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    香樟及近緣種的親緣關(guān)系分析

    2022-04-15 02:02:50孫維紅萬曉會韓國勇鄒雙全鄒小興
    關(guān)鍵詞:油樟龍腦親緣

    向 雙, 孫維紅, 萬曉會, 丁 樂, 韓國勇, 鄒雙全, 鄒小興

    (1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002;2.福建省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院,福建 福州 350001; 3.福州植物園,福建 福州 350000)

    香樟(Cinnamomumcamphora)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物,是重要的自然生態(tài)樹種,也是寶貴的芳香植物資源,集香料、藥用、材用等多功能于一體[1].研究表明,其枝、葉、果均含有豐富的化學(xué)成分[2-5],如黃酮類、糖苷類、揮發(fā)油、木脂素類等,具有抗癌止痛、驅(qū)蟲抑菌、抗氧化等多種藥理活性[6],利用價值高,開發(fā)意義大.香樟也是越南、韓國、日本、中國臺灣和大陸地區(qū)的間斷分布種.然而香樟種類繁多,有不同的化學(xué)型,引種混亂,給實際生產(chǎn)與利用帶來了挑戰(zhàn).研究不同香樟無性系的遺傳結(jié)構(gòu),探討其親緣關(guān)系,對制定香樟種質(zhì)資源保護(hù)策略、指導(dǎo)優(yōu)良種質(zhì)資源篩選和相關(guān)優(yōu)異基因挖掘具有重要意義.

    分子標(biāo)記技術(shù)在研究不同品系間親緣關(guān)系和遺傳多樣性方面應(yīng)用廣泛[7],包含簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)[8]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism, SRAP)[9]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplifed polymorphic DNA, RAPD)[10]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)[11]等標(biāo)記方式.SNP(single nucleotide polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性,是由單個核苷酸變異導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性.目前所有DNA分子標(biāo)記中多樣性最為豐富的標(biāo)記技術(shù)就是SNP標(biāo)記,具有數(shù)量多、分布廣、代表性強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點[12].SNP標(biāo)記近年來快速發(fā)展,已逐步成為遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳多樣性評價和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[13-16]的首選方法.本研究通過對香樟無性系及近緣種進(jìn)行全基因組重測序開發(fā)SNP標(biāo)記,解析了18份樟科資源(特別是16份香樟無性系)的親緣關(guān)系,探討不同無性系間的系統(tǒng)演化關(guān)系,為不同香樟無性系的鑒定評價以及進(jìn)一步的收集和保存提供依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    收集永安林業(yè)苗圃14個福建選育的芳樟(Cinnamomumcamphoravar.inalooliferaFujita.)無性系,福建省中益制藥有限公司連城基地的1個四川宜賓油樟(C.longipaniculatum)、1個江西的龍腦樟(Cinnamomumcamphorachvar. Borneol)和1個肉桂(C.cassia)無性系,以及1個福建建甌的沉水樟(C.micranthum),共18份無性系.于2019年7月采集所有樣品的嫩葉,用75%酒精和純水洗凈,經(jīng)液氮處理后,置于-80 ℃冰箱中保存.樣品名稱及來源見表1.

    表1 樣品名稱及來源信息Table 1 Sample names and origins

    1.2 基因組DNA提取

    18份無性系基因組DNA的提取采用改良的CTAB方法[17],以1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測,并利用Nano-drop 2000紫外分光光度計(Thermo,美國)檢測DNA的純度和濃度.

    1.3 測序與質(zhì)控

    測序工作由華大基因完成,在全基因組水平上對樣品進(jìn)行重測序分析.利用Trimmomatic軟件實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的質(zhì)控,將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分、過濾.接頭序列、長度太短的序列以及低質(zhì)量讀段、N率較高的序列被濾除,最終獲得質(zhì)量高的讀段.

    1.4 SNP標(biāo)記篩選

    以測序香樟基因組作為參考基因組,利用BWA[18]將序列比對到參考序列上,采用貝葉斯模型對參考序列存在的多態(tài)性位點進(jìn)行篩選和過濾.利用ANNOVAR軟件對檢測篩選出的SNP進(jìn)行功能注釋[19].

    1.5 親緣關(guān)系分析

    基于篩選的多態(tài)性SNP,使用MEGA 7[20]軟件構(gòu)建不同香樟無性系及近緣種的系統(tǒng)進(jìn)化樹,采用NJ(neighbor-joining)算法[21]以及p-distance模型,bootstrap重復(fù)1 000次.不同種間的遺傳距離用系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支長度體現(xiàn),長度越短即代表兩份種質(zhì)之間的親緣關(guān)系越近.使用Cluster軟件[22]對供試無性系進(jìn)行主成分分析.

    1.6 精油提取與成分分析

    分別收集芳樟類群(編號1~11)混合葉、油樟類群(編號12~15)混合葉和龍腦樟(編號16)成熟健康、無病蟲害的葉片.香樟精油提取采用水蒸汽蒸餾法[23].稱取100 g香樟(芳樟、油樟或龍腦樟)葉鮮品,50 ℃下烘干至含水率為5%~13%,粉碎后置于500 mL揮發(fā)油提取器中,加入200 mL超純水加熱提取,提取時間為60~90 min.對提取出的芳樟精油進(jìn)行GC-MS[24]分析,根據(jù)峰面積確定各化學(xué)組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù).色譜條件:初溫68 ℃,以15 ℃·min-1升溫至150 ℃,然后以5 ℃·min-1升溫至200 ℃,再以15 ℃·min-1升溫至280 ℃,進(jìn)樣口溫度為250 ℃.進(jìn)樣量為0.1 μL,載氣為氦氣.質(zhì)譜條件:EI離子源250 ℃,四級桿150 ℃;電子能量70 eV;電子倍增管電壓1 347 V,掃描質(zhì)量45~450 u.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 測序數(shù)據(jù)

    本次測序共獲得有效數(shù)據(jù)209 Gb.根據(jù)設(shè)定的過濾參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾,以香樟基因組作為參考基因組,利用BWA軟件比對序列,將所有的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組上.其中,基因組大小是720 Mb,雜合率為2.94%,重復(fù)率為62.77%,組裝完整度達(dá)到95.3%,參考基因組GC含量為40%.所有樣本的比對率較高,平均有效測序深度16 ×.從測序結(jié)果來看,數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,能滿足后續(xù)信息分析的要求.

    2.2 SNP位點檢測

    通過重測序檢測,18份無性系共獲得約209 308 831個高質(zhì)量SNP,其中,純合SNP共165 814 908個,雜合SNP共43 493 923個(表2).純合比率為62.49%~97.54%,平均值為79.67%;雜合比率為2.46%~37.51%,平均值為20.33%.

    表2 香樟及近緣種SNP統(tǒng)計結(jié)果Table 2 SNP information of C. camphora and its related species

    2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

    基于不同香樟無性系的SNP標(biāo)記用MEGA7軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1).近緣種肉桂首先被分離出來,之后是沉水樟.系統(tǒng)進(jìn)化樹將16份香樟無性系分為龍腦樟、芳樟類群和油樟類群.11份芳樟無性系(包括香樟187號、香樟195號、香樟120號、香樟114號、建陽5號、漳浦1號、漳浦5號、漳浦6號、漳浦2號、漳浦4號和武平系香樟)聚在一起,說明其親緣關(guān)系較近.牡丹1號、鐵10、香樟209號與油樟聚在一起,說明其與油樟親緣關(guān)系較近.龍腦樟被單獨分為一類,在系統(tǒng)進(jìn)化位置上靠近油樟類群.

    2.4 主成分分析

    主成分分析結(jié)果如圖2所示.香樟及近緣種被分為3個類群,其中類群1為11個芳樟無性系,對應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹中的芳樟類群,其距離比較近,說明他們遺傳關(guān)系較近.肉桂也位于類群1,說明其與芳樟類群遺傳關(guān)系較近.類群2為牡丹1號、鐵10、香樟209號、油樟和龍腦樟,對應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹中油樟類群和龍腦樟.類群3為沉水樟,與其他香樟無性系距離較遠(yuǎn),說明其遺傳關(guān)系較遠(yuǎn).油樟處在類群1與類群2之間,推測為種間雜交品系.主成分聚類結(jié)果與進(jìn)化樹分析基本一致,說明其結(jié)果準(zhǔn)確.

    圖1 基于SNP構(gòu)建的香樟及近緣種系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of C.camphora and its related species based on SNP markers

    2.5 精油化學(xué)利用類型

    采用GC-MS對芳樟、油樟、龍腦樟3種化學(xué)型進(jìn)行精油成分分析,結(jié)果顯示3種樟樹的精油成分有明顯差異(表3).芳樟精油中芳樟醇為主要成分,占比46.92%;油樟精油中桉葉油素為主要成分,占比30.31%;龍腦樟精油中樟腦為主要成分,占比46.28%.根據(jù)所測得的精油主要化合物及利用類型,分為3種化學(xué)型,分別為芳樟醇型、油樟型和樟腦型.SNP標(biāo)記分類結(jié)果與精油成分的分類結(jié)果一致,驗證了結(jié)果的準(zhǔn)確性.

    表3 3種化學(xué)型樟樹精油的主要成分Table 3 Main components in essential oil of 3 groups of Cinnamomum

    3 討論

    香樟為樟科植物,亞熱帶闊葉樹種,在我國種植廣泛.根據(jù)其精油成分的種類與含量將香樟分為不同類型.另外,表型標(biāo)記常被用來劃分植物類型,但易受環(huán)境影響,準(zhǔn)確性不高[25].與表型標(biāo)記相比,分子標(biāo)記不受環(huán)境或生理因素影響,是評估植物親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)的有效工具[26].本研究基于全基因組重測序技術(shù)開發(fā)的SNP標(biāo)記,解析不同香樟無性系的親緣關(guān)系,共獲得209 Gb原始數(shù)據(jù),平均有效測序深度16 ×.共獲得約209 308 831個高質(zhì)量SNP,純合SNP共165 814 908個,雜合SNP共43 493 923個.

    本試驗所用的1~14序號的香樟主要為福建選育的芳樟醇精油利用型,龍腦樟由江西引種,為樟腦利用型;油樟從四川宜賓引種,為桉葉油素利用型.從系統(tǒng)進(jìn)化樹可知11份芳樟無性系聚在一起,3份芳樟無性系與油樟聚在一起,沉水樟先被分離出來.值得注意的是,牡丹1號、鐵10、香樟209號為閩選香樟,選育為芳樟醇精油利用型,但從親緣關(guān)系來看,其與油樟親緣關(guān)系更近.而邢建宏等[27]的研究表明,在猴樟、云南樟和油樟中,油樟與樟樹親緣關(guān)系最遠(yuǎn),這可能與油樟在演化過程中逐漸出現(xiàn)較大分化有關(guān);也可能是在長期的繁衍過程中,雜交使得其組內(nèi)基因發(fā)生了改變[28].主成分分析同樣將16份香樟無性系分為3類,分別為芳樟類群、龍腦樟和油樟類群.而主成分分析顯示肉桂與芳樟類群有較近的親緣關(guān)系,但系統(tǒng)進(jìn)化樹中肉桂先分化出來,并未與芳樟類群聚在一起.芳樟在進(jìn)化過程中獨立成為分類學(xué)上的種[28],但其可能保留了部分肉桂血緣. 系統(tǒng)進(jìn)化樹與主成分分析和化學(xué)利用類型結(jié)果一致,反映了結(jié)果的準(zhǔn)確性,為樟樹優(yōu)良無性系的選育提供了基礎(chǔ).張國防等[29]對樟樹不同化學(xué)型的研究也表明不同化學(xué)型樟樹樣本間的遺傳關(guān)系與其葉精油的主成分有一定的相關(guān)性,并且,他們也將芳樟型樣本歸入腦樟[30],這與本研究中的部分閩選芳樟醇型與油樟聚在一起是一致的,原因在于不同化學(xué)型樟樹基因間的交流, 形成了復(fù)雜的遺傳關(guān)系.

    4 結(jié)論

    通過對16個香樟無性系和2個近緣種進(jìn)行重測序分析,共獲得209 Gb原始數(shù)據(jù),平均有效測序深度16×.共獲得約209 308 831個高質(zhì)量SNP,純合SNP共165 814 908個,雜合SNP共43 493 923個.從系統(tǒng)進(jìn)化樹可知:11份芳樟無性系聚在一起,3份芳樟無性系與油樟聚在一起,然后與龍腦樟聚在一起,沉水樟和肉桂先被分離出來.主成分分析結(jié)果表明16份香樟無性系分為3類,分別為芳樟類群、龍腦樟和油樟類群;芳樟、龍腦樟和油樟精油成分存在差異,為不同的化學(xué)利用類型.

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