濾后定容至100 mL，于4 ℃冷藏備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

斑馬魚（3 月齡，AB 型，上海費(fèi)曦生物科技有限公司）。 斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進(jìn)行。 每個產(chǎn)卵盒中按 1∶1 放入公魚和母魚， 放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。光周期設(shè)置為：14 h 光照與10 h 黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便， 清洗后換孵育水 （60 μg/mL 海鹽水）， 置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫孵育， 隔24 h 換液一次，并去掉卵膜和死卵。 處理結(jié)束時，采用三卡因甲磺酸對斑馬魚進(jìn)行麻醉處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兒茶素降糖效應(yīng)評估

基于前期研究[22]， 將 5 dpf （5 days post fertilization） 野生型 AB 系斑馬魚給予22 mg/mL葡萄糖+0.02 mmol/L 四氧嘧啶聯(lián)合孵育24 h 以誘導(dǎo)糖尿病模型[22]，然后將已建立的糖尿病斑馬魚隨機(jī)分組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)20 條，分別給予 22 mg/mL 葡萄 糖與 0、15、30 和 45 μg/mL TP 或 EGCG 或 EGC 或 EC 或 ECG 或 ACA 聯(lián)合孵育 48 h，分別記為 MC、T-15/30/45 TP 或 EGCG或 EGC 或 EC 或 ECG 或 ACA。 正常生理斑馬魚用 0 和 22 mg/mL 葡萄糖孵育 72 h （隔 24 h 換液一次），設(shè)置為NC1 和NC2 對照組。治療結(jié)束后取樣用于測定葡萄糖含量。

1.2.2 TP 及兒茶素降糖效應(yīng)比較研究

將5 dpf 野生型AB 系斑馬魚在22 mg/mL 葡萄糖+0.02 mmol/L 四氧嘧啶聯(lián)合孵育條件下孵育24 h 以誘導(dǎo)糖尿病模型[22]，然后將已建立的糖尿病斑馬魚隨機(jī)分為8 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)30 條，分別給予 22 mg/mL 葡萄糖、22 mg/mL 葡萄糖+30 μg/mL TP 或 EGCG 或 EGC 或 EC 或 ECG或 ACA 聯(lián)合孵育 48 h，分別記為 MC、T-30 TP 或EGCG 或 EGC 或 EC 或 ECG 或 ACA。正常生理斑馬魚用 0 和 22 mg/mL 葡萄糖孵育 72 h （隔 24 h換液一次），設(shè)置為NC1 和NC2 對照組。治療24 h和48 h 后分別取樣用于測定葡萄糖含量。

1.3 檢測方法

試驗(yàn)結(jié)束時，每個重復(fù)取10 條魚用于測定葡萄糖含量， 葡萄糖含量檢測按如下步驟進(jìn)行：取100 μL 磷酸緩沖鹽溶液于裝魚的1.5 mL 離心管中，采用高速手持式勻漿機(jī)勻漿1 min，直至魚體組織裂解充分， 然后于4 ℃下以2500 轉(zhuǎn)/秒離心10 min， 結(jié)束后取上清樣2.5 μL 采用葡萄糖檢測試劑盒（葡萄糖氧化酶法）測定葡萄糖濃度，其測定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步處理后，用Graphpad Prism 6.0 繪圖，并用 SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)， 差異顯著性采用Duncan 分析并將進(jìn)行多重比較，p＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于IDDM 斑馬魚的 TP 和 EGCG 降糖作用評估

基于IDDM 斑馬魚的TP 和EGCG 降糖效應(yīng)結(jié)果見圖1。 相比NC1 組，NC2 組斑馬魚葡萄糖值水平增加了 1.98 倍（p＜0.05），MC 組增加了 2.28 倍（p＜0.05）。 相比 MC 組，T-15 TP、T-30 TP 和 T-45 TP 組斑馬魚葡萄糖值水平分別減少了58.22%、50.08%和 54.20%， 差異均顯著 （p＜0.05）；T-15 EGCG、T-30 EGCG 和 T-45 EGCG 組斑馬魚葡萄糖值水平分別減少了55.47%、33.20%和26.71%，差異均顯著 （p＜0.05）；T-15 ACA、T-30 ACA 和 T-45 ACA 組斑馬魚葡萄糖值水平分別減少了60.56%、72.59%和 70.55%，差異均顯著（p＜0.05）

圖1 基于 IDDM 斑馬魚的 TP（a）、EGCG（b）和 ACA（c）降糖作用評估Fig. 1 Effects of TP （a）， EGCG （b） and ACA （c） on the hypoglycemic effects in zebrafish with IDDM

2.2 基于 IDDM 斑馬魚的 EGC、EC 和 ECG 降糖作用評估

基于 IDDM 斑馬魚的 EGC、EC 和 ECG 降糖效應(yīng)結(jié)果見圖2。相比NC1 組，NC2 組斑馬魚葡萄糖值水平增加了 3.85倍 （p＜0.05），MC 組增加了4.38 倍 （p＜0.05）。 相比 MC 組，T-15 ECG、T-30 ECG 和T-45 ECG 組斑馬魚葡萄糖值水平分別減少了 38.94%、46.41%和48.13%，差異均顯著（p＜0.05）；T-30 EC 和 T-45 EC 組斑馬魚葡萄糖值水平分別減少了25.06%、28.13%和29.01%，差異均顯 著 （p ＜0.05）；T-15 EGC、T-30 EGC 和 T-45 EGC 組斑馬魚葡萄糖值水平分別減少了42.89%、33.85%和 31.58%，差異均顯著（p＜0.05）。

圖2 基于 IDDM 斑馬魚的 EGC（a）、EC（b）和 ECG（c）降糖作用評估Fig. 2 Effects of EGC （a）， EC （b） and ECG （c） on the hypoglycemic effects in zebrafish with IDDM

2.3 基于IDDM 斑馬魚的兒茶素降糖作用比較

基于IDDM 斑馬魚的兒茶素降糖效應(yīng)比較研究結(jié)果見圖 3。 治療 24 h 后，相比 NC1 組，NC2 組斑馬魚葡萄糖值水平增加了1.73 倍 （p＜0.05），MC組增加了 1.91 倍（p＜0.05）。 相比 MC 組，T-30 TP、T-30 EGCG、T-30 EGC、T-30 EC、T-30 ECG 和 T-30 ACA 組斑馬魚葡萄糖值水平均不同程度降低，其中以T-30 ACA 組降低幅度最大， 達(dá)到55.54%（p＜0.05）， 然后依次是 EC （28.88%，p＜0.05）、EGC（22.45% ，p ＜0.05）、ECG （17.87% ，p ＞0.05）、TP（10.57%，p＞0.05）、EGCG（6.57%，p＞0.05）。

圖3 基于IDDM 斑馬魚的兒茶素降糖作用比較Fig. 3 Comparison of hypoglycemic effects of catechins in zebrafish with IDDM

治療 48 h 后， 相比 NC1 組，NC2 組斑馬魚葡萄糖值水平增加了 2.21 倍 （p＜0.05），MC 組增加了 2.40 倍 （p＜0.05）。 相比 MC 組，T-30 TP、T-30 EGCG、T-30 EGC、T-30 EC、T-30 ECG 和 T-30 ACA 組斑馬魚葡萄糖值水平均顯著降低 （p＜0.05）， 其中以 ACA 組降低幅度最大， 達(dá)到了63.53% ， 然 后 依 次 是 ECG （50.55% ）、EGCG（45.51%）、EC（41.92%）、TP（39.86%），降低幅度最低是 EGC（37.19%）。

3 討論

我國有著悠久的茶文化， 茶已經(jīng)與我們的生活深度融合，茶的健康功效記載可遠(yuǎn)溯至《神農(nóng)本草經(jīng)》。 隨著當(dāng)代科學(xué)的發(fā)展，茶葉的健康功效逐步被科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。 經(jīng)動物[25-27]和人群[28-31]試驗(yàn)表明， 茶葉提取物或兒茶素類物質(zhì)可以在腸道內(nèi)與脂質(zhì)、脂肪酶形成復(fù)合體抑制脂質(zhì)吸收，通過抑制淀粉酶活性減少葡萄糖吸收， 通過改善胰島素敏感性增強(qiáng)葡萄糖生物利用等改善高血糖癥。

研究發(fā)現(xiàn)，在15~45 μg/mL（以生藥量計）濃度范圍內(nèi)，EGCG 和EGC 的降糖效應(yīng)并不存在明顯的劑量濃度依賴效應(yīng)， 均表現(xiàn)為隨著劑量濃度的增加降糖效應(yīng)略有下降， 這可能與藥物致死效應(yīng)有關(guān)，斑馬魚幼魚體質(zhì)弱，雖然基于前期研究藥物劑量設(shè)置在安全劑量濃度范圍內(nèi)， 但隨著EGCG 和EGC 藥物劑量濃度逐漸靠近臨界值，可能對斑馬魚機(jī)體健康狀態(tài)或代謝狀態(tài)有臨界點(diǎn)效應(yīng)影響， 故采用斑馬魚幼魚開展功能評價前需要開展藥物耐受性分析研究， 而后指導(dǎo)開展功能評價。 同時研究發(fā)現(xiàn)，EC 和ECG 均表現(xiàn)為隨著劑量濃度的增加降糖效應(yīng)在增強(qiáng)， 推測斑馬魚對EC和ECG 的藥物耐受性強(qiáng)于EGCG 和EGC，具體的結(jié)論還需后續(xù)繼續(xù)研究。 另外從孵育液中兒茶素作用濃度（以生藥量計）與降糖效應(yīng)（%）的相關(guān)關(guān)系上看，包括糖尿病治療藥物ACA 在內(nèi)的6 個治療組治療48 h 后，ACA 的降糖效應(yīng)最強(qiáng)， 在茶多酚及兒茶素單體中降糖表現(xiàn)由強(qiáng)到弱的依次是ECG＞EGCG＞EC＞TP＞EGC。

斑馬魚屬于新興模式生物，采用斑馬魚幼魚開展功能評價有其自身的特殊性，因此為科學(xué)開展功能評價需在開展藥物耐受性的基礎(chǔ)上篩選宜用的劑量效應(yīng)濃度。 TP 和EGCG 是比較知名的茶葉功能活性成分， 其降糖作用研究已有諸多報道[25，28]。研究中的斑馬魚除可以直接從水中攝取葡萄糖作為能源物質(zhì)外， 還可以直接消耗體內(nèi)的卵黃囊維持自身生存生長需要。 蛋白質(zhì)和脂肪作為卵黃囊內(nèi)源營養(yǎng)的主要營養(yǎng)成分， 其代謝對斑馬魚十分重要。研究表明TP 和兒茶素進(jìn)入腸道內(nèi)對腸道內(nèi)的營養(yǎng)成分消化吸收有重要調(diào)節(jié)作用， 對斑馬魚的降糖作用可能與對這些營養(yǎng)成分的消化調(diào)節(jié)作用有關(guān)。TP 可以抑制胰脂肪酶活性[32]、降低膽固醇重吸收[33]，促進(jìn)糞便脂質(zhì)排泄[34]等減少脂源性能量吸收。EGCG 可以抑制胰脂肪酶和淀粉酶活性[35-36]，下調(diào)鈉依賴的葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 的表達(dá)減少葡萄糖吸收[37]等改善糖脂代謝平衡。 尤其是EGCG，研究發(fā)現(xiàn)EGCG 在動物腸道內(nèi)可以特異性吸附膽汁酸鹽，抑制膽酸鹽重吸收。以考來烯胺與膽汁酸鹽的結(jié)合率作為100%，EGCG 對6 種膽汁酸鹽的吸附結(jié)合率平均高達(dá)60%以上[38]，其中?；悄懰徕c（78.99%）、甘氨膽酸銨（90.14%）、牛黃石膽酸（82.00%）、?；敲撗跄懰幔?3.48%）。 多酚類物質(zhì)屬于大分子物質(zhì)難以直接越過腸壁， 其主要阻滯在腸腔中， 但是在腸道微生物的作用下可以被降解為小分子酚類物質(zhì)， 這些物質(zhì)同樣具有較強(qiáng)的抗氧化活性和清除自由基作用[39-41]。當(dāng)茶葉和兒茶素進(jìn)入機(jī)體后對體內(nèi)糖脂代謝存在重要調(diào)控作用。 TP 及EGCG 和ECG 可以促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素，促進(jìn)葡萄糖利用[42-44]。 EGCG 可以通過保護(hù)胰島細(xì)胞[45]，促進(jìn)骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 的表達(dá)減輕胰島素信號封鎖提高葡萄糖利用[26，44]。 另外，茶葉提取物對斑馬魚脂質(zhì)代謝有著顯著影響，可以顯著上調(diào)肝臟ACOX1、酰基輔酶A 脫氫酶和PPARA 基因的表達(dá)，以及顯著下調(diào)脂肪細(xì)胞因子信號抑制因子3b 基因的表達(dá)[46]。

研究發(fā)現(xiàn)，除TP 和EGCG 外，其它兒茶素如EGC、EC 和 ECG 也具有明顯的降糖效應(yīng)。 ECG對脂代謝有重要調(diào)節(jié)作用已有報道，LU 等[47]以HepG2 細(xì)胞為對象研究茶葉中多酚物質(zhì)對脂代謝的影響， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)兒茶素對膽固醇合成代謝有明顯的抑制作用，且抑制性強(qiáng)弱順序依次是：沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）＞EGCG＞ECG＞沒食子酸（GC）＞EGC＞楊梅黃素＞檞皮素＞兒茶酸 （C）＞EC，抑制率范圍為7%~35%， 綜合來看其抑制作用強(qiáng)弱可能與兒茶素沒食子?；螧 環(huán)（B ring）或者結(jié)構(gòu)中含有的沒食子酸基（galloyl moieties）有關(guān)，且酯型強(qiáng)于非酯型。 但是，目前包括ECG 在內(nèi)的除EGCG 外的兒茶素單體對糖脂代謝的影響研究還比較鮮見。 從研究結(jié)果看，ECG 對糖代謝的調(diào)控能力可能與EGCG 相近，值得進(jìn)一步研究關(guān)注。

研究重點(diǎn)研究了兒茶素的降糖作用， 但未能拓展研究除多酚類之外的功能活性成分對糖代謝的影響，譬如當(dāng)前有研究指出咖啡堿[2，7]、茶黃素[8-9]等也具有明顯的降糖作用， 因此下一步還將充分利用斑馬魚生物模型的高通量技術(shù)優(yōu)勢， 深入研究兒茶素藥物耐受性、 毒理影響機(jī)制及其對糖代謝調(diào)節(jié)作用機(jī)制， 以及深入研究并挖掘茶葉中可能存在的除兒茶素之外的降糖功能活性成分并開展靶點(diǎn)效應(yīng)研究， 尤其是需要開展功效成分間協(xié)同或拮抗作用研究，為科學(xué)飲茶提供基礎(chǔ)信息。

4 結(jié)論

經(jīng) IDDM 斑馬魚試驗(yàn)評價，15~45 μg/mL TP、EGCG、EGC、EC 和 ECG（以生藥量計）均能夠降低糖尿病斑馬魚葡萄糖值水平， 但其降糖效應(yīng)弱于糖尿病治療藥物ACA。相同生藥量下（30 μg/mL），降糖作用表現(xiàn)依次是 ECG＞EGCG＞EC＞TP＞EGC，酯型兒茶素降糖效應(yīng)稍強(qiáng)于非酯型，因而TP 及其主要兒茶素單體具有明顯的降糖效應(yīng)， 且降糖效應(yīng)與其濃度和作用時間有關(guān)。 通過斑馬魚在體實(shí)驗(yàn)研究， 表明茶多酚及主要兒茶素均具有明顯的降糖效應(yīng)。 除EGCG 外，ECG 的降糖效應(yīng)值得后續(xù)深入探討和研究。