大葉苦丁茶多糖的研究進展

張現(xiàn)珠，王瀟瀟 ，陳貴杰，謝旻皓，曾曉雄 *

（1.南京財經大學食品科學與工程學院/糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

苦丁茶也稱“茶丁”“富丁茶”“皋盧茶”，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用代茶植物飲品， 有著悠久的飲用歷史，具有重要的藥用和保健價值。早至東漢時期，苦丁茶就已經被廣泛飲用?！侗静菥V目》記載苦丁茶能止渴、明目、除煩、消痰、利水、利咽[1]。 關于制作苦丁茶源植物的說法不一， 目前市場上流通的主流苦丁茶商品是由來于冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬（Ilex）植物的“大葉苦丁茶”和木犀科（Oleaceae）女貞屬（Ligustrum）的“小葉苦丁茶”[2]。 大葉苦丁茶即冬青科苦丁茶是接受度最高、流通最廣的苦丁茶，冬青科苦丁茶包含苦丁茶冬青 （Ilex kudingcha C.J. Tseng， 也稱扣樹 I.kaushue S. Y. Hu）、大葉冬青（I. latifolia Thunb）以及枸骨（I. cornuta Lindl）等[3-4]，其中苦丁茶冬青（I.kudingcha）是海南和兩廣地區(qū)的主要品種，而大葉冬青（I. latifolia）主要分布在華東和湖北等地[2]。

苦丁茶傳統(tǒng)上用于治療熱病、解毒、脫水和腹痛等[4]。 許多研究表明，飲用大葉苦丁茶能增強機體的抗氧化能力，還具有預防高脂血癥、護肝以及保護心臟等作用[5-7]。 大葉苦丁茶提取物具有保護心血管健康、修復DNA、抗焦慮、抗炎癥、緩解糖尿病和神經保護等功能活性[8]。大葉苦丁茶富含皂苷、黃酮、多酚、揮發(fā)油以及多糖等有效成分[9]，其微量元素鋅、錳、銅、鎂元素也明顯高于其他茶葉[10]。近年來， 人們主要專注于大葉苦丁茶中多酚和三萜等活性成分的研究， 大葉苦丁茶多糖的相關研究報道較少。 大葉苦丁茶多糖由阿拉伯糖、 甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和果糖等組成[11]，其結構多樣、毒性低、副作用少[12-13]，是一種極具開發(fā)價值的生物活性物質。

文章對大葉苦丁茶多糖的提取、分離純化、結構分析以及生物活性等方面展開綜述， 為進一步挖掘大葉苦丁茶多糖的潛在價值和大葉苦丁茶多糖的開發(fā)利用提供一定的科學依據(jù)和理論基礎。特別說明的是，由于馬黛茶（Mate）的源植物巴拉圭冬青（I. paraguariensis）與大葉苦丁茶同為冬青屬（Ilex）植物，親緣關系相近，且成分組成非常相似，文章部分章節(jié)也將其一并討論。

1 大葉苦丁茶多糖的提取

水浸提法是提取大葉苦丁茶多糖的常用方法，水能快速的透過苦丁茶組織，使大葉苦丁茶中的多糖溶于水中[11]。 以熱水浸泡大葉苦丁茶更能加快水分子的運動， 既加快苦丁茶多糖的溶解速度，也增加了苦丁茶溶出物的含量。大葉苦丁茶多糖的提取工藝流程大致如下： 烘干→粉碎→過篩→熱水浸提→醇沉→干燥→粗多糖。 表1 列出了大葉苦丁茶提取的部分典型例子。

表1 苦丁茶粗多糖的提取Table 1 Extraction of crude polysaccharides from Kudingcha

綜合上表可知，熱水浸提-乙醇沉淀是提取大葉苦丁茶多糖最主要的方法。 不同提取工藝提取的苦丁茶粗多糖提取率在0.65%~8.14%之間，可能有多種原因導致了提取率的差異。 多糖提取量隨著液料比和提取溫度的增加而增加， 但液料比增到一定的程度后多糖提取量下降。 液料比增大使多糖的濃度差低，易于從細胞中溶出，溫度的升高加速分子的擴散解附作用， 從而增加多糖的浸出率，但是液料比過大不僅不能增加多糖提取量，而且還使?jié)饪s樣品的負擔更大。 多糖提取量隨著溫度的升高而增加， 溫度的升高能夠提高多糖的析出速率和得率，但溫度過高含糖量會下降，溫度過高會破壞多糖結構，得率降低?？喽〔璐侄嗵翘崛÷氏嗖钶^大也與所選擇的原料有一定關系。 黃敏桃等[23]對比了不同產地的苦丁茶多糖含量發(fā)現(xiàn)，廣西產的苦丁茶多糖含量高于廣東和海南。大葉苦丁茶置放的時間越久， 其成分會有所改變，其多糖含量也會明顯減少， 多糖的提取量也相應減少[17]。 另外，測定方法也會對提取得率的計算結果產生影響。測定多糖含量通常采用苯酚-硫酸法比色法，該法步驟簡單、靈敏度高、顯色穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、回收率高、結果準確，但各自的報道中，對反應溫度的控制、試劑中苯酚及硫酸用量、反應時間不盡相同[16]。

傳統(tǒng)的熱水浸方法具有溶劑易得、 條件簡單、操作簡便以及危險系數(shù)較小等優(yōu)點，但是該方法具有浸提次數(shù)多、提取時間長、提取率較低等缺點。時代的不斷進步推動著多糖提取技術的不斷發(fā)展和完善，提取技術從最初的簡單溶劑提取法向更先進的儀器提取法以及多種技術融合的方式發(fā)展，研究者們也嘗試將超臨界CO2流體萃取技術等新型提取工藝應用到大葉苦丁茶多糖的提取中[22]。 例如，韋曉潔等[22]采用超臨界CO2流體萃取技術提取苦丁茶多糖，以正交實驗優(yōu)化了萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、夾帶劑以及夾帶劑劑量等影響茶多糖得率的參數(shù)，在最優(yōu)萃取條件下苦丁茶多糖的提取率達到7.05%，較傳統(tǒng)提取工藝而言，提取時間明顯減少，提取率明顯增高[22]。 超臨界CO2流體萃取具有提取溫度低、萃取率高、萃取周期短、低耗以及污染小等優(yōu)點，適用于苦丁茶多糖的提取。 相較于傳統(tǒng)的提取方法，超臨界CO2流體萃取能夠在低溫下萃取苦丁茶多糖并能夠最大限度保留多糖的生物活性。 隨著多糖研究的進一步深入，更多更先進的提取方法將會不斷被探究，尋求一種高效、節(jié)能、低成本、高提取率的大葉苦丁茶多糖提取方法是未來大葉苦丁茶多糖研究的方向之一。

2 大葉苦丁茶多糖的分級純化

大葉苦丁茶多糖提取液中往往會含有蛋白質、色素、脂類、無機鹽等雜質，這些非多糖組分的存在會對苦丁茶多糖后期的定性分析、含量測定、分子量測定以及結構表征等造成干擾， 也可能對苦丁茶多糖的生物活性產生一定的影響。 因此在苦丁茶多糖分離純化的過程中需要將這些雜質去除，目前常常采用乙醇沉淀、透析、Sevag 法脫蛋白等方式純化粗多糖（見表1）。

大葉苦丁茶多糖作為生物大分子化學結構復雜，為研究其化學結構和生物活性，研究者們采用多種純化方法以得到性質相對統(tǒng)一的苦丁茶多糖組分。 多糖分離純化的方法包含分級沉淀、 鹽析法、金屬絡合物法、季銨鹽沉淀法、制備區(qū)域電泳法、超濾法、色譜法等[24]。 目前應用范圍最廣泛的多糖純化方法為色譜法，包括離子交換色譜法、凝膠柱色譜法等， 使混合物中各多糖組分盡可能的彼此區(qū)分開。 表2 列出了大葉苦丁茶多糖組分的分離純化的相關報道。

表2 大葉苦丁茶多糖的分級純化Table 2 Fractional purification of Kudingcha polysaccharides

續(xù)表

從表2 可知大葉苦丁茶多糖的分離純化與其他植物多糖的純化方式一致， 使用陰離子交換層析配合乙醇分級沉淀和凝膠層析的方法得到相對均一的多糖組分， 一般可以從大葉苦丁茶粗多糖中分離得到2~4 個多糖組分，包括中性多糖和酸性多糖。大葉苦丁茶多糖的差異性與蛋白質含量密切相關。 多糖中的蛋白質含量不僅有利于多糖的生物活性， 也可作為多糖質量的一個指標性因子。 因此脫蛋白是一項很重要的步驟。 Sevag 法一次只能除去少量蛋白質，需多次重復進行方能達到滿意效果。與Sevag 法相比，DEAE-52 纖維素在分離大葉苦丁茶多糖的同時具有脫色、脫蛋白的作用，分離組分中的蛋白質含量急劇下降，具有較高的純化效果。

3 大葉苦丁茶多糖的結構特征

多糖的活性和功能與其結構密切相關，大葉苦丁茶多糖的結構表征是闡明其功能機制的必要條件， 也是大葉苦丁茶多糖開發(fā)利用的科學基礎。 研究者們常常聯(lián)合使用高效液相色譜儀（HPLC）、氣相色譜儀（GC）、傅里葉轉化-紅外光譜儀（FT-IR）以及質譜儀（MS）、核磁共振波譜儀（NMR）等儀器解析大葉苦丁茶多糖的化學結構[31]。

大葉苦丁茶多糖經過酸水解產生的單糖，經衍生化之后可以采用HPLC、GC-MS 或GC 進行定性和定量分析， 也可以不經過衍生化的步驟利用離子色譜進行分析。 表3 列舉了近年來大葉苦丁茶多糖的單糖組成的相關研究和結果。 表3 中IKPS，SP，ILPS，IKTP，SPI，ILP50-2 為大葉苦丁茶多糖在不同文獻中的縮寫。

表3 大葉苦丁茶多糖的單糖組成Table 3 Monosaccharide composition of Kudingcha polysaccharides

續(xù)表

由于大葉苦丁茶源植物的物種、品種、產地、提取部位等差異， 不同的大葉苦丁茶多糖的單糖組成各不相同，可以看出阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GalA）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GlcA）、果糖（Fru）和少量木糖（Xyl）、巖藻糖（Fuc）以及核糖（Rib） 是大葉苦丁茶多糖的主要單糖組分。 Ara、Gal、GalA、Glc 和 Rha 幾乎出現(xiàn)在所有報道的大葉苦丁茶多糖當中， 特別是Ara 和Gal 含量在大葉苦丁茶多糖中占據(jù)了較大比重。

除了單糖組成， 研究者在分析表征大葉苦丁茶多糖結構時還借助甲基化分析、FT-IR 以及NMR 等表征了大葉苦丁茶多糖的精細結構。 SHI等[35]通過傅里葉轉化-紅外光譜對大葉冬青（I.latifolia）多糖ILP50-2 的結構進行了分析，出現(xiàn)了3386、2933 和 1429 cm-1的特殊峰值， 結果表明其中含有O-H 基團，甲基、亞甲基基團，C-O-C、CO-H 基團，通過GC-MS 的進一步分析得該種多糖是由11 種部分甲基化的糖醇乙酸酯組成，包含11種不同糖苷鍵相連接的殘基，并通過NMR 解析了大葉冬青（I. latifolia）多糖ILP50-2 的精細結構，表明其為 α-L-Araf-（1→， →3）-α-L-Araf-（1→，→5）-α-L-Araf-（1→， →3，5）-α-L-Araf-（1→，→2）-α-L-Rhap-（1→， →2，4）-α-L-Rhap-（1→，β-D-Galp-（1→， →4）-β-D-Galp-（1→， →4）-β-D-Glcp-（1→， →6）-α-D-Manp-（1→， and →3，6）-α-D-Galp-（1→的重復結構 （圖 1）。 MENG等[29]用紫外光譜分析分離純化所得的大葉苦丁多糖 IAPS-1 在 260 到 280 nm 處沒有特殊的吸收峰，表明其中蛋白質和核酸雜質所占比例較少；通過FT-IR 分析得其中含有 O-H、C-H、C-O 基團。通過NMR 分析得該種多糖主要是吡喃葡萄糖基間通過α-1，6 糖苷鍵連接而成且存在→4）-α-LRhap-（1→、→3-α-D-Galp-（1→以及重復的→4）-α-Glup-（1→結構。 KUNGEL 等[36]在紫外光譜260~280 nm 處分析得馬黛茶多糖中幾乎不含蛋白質、多肽、酚類物質，通過FT-IR 測得其含有C=O、C-H、C-O、C-OH 基團，這與所報導的大葉苦丁茶多糖的結構相一致。 ZHAI 等[33]通過FT-IR 分析從苦丁茶中提取的IKTP，和前面所得結果一致都含有 C=O、C-H、C-O、C-OH 基團。 FAN 等[19]通過傅里葉紅外光譜分析在分離純化所得的苦丁茶多糖中發(fā)現(xiàn)了新的基團S=O， 推測該種苦丁茶多糖為硫酸多糖。 MARIA-FERREIRA 等[32]通過 NMR 和甲基化分析發(fā)現(xiàn)，巴拉圭冬青（I. paraguariensis）多糖主要是阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan），包含β-（1→4）-糖苷鍵連接的吡喃型半乳糖 （Galp）主鏈，其O-6 位上連接Ara 糖基單元，這些阿拉伯半乳聚糖也可能與Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖（Rhamnogalacturonan）通過 O-4-Rha 單元相連接。DARTORA 等[34]利用甲基化分析、1D 和 2D NMR技術解析了巴拉圭冬青（I. paraguariensis）多糖SPI組分的精細結構，表明它是一種鼠李半乳糖醛酸聚糖，主鏈結構為→4）-6-OMe-α-D-GalpA-（1→，主鏈間插入了鼠李糖基（α-l-Rhap），Rha 糖基上還連有阿拉伯半乳聚糖（圖2）。

圖1 大葉冬青（I. latifolia）多糖ILP50-2 組分的化學結構Fig.1 Chemical structure of I. latifolia polysaccharide ILP50-2

圖2 I. paraguariensis 多糖SPI 組分的結構Fig.2 Chemical structure of I. paraguariensis polysaccharide SPI

另外，研究者們還利用剛果紅（Congo-red）試驗、掃描電子顯微鏡（SEM）等技術探究了苦丁茶多糖的空間構象和高級結構。例如，SHI 等[35]發(fā)現(xiàn)大葉苦丁茶多糖ILP50-2 組分在溶液中不具有三股螺旋構象，團聚態(tài)的ILP50-2 表現(xiàn)出枝狀不規(guī)則網狀微觀結構和不均勻表面，表面呈無定形結構。

4 大葉苦丁茶多糖的生物活性

4.1 抗氧化作用

近年來， 人們對多糖及復合物的抗氧化活性作用有了越來越深入的認識。已有大量研究指出，從植物中提取分離得到的多糖類化合物具有清除羥基自由基、 活性氧自由基以及二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基等作用。大葉苦丁茶粗多糖具有較強的體外抗氧化活性， 且其抗氧化活性與多糖濃度之間存在良好的量效關系[37]。 FAN 等[19]發(fā)現(xiàn)大葉冬青的粗多糖ILPS， 以及經DEAE-52 纖維素色譜分離得到的 ILPS-1、ILPS-2、ILPS-3 和ILPS-4 四個組分， 均具有較強的DPPH 自由基清除能力、OH 清除能力、O2-清除能力和Fe2+螯合能力。KUNGEL 等[36]研究發(fā)現(xiàn)大葉苦丁冬青多糖的抗氧化活性與其具有的大量-OH、-COOH 和C=O 以及含糖醛酸等官能團有關，并且其水溶性、三重螺旋立體構型和較高的分支度也可能有利于抗氧化活性。 有研究發(fā)現(xiàn)Glc 含量越高的多糖其抗氧化活性越強[38]，糖醛酸含量越高的多糖其抗氧化作用越明顯[39-40]。 FAN 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，大葉冬青苦丁茶多糖清除活性氧自由基的能力隨糖醛酸含量升高及分子量增加呈明顯上升趨勢。 多糖清除超氧陰離子的機制可能與O-H 鍵的離解能和給電子取代基的加入有關。 雖然多糖清除羥自由基的機制尚不清楚， 但有人提出多糖可以抑制羥自由基的形成，這可能是由于提取氫或電子的機制[45]。 此外， 已證實糖醛酸含量和平均分子量對清除羥基自由基有顯著作用[41]。

在體外大葉苦丁茶多糖2 mg/mL 濃度時清除DPPH 自由基能力達到 72%[37]，0.5 mg/mL 濃度時即顯示出較強清除羥自由基的能力[42]，0.6 mg/mL濃度時抑制H2O2對紅細胞溶血的作用與0.2 mg/mL 的VC 相近[20]。粗多糖ILPS 表現(xiàn)出最強的清除活性， 其清除活性隨著樣品濃度的增加而明顯增加，范圍從 62.5~1000 μg/mL。 ILPS 粗品的清除活性的 IC50分別為 118.1±3.3 μg/mL[19]。目前，關于大葉苦丁茶多糖的體內抗氧化機制尚未有報道。

4.2 抑菌作用

大葉苦丁茶樣品的抗菌活性與活性成分含量呈一定的相關性。 大葉苦丁茶多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有一定的抑菌作用[37]，抑菌機制可能為破壞微生物的細胞壁與細胞膜， 引起形態(tài)改變導致細菌自溶而產生抗菌作用[43]。林雄平等[44]研究大葉苦丁茶水溶性多糖對大腸桿菌、 變形桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉7 種常見的食品腐敗菌的抗菌效果，結果表明大葉苦丁茶多糖提取物的抗細菌活性比其抗真菌活性強， 且對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為5 mg/mL。 多糖的抑菌機理大致可以分為3 種，即阻止有害菌進入細胞、破壞有害菌的細胞膜與細胞壁、影響有害菌的基因表達[43]。 大葉苦丁茶多糖具有一定的抗菌作用， 但其抗菌的作用機制還有待更深入研究。

4.3 降血糖作用

目前糖尿病的治療主要依靠注射胰島素、口服磺酰脲類和雙胍類降血糖藥物， 長期服用降糖藥會對人體產生較大的副作用， 還會導致胰島素依賴，因此從天然產物中篩選降血糖藥物，是開發(fā)糖尿病藥物的一條可行途徑。 于淑池等[45]利用不同因素誘發(fā)的高血糖模型小鼠研究了大葉苦丁茶多糖對四氧嘧啶、腎上腺素、葡萄糖等誘發(fā)的高血糖的降血糖作用， 結果發(fā)現(xiàn)大葉苦丁茶多糖能較好地降低糖尿病小鼠血糖水平， 且表現(xiàn)出一定的量效關系，但高劑量苦丁茶多糖組（300 mg/kg·d）稍低于降糖藥鹽酸二甲雙胍（125 mg/kg·d）組的治療水平。 四氧嘧啶對胰島β 細胞具有特異性毒性作用，通過產生超氧自由基破壞β 細胞，對胰島β 細胞具有特異性毒性作用， 導致胰島素分泌減少，造成實驗性糖尿病。大葉苦丁茶多糖的攝入可有效降低四氧嘧啶造成的糖尿病小鼠的血糖水平[45]，它可能是通過清除超氧自由基來減少β 細胞的損傷從而降低血糖水平。

4.4 免疫調節(jié)作用

大葉苦丁茶中的活性成分不僅能激活T、B 淋巴細胞、巨噬細胞、細胞毒性T 細胞以及淋巴因子激活的殺傷細胞等免疫細胞， 還能促進IL-1、IL-2、IFN-γ 等細胞因子的分泌，活化補體等[42]。 多糖還能增強巨噬細胞的其他功能， 如釋放活性氧（ROS）和 NO[46]、分泌促炎細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）等。 HU 等[42]研究發(fā)現(xiàn)大葉苦丁茶多糖可能是通過上調巨噬細胞內 TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA 的表達，抑制 NF-κB 信號通路中 p-p65 蛋白的正常表達，上調MAPKs 信號通路中p-ERK、p-JNK、p-p38 蛋白的表達，進而促進 NO、TNF-α、IL-6 等免疫活性因子的分泌，以活化巨噬細胞參與進行復雜的機體免疫活動， 從而起到免疫的作用。SHI 等[35]發(fā)現(xiàn)大葉苦丁茶多糖ILP50-2 組分能夠增強巨噬細胞的吞噬作用并提高了NO 以及TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等細胞因子的釋放，也通過斑馬魚模型證實了它能夠增加ROS 和NO 釋放的活性，具有免疫調節(jié)作用。

4.5 肝保護作用

大葉苦丁茶多糖還具有對急性和慢性肝損傷的保護作用。 FAN 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠飼喂100和200 mg/kg 的大葉苦丁茶多糖14 d， 能夠顯著降低四氯化碳誘導的急性肝損傷。 相比肝損傷模型組， 大葉苦丁茶多糖處理能夠降低血清中谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）的活性，提高肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，并降低丙二醛（MDA）的含量。200 mg/kg 的大葉苦丁茶多糖的肝保護效果接近甚至超過護肝藥水飛薊素。 ZHAI 等[33]給小鼠飼喂 200、400 和 800 mg/kg 大葉苦丁茶多糖 8 周，能夠顯著減輕高果糖攝入引起的肝臟損傷。 大葉苦丁茶多糖能夠降低血清中AST 和ALT 的活性以及總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、指血栓素A2 和內皮素-1 的水平， 同時提高肝臟中SOD 和GSH-Px 活性并降低MDA 的含量。

5 展望

大葉苦丁茶作為一種傳統(tǒng)中藥材， 相對于名貴藥材而言資源更豐富， 其葉子中的多糖含量高于其他部位，老葉中更多[47]。 在提取利用苦丁茶三萜類、皂甙及多酚等功能成分的同時，開發(fā)、利用其多糖資源具有良好的前景。目前，國內外對苦丁茶多糖的研究還不夠系統(tǒng)， 對多糖的理化性質研究方面還停留在熱穩(wěn)定性和化學性質上， 對結構表征的研究局限于一級結構，對構-效關系的研究并未涉及。 對苦丁茶多糖活性的研究局限于抗氧化、降血糖、免疫調節(jié)等少量方面，且大多采用體外實驗，整體或體內實驗研究報道較少。特別值得注意的是， 關于苦丁茶多糖作用機制的研究幾乎沒有，目前的資料難以系統(tǒng)、準確地反應苦丁茶多糖活性的全貌。 這對進一步的藥效學和藥理學研究，以及識別潛在的作用位點存在較大阻礙，也限制了苦丁茶多糖相關產品的開發(fā)與研究。另外，焦安妮[48]在研究開發(fā)大葉苦丁茶多糖的納米制劑精深加工產品，給新產品的開發(fā)提供了一個新思路。朱科學等[49]研究苦丁茶多糖流變學特性，發(fā)現(xiàn)溶液的表觀粘度隨著濃度的增加而升高，表現(xiàn)出“非牛頓流體”特性以及“凝膠體”特性，具有良好的抗降解性能，可用于制作凝膠。研究結果為大葉苦丁茶多糖在食品工業(yè)中的應用提供一定的理論支持。未來，需繼續(xù)加深大葉苦丁茶多糖的結構以及生物學活性和作用機制的研究， 并加大開發(fā)利用力度，將其應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。