黃土高原生物結(jié)皮形成過(guò)程中土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量變化特征

姚宏佳， 王寶榮， 安韶山,2， 楊娥女， 黃懿梅

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100）

生物土壤結(jié)皮（Biological Soil Crusts，BSCs）是細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)、地衣、苔蘚與土壤顆粒形成的有機(jī)復(fù)合體［1］，其覆蓋全球1.79×107km2的面積，占全球地表面積的12.2%［2］。BSCs可以增強(qiáng)土壤團(tuán)聚性和穩(wěn)定性，改善土壤通氣和孔隙度，促進(jìn)維管植物定植以及提高微生物群落的相對(duì)豐度，在荒漠生態(tài)系統(tǒng)中扮演了重要的生態(tài)作用［3］。BSCs 通過(guò)表層的微生物光合固碳過(guò)程改善土壤質(zhì)量，在全球土壤碳循環(huán)過(guò)程中起重要作用［4］。隨著B(niǎo)SCs的發(fā)育，土壤底物的復(fù)雜程度增加，增加了酶促底物供給，促進(jìn)了土壤酶活性。近年來(lái)，BSCs與土壤酶活性的密切關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。BSCs 的形成導(dǎo)致植物源大分子物質(zhì)增加，土壤微生物釋放出胞外酶來(lái)降解難分解的植物大分子，降解后的小分子被微生物再次利用，并參與土壤C、N、P循環(huán)［5］。

土壤胞外酶主要來(lái)源于土壤中動(dòng)植物、微生物活動(dòng)及其殘?bào)w的分解釋放，可以將高分子有機(jī)化合物降解為可同化的分子，在調(diào)控土壤有機(jī)質(zhì)（Soil Organic Matter，SOM）降解和養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［6］。而土壤酶化學(xué)計(jì)量是指生態(tài)系統(tǒng)中參與營(yíng)養(yǎng)元素C、N、P循環(huán)的土壤酶活性的比值，包括“C-獲取酶”（如半纖維素酶、纖維素酶和葡萄糖苷酶）、“N-獲取酶”（如脲酶、幾丁質(zhì)酶和肽酶）和“P-獲取酶”（如磷酸酶）［7］，其中最常見(jiàn)的參與C、N、P循環(huán)相關(guān)胞外酶包括β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-N-乙?；被咸烟擒彰?、亮氨酸氨基多肽酶和磷酸酶。土壤酶生態(tài)化學(xué)計(jì)量反映了微生物的生長(zhǎng)代謝和營(yíng)養(yǎng)需求與環(huán)境養(yǎng)分有效性之間的生物地球化學(xué)平衡［8-9］，其為理解土壤中養(yǎng)分限制、循環(huán)和平衡的過(guò)程提供了理論參考［10］。吳秀芝等［11］研究得出荒漠草地沙漠化過(guò)程中，土壤胞外酶的活性逐漸變?nèi)酰珺G：AP和NAG：AP基本表現(xiàn)為增加趨勢(shì)。目前對(duì)土壤胞外酶活性的研究主要集中在森林和草地［12-13］，而B(niǎo)SCs的形成對(duì)土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量的影響知之甚少。在BSCs發(fā)育過(guò)程中，土壤性狀與微生物群落存在耦合作用和協(xié)同變化，由于BSCs 處于地氣界面，微生物更容易受到擾動(dòng)，因此研究胞外酶活性更需要注意土壤微生物的內(nèi)穩(wěn)性的探索［14］。

近年來(lái)，BSCs成為黃土高原退耕后普遍存在的地表覆被物［15］，包括藻類(lèi)、地衣、蘚類(lèi)以及混生為主的各種不同類(lèi)型［16］。BSCs 廣泛分布于干旱半干旱地區(qū)的草原、森林/草原和森林，在草原的覆蓋度比例可達(dá)60%～70%［17］，在提高土壤穩(wěn)定性、增強(qiáng)土壤抗侵蝕能力、改善土壤養(yǎng)分等方面發(fā)揮著重要作用［3,18-19］。目前關(guān)于BSCs的類(lèi)型和演替對(duì)土壤養(yǎng)分的影響已有大量報(bào)道，但關(guān)于黃土高原BSCs發(fā)育如何通過(guò)調(diào)控土壤胞外酶活性和土壤理化性質(zhì)，從而對(duì)土壤酶化學(xué)計(jì)量特征產(chǎn)生影響仍需要深入研究。因此，本研究通過(guò)調(diào)查黃土高原BSCs不同發(fā)育序列的土壤胞外酶活性的變化，研究BSCs的形成過(guò)程對(duì)土壤胞外酶其化學(xué)計(jì)量特征的影響，探明BSCs在沙區(qū)資源生態(tài)關(guān)系中的效用，深入理解荒漠生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)六道溝小流域地處黃土高原北部，位于陜西省神木縣以西14 km 處（110°21′～110°23′E，38°46′～38°51′N(xiāo)）［16］（圖1）。該小流域面積約為6.89 km2，氣候?qū)僦袦貛О敫珊殿?lèi)型，冬季和春季干旱多風(fēng)，海拔為1094.0～1273.9 m，年均溫度為8.4 ℃。年降雨量為408.5 mm［15］，多年平均降雨量為437.4 mm，年際變化較大，暴雨集中在夏秋季6—9 月，此期間降雨量在全年降雨量占比70%～80%，年潛在蒸發(fā)量大于1000 mm［20］。該區(qū)域在實(shí)行多年退耕還林還草工程后，生物土壤結(jié)皮廣泛分布。六道溝小流域的生物土壤結(jié)皮主要包括藻結(jié)皮、混生結(jié)皮和蘚結(jié)皮，結(jié)皮蓋度大多介于60%～70%。這些生物土壤結(jié)皮主要分布于梁峁坡或梁峁頂上，占流域面積的60.7%［17］。

圖1 采樣點(diǎn)地理位置示意圖Fig.1 Location of sampling sites

1.2 土壤樣品采集

在神木縣六道溝小流域選取不同發(fā)育階段的生物土壤結(jié)皮，主要為裸沙地（CK），全藻結(jié)皮（以藍(lán)藻為優(yōu)勢(shì)群落，A），藻-蘚混生結(jié)皮（蘚結(jié)皮數(shù)量＜20%，AM），蘚-藻混生結(jié)皮（藻結(jié)皮數(shù)量＜20%，MA），全蘚結(jié)皮（以土生對(duì)齒蘚為優(yōu)勢(shì)種，M）5 個(gè)階段的土壤作為研究對(duì)象（表1）。在每個(gè)結(jié)皮發(fā)育階段選擇了5個(gè)具有代表性的樣地（坡向、坡位一致且坡度相差不大，每個(gè)樣地的大小為40 m×40 m，且任何2個(gè)樣地之間的距離超過(guò)100 m），在每個(gè)樣地中，采用“S”形隨機(jī)采樣策略，選擇12～15 個(gè)小的采樣點(diǎn)。將每個(gè)樣地的12～15個(gè)采樣點(diǎn)的土壤樣品混合消除誤差，獲得大約2 kg 的代表性樣品。樣品采集于2018年8月，共采集了95個(gè)代表性樣品（5個(gè)結(jié)皮發(fā)育階段×5 個(gè)野外重復(fù)×4 個(gè)土層），包括生物土壤結(jié)皮層（BSCs 層）和結(jié)皮層下的0～2 cm，2～10 cm 和10～20 cm 4 個(gè)層次的土壤樣品。BSCs 層指的是生物土壤結(jié)皮層，它由隱花植物和相關(guān)的土壤微生物的復(fù)合體組成，與表面土壤顆粒膠著。測(cè)量的全藻結(jié)皮、藻-蘚混生結(jié)皮、蘚-藻混生結(jié)皮、全蘚結(jié)皮的生物結(jié)皮層厚度，分別約為7.2±2.2 mm、9.6±1.9 mm、11.1±1.9 mm和10.9±1.8 mm。在仔細(xì)徹底地清除土壤中的苔蘚組織和殘留物后，將收集的樣品放入裝有冰袋的泡沫箱，并在24 h 內(nèi)移至4 ℃的冰箱中。土壤樣品被分成兩部分：一部分在一周內(nèi)立即分析胞外酶活性，另一部分風(fēng)干后過(guò)0.15 mm 篩用于土壤理化性質(zhì)分析。

表1 樣地基本信息Tab.1 General information of the investigated sites

1.3 土壤樣品測(cè)定

土壤有機(jī)碳（SOC）含量采用重鉻酸鉀-外加熱容量法測(cè)定；土壤全氮（TN）H2SO4-混合加速劑催化消煮，凱氏定氮儀KDY-9380測(cè)定；土壤全磷（TP）采用H2SO4-HClO4消化-鉬藍(lán)比色法測(cè)定［21］。

土壤胞外酶活性使用多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan Infinite M200 PRO 型）通過(guò)96 微孔板熒光法測(cè)定［12］。測(cè)定原理是利用熒光物質(zhì)（4-甲基傘形酮，MUB；7-氨基-4-甲基香豆素，7-amino-4-methylcoumarin）的共扼物質(zhì)作為測(cè)定底物（表2），接種土壤懸濁液至96孔微孔板中，測(cè)定具有代表性酶活性［7］，包括1 種參與碳循環(huán)的酶（β-1,4-葡萄糖苷酶，BG）、2 種參與氮循環(huán)的酶（亮氨酸氨基多肽酶，LAP；β-1,4-乙?；被咸烟擒彰?，NAG)和1種參與磷循環(huán)的酶（堿性磷酸酶，AP）。以每小時(shí)每克土壤樣品所得底物的摩爾數(shù)（nmol·g-1·h-1）表示土壤胞外酶活性的大小［11］。

表2 土壤胞外酶和對(duì)應(yīng)的底物Tab.2 Soil extracellular enzymes andcorresponding substrates

土壤酶活性計(jì)算公式如下：

式中：Ab為每小時(shí)每克土壤樣品的胞外酶活性（nmol·g-1·h-1）；F為校正后的樣品熒光值；V為土壤懸濁液的總體積；V1為微孔板每孔中加入的土壤懸濁液的體積；t為暗培養(yǎng)時(shí)間；m為干土樣的質(zhì)量；f為多功能酶標(biāo)儀讀取土壤樣品微孔的熒光值；fb為空白微孔的熒光值；q為淬火系數(shù)；fs為陰性對(duì)照微孔的熒光值；e為熒光釋放系數(shù)；fr為參考標(biāo)準(zhǔn)微孔的熒光值；Cs為參考標(biāo)準(zhǔn)微孔的濃度；V2為加入?yún)⒖紭?biāo)準(zhǔn)物的體積；fq為淬火標(biāo)準(zhǔn)微孔的熒光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010來(lái)整理和計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)，土壤化學(xué)計(jì)量和土壤酶化學(xué)計(jì)量采用質(zhì)量比的方式分層次計(jì)算。在分析土壤C、N、P 含量及其獲取酶之間的線性關(guān)系之前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)n轉(zhuǎn)化，使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Origin 2018和R 3.5.1進(jìn)行作圖。對(duì)土壤C、N、P 含量及其化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（α=0.05），通過(guò)一般線性模型（GLM）研究生物土壤結(jié)皮形成、土層深度及其交互作用的影響。利用R 3.5.1 軟件分析土壤C、N、P 含量及其化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量之間的關(guān)系，并實(shí)現(xiàn)土壤C、N、P含量及其化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶活性對(duì)土壤酶化學(xué)計(jì)量的冗余（RDA）分析。利用SMATR 2.0軟件中的標(biāo)準(zhǔn)化主軸（SMA）估計(jì)，探明了參與C、N、P循環(huán)的胞外酶活性之間的比例關(guān)系變化。C-獲取酶、N-獲取酶、P-獲取酶活性三者之間的化學(xué)計(jì)量關(guān)系采用對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)尺度進(jìn)行分析，模型為logy=a+b（logx）。其中x和y為參與C、N、P 循環(huán)的胞外酶活性，b為斜率，a為截距。當(dāng)該模型的斜率(b)與1無(wú)顯著差異時(shí)（P＜0.01），將其關(guān)系描述為等容關(guān)系［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段土壤C、N、P含量變化特征

在BSCs 的不同發(fā)育階段中，土壤有機(jī)碳（SOC）、全氮（TN）、全磷（TP）的含量均隨著土層的加深而逐漸遞減（表3，P＜0.05）。不同發(fā)育階段之間的SOC、TN、TP含量存在差異（P＜0.05），SOC含量依次為：蘚-藻混生結(jié)皮（MA）＞全蘚結(jié)皮（M）＞藻-蘚混生結(jié)皮（AM）＞全藻結(jié)皮（A）。A、AM、MA、M 這4個(gè)發(fā)育序列中0～20 cm 土層的SOC、TN、TP 含量均與裸沙地之間差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同發(fā)育階段土壤C、N、P含量變化特征（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Tab.3 Variation characteristics of C,N and P contents at different formation stages(mean±SD)

2.2 不同發(fā)育階段土壤胞外酶活性變化特征及其與土壤C、N、P之間的關(guān)系

A、AM、MA、M這4個(gè)發(fā)育階段的β-1，4-葡萄糖苷酶（BG）、β-1，4-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基多肽酶（LAP）和堿性磷酸酶（AP）活性均在生物土壤結(jié)皮層表現(xiàn)為最高（表4，P＜0.05）。生物土壤結(jié)皮層的BG、NAG和AP活性在不同發(fā)育階段之間存在顯著差異（P＜0.05），NAG 活性依次為：MA ＞M ＞AM ＞A。A、AM、MA、M這4個(gè)發(fā)育階段的LAP 活性對(duì)比CK 均顯著增加（P＜0.05），AP活性在蘚-藻混生結(jié)皮階段和全蘚結(jié)皮階段與裸沙地有顯著差異（P＜0.05），在藻-蘚混生結(jié)皮階段和全藻結(jié)皮階段差異不顯著，BG 和NAG 活性在2～20 cm土層隨著B(niǎo)SCs發(fā)育變化不顯著。

表4 不同發(fā)育階段土壤胞外酶活性變化特征（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Tab.4 Variation characteristics of soil extracellular enzyme activities at different formation stages(mean±SD)

線性回歸分析表明，參與碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)胞外酶活性分別與土壤C、N、P 含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.001）（圖2）。土壤胞外酶活性與土壤C、N、P 含量的標(biāo)準(zhǔn)化主軸分析結(jié)果表明，在藻-蘚混生結(jié)皮階段AP與（NAG+LAP）活性之間的斜率大于1，且呈現(xiàn)顯著水平（P＜0.001），在其他生物土壤結(jié)皮發(fā)育階段的斜率均與1 無(wú)顯著差異，具有良好的約束關(guān)系（表5）。同時(shí)，土壤有機(jī)碳、全磷含量與BG、AP活性之間的斜率均顯著大于1（P＜0.001）。

表5 土壤胞外酶活性與土壤C、N、P含量的標(biāo)準(zhǔn)化主軸分析Tab.5 Standardized major axis analysis between extracellular enzyme activities of soils involved in the C,N,and P cycles and soil C,N,and P contents

圖2 土壤C、N、P含量與參與C、N、P循環(huán)相關(guān)胞外酶活性的線性回歸分析Fig.2 Linear regression analysis between C,N and P contents and C-,N-and P-acquisition enzyme activities

2.3 不同發(fā)育階段土壤化學(xué)計(jì)量與酶化學(xué)計(jì)量變化特征

生物土壤結(jié)皮層C：P、N：P 隨發(fā)育序列變化逐漸增加，均表現(xiàn)為：A＜AM＜MA＜M（圖3）。4 個(gè)不同發(fā)育序列之間土壤C：N 變化不顯著，與CK 均具有顯著差異（P＜0.05）。相較裸沙地0～2 cm土層，生物土壤結(jié)皮各發(fā)育階段0～2 cm土壤C：N顯著降低，分別降低了37.9%、43.5%、48.0%和44.3%。

圖3 土壤化學(xué)計(jì)量與酶化學(xué)計(jì)量在不同發(fā)育階段的變化特征（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.3 Variation characteristics of soil stoichiometry and enzyme stoichiometry at different formation stages(mean±SD)

4個(gè)不同發(fā)育序列的土壤酶C：N相比裸沙地均具有顯著差異（P＜0.05）（表6），其中在0～2 cm土層，分別降低了55.2%、56.7%、67.9%和76.9%。土壤酶C：P和酶N：P在全藻結(jié)皮階段出現(xiàn)最大值，在蘚-藻混生結(jié)皮階段出現(xiàn)最小值。

2.4 土壤C、N、P 含量及其化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量之間的關(guān)系

土壤C、N、P 含量及其化學(xué)計(jì)量比和土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量比的相關(guān)性分析表明，土壤C、N、P 之間均表現(xiàn)出極顯著的正相關(guān)（P＜0.01，表7）。土壤C、N、P 含量與土壤C：P、N：P 及各胞外酶活性之間也存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），且C、N、P 含量與土壤C：N 之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.074、-0.053、-0.167（P＜0.05）。土壤BG：（NAG+LAP）與土壤C：N 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），土壤BG：AP與BG呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)，但與AP表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

表7 土壤C、N、P及其化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量之間的相關(guān)性Tab.7 Correlation between C,N,P and their stoichiometry and soil extracellular enzyme activity and their stoichiometry

以土壤酶化學(xué)計(jì)量為響應(yīng)變量，以土壤C、N、P含量及其化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶活性為解釋變量作冗余（RDA）分析，通過(guò)RDA 進(jìn)一步說(shuō)明BSCs 的發(fā)育和土層深度對(duì)土壤酶化學(xué)計(jì)量的影響（圖4）。在生物土壤結(jié)皮層，RDA結(jié)果顯示土壤BG：AP與土壤C、N、P、BG 和NAG 有很顯著的正相關(guān)性（P＜0.01），第一軸和第二軸的特征值分別為88.17%和11.17%。BG：（NAG+LAP）與（NAG+LAP）和LAP 呈顯著負(fù)相關(guān)，這與相關(guān)性分析結(jié)果一致。

圖4 土壤酶化學(xué)計(jì)量與土壤C、N、P和土壤胞外酶活性的關(guān)系Fig.4 Relationship between soil enzyme stoichiometry and soil C,N,P and soil extracellular enzyme activities

3 討論

3.1 生物土壤結(jié)皮形成對(duì)土壤C、N、P 含量以及胞外酶活性的影響

生物土壤結(jié)皮層的形成過(guò)程反映了干旱半干旱生態(tài)系統(tǒng)土壤性質(zhì)的轉(zhuǎn)變和區(qū)域生態(tài)環(huán)境的健康狀況。在干旱和半干旱地區(qū)，BSCs覆蓋在沙地表面，促進(jìn)了細(xì)顆粒的積累，對(duì)沙地土壤養(yǎng)分的改良起著至關(guān)重要的作用［23］。本研究結(jié)果表明，BSCs的形成對(duì)土壤C、N、P 含量均具有極顯著影響（表6），這與李云飛等［24］研究結(jié)果相似。這可能和不同發(fā)育階段BSCs的類(lèi)型不同有關(guān)，隨著B(niǎo)SCs的發(fā)育，蘚結(jié)皮逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位（表1）。蘚結(jié)皮的表面孔隙較為粗糙，這種結(jié)構(gòu)特性可以更好地捕獲有機(jī)質(zhì)，使得結(jié)皮層下的養(yǎng)分不斷聚集,蘚結(jié)皮的生物量、微生物組成和固碳能力顯著高于藻結(jié)皮［25］。曾全超等［26］研究得出在黃土高原延河流域不同植被帶的C、N、P含量均為表層高于下層，并且隨土層加深而降低，這與本研究結(jié)果趨勢(shì)一致。本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)發(fā)育序列BSCs的生物土壤結(jié)皮層SOC、TN、TP含量均顯著高于下層土壤，且不同發(fā)育序列間差異顯著（表3），其中SOC 與TN 的變化具有一致性，均隨著土層的加深而減小，且在結(jié)皮層下各土層中分布較為均勻。原因可能是：（1）BSCs 對(duì)下層土壤的影響在土層深度上有局限性；（2）研究區(qū)內(nèi)降水量較少對(duì)淋溶作用有影響；（3）礦質(zhì)風(fēng)化速率降低，土壤存儲(chǔ)能力較弱［27］。TP 含量隨土層加深而減小的趨勢(shì)較緩，可能主要與土壤母質(zhì)有關(guān)，土壤母質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，土壤全磷含量對(duì)土層深度變化的響應(yīng)較弱［25］。

土壤胞外酶是微生物釋放出降解復(fù)雜大分子的蛋白質(zhì)，在生態(tài)系統(tǒng)中參與養(yǎng)分循環(huán)并具有重要作用，作為沙區(qū)土壤恢復(fù)的重要生物指標(biāo)，其活性強(qiáng)弱可以指征土壤中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化能力的大小［13］。Zhao等［28］研究表明，不同的結(jié)皮形成階段會(huì)影響固氮酶的活性，這與本研究生物土壤結(jié)皮的發(fā)育對(duì)土壤胞外酶活性具有極顯著影響相似（表6），隨著生物土壤結(jié)皮的發(fā)育，土壤胞外酶的活性顯著增加。主要是由于生物土壤結(jié)皮層相對(duì)豐富的養(yǎng)分含量為酶促反應(yīng)提供較多的底物，從而提高了酶活性，發(fā)育等級(jí)越高的生物土壤結(jié)皮，其結(jié)皮層的酶活性越高。有研究表明，在生態(tài)系統(tǒng)中由酶催化的土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和降解過(guò)程更多的可能性是由微生物功能基因的豐度驅(qū)動(dòng)的［29］。Miralles 等［30］得出生物結(jié)皮土壤胞外酶的活性要高于沒(méi)有結(jié)皮發(fā)育的裸露土壤，這可能是由于生物土壤結(jié)皮層通過(guò)利用其深色色素吸收太陽(yáng)輻射來(lái)緩和土壤氣候的波動(dòng)，從而提高了土壤酶的活性［31］。發(fā)育后期蘚結(jié)皮的土壤胞外酶活性高于發(fā)育前期的藻結(jié)皮，這表明隨著結(jié)皮形成的進(jìn)行，土壤結(jié)皮層下的微生物活性不斷累積。與藻結(jié)皮相比，蘚結(jié)皮可能更具有提高C和N循環(huán)的能力，可以更好地改善碳和氮的輸入和交換［32］。本研究得出土壤胞外酶活性隨土層加深而降低（表4），這和Maxwell等［33］參與P循環(huán)相關(guān)酶活性隨深度的增加而降低的規(guī)律一致。生物土壤結(jié)皮層的土壤胞外酶活性最高，在結(jié)皮下層土壤中，不同發(fā)育序列的4種胞外酶活性均大于裸沙地。這主要緣于生物土壤結(jié)皮產(chǎn)生的分泌物和殘?bào)w等被微生物不斷分解形成腐殖質(zhì)，促進(jìn)了養(yǎng)分在結(jié)皮層的積累，從而使結(jié)皮層養(yǎng)分含量顯著高于下層土壤。相應(yīng)地，其為土壤微生物提供底物，使微生物適宜生境的能力增強(qiáng)，這會(huì)促進(jìn)結(jié)皮層酶活性的提高［19］。

表6 階段、土層及其交互作用對(duì)土壤生態(tài)化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶及其化學(xué)計(jì)量特征的影響Tab.6 Effects of stage,soil layer and their interaction on soil ecological stoichiometry and soil extracellular enzymes and their stoichiometric characteristics

3.2 生物土壤結(jié)皮形成對(duì)土壤化學(xué)計(jì)量和土壤胞外酶化學(xué)計(jì)量的影響

土壤生態(tài)化學(xué)計(jì)量能夠有效地說(shuō)明養(yǎng)分限制類(lèi)型和土壤質(zhì)量狀況，是反映C、N、P循環(huán)以及土壤養(yǎng)分平衡的重要參數(shù)［27］。本研究結(jié)果表明生物土壤結(jié)皮的發(fā)育對(duì)土壤生態(tài)化學(xué)計(jì)量有極顯著影響（表6），這與Liu等［34］化學(xué)計(jì)量比隨植被演替階段變化的研究結(jié)果類(lèi)似。在生物土壤結(jié)皮的發(fā)育過(guò)程中，植被對(duì)土壤養(yǎng)分的歸還處于動(dòng)態(tài)變化，且土壤理化性質(zhì)和微生物活性均會(huì)在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生顯著改變。土壤C：N 是體現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)分解速率的指標(biāo)，比值越高表明土壤有機(jī)質(zhì)的分解礦化速率越慢。在本研究中，4 個(gè)發(fā)育序列生物土壤結(jié)皮層的C：N 平均值分別為14.0、16.3、14.5、15.2（圖3a），均明顯高于全國(guó)平均值（11.9），表明研究區(qū)土壤相對(duì)于全國(guó)土壤平均水平土壤碳源、有機(jī)質(zhì)分解和礦化速率均較低。隨著生物土壤結(jié)皮的發(fā)育，土壤有機(jī)質(zhì)的分解速率逐步減弱，增加了土壤有機(jī)質(zhì)的積累［35］。除結(jié)皮層外，0～2 cm、2～10 cm 和10～20 cm 土層的C：N 無(wú)顯著差異，這說(shuō)明土壤中C 和N 的含量在外部環(huán)境的影響下趨于一致，在養(yǎng)分積累和消耗的過(guò)程中C 和N 作為主要成分，其比值相對(duì)穩(wěn)定［36］。土壤N：P一般可用于預(yù)測(cè)養(yǎng)分限制的類(lèi)型，本研究生物土壤結(jié)皮層N：P明顯高于結(jié)皮下層，這說(shuō)明研究區(qū)結(jié)皮下層土壤氮元素供應(yīng)相對(duì)較弱，并有可能成為植被生長(zhǎng)的限制元素［11］。土壤C：P可以用于表征土壤P的有效性，通常C：P越低，越利于微生物對(duì)有機(jī)質(zhì)的分解，進(jìn)而提高土壤P的含量，反映土壤P的有效性［37］。本研究區(qū)結(jié)皮層的土壤C：P高于結(jié)皮下層土壤，這說(shuō)明結(jié)皮層土壤中有機(jī)質(zhì)的分解速率弱于下層土壤。

土壤酶化學(xué)計(jì)量作為表征土壤中養(yǎng)分供應(yīng)狀況和土壤微生物活動(dòng)的重要指標(biāo)，揭示了土壤中微生物營(yíng)養(yǎng)需求與環(huán)境養(yǎng)分有效性之間的平衡關(guān)系［38］。當(dāng)C、N 或P 中某一元素在土壤中變得有限時(shí)，微生物可能就會(huì)釋放該元素的獲取酶，以應(yīng)對(duì)土壤基質(zhì)和養(yǎng)分供應(yīng)的變化［39］。本研究中，BG：（NAG+LAP）和BG：AP 隨著生物土壤結(jié)皮的發(fā)育下降，這與Wang 等［40］的研究中酶C：N 和C：P 在前22 a 植被演替中下降有相似的規(guī)律，這表明研究區(qū)微生物對(duì)N和P 相對(duì)于C 的需求更大，藻結(jié)皮階段土壤微生物N、P 功能的發(fā)揮相對(duì)較差。除生物土壤結(jié)皮層外，BG：（NAG+LAP）和BG：AP 的降低與土層深度的增加有關(guān)，這說(shuō)明隨著土層的加深，微生物對(duì)參與C、N、P循環(huán)相關(guān)胞外酶的釋放減少，且減少釋放C-獲取酶的幅度最大［39］。盡管土壤胞外酶化學(xué)計(jì)量比受到生物結(jié)皮形成的顯著影響，但微生物調(diào)控釋放參與C、N循環(huán)相關(guān)胞外酶等比例增加（即兩者表現(xiàn)為等容關(guān)系），呈穩(wěn)態(tài)模式（表5）。在生物土壤結(jié)皮形成過(guò)程中，微生物內(nèi)穩(wěn)性在調(diào)控養(yǎng)分資源的獲取中扮演重要作用，在環(huán)境相對(duì)受限的區(qū)域，酶化學(xué)計(jì)量比在外界的條件變化下保持穩(wěn)態(tài)，可以更好地應(yīng)對(duì)養(yǎng)分缺乏，保持土壤養(yǎng)分動(dòng)態(tài)平衡［41］。本研究得出在全藻結(jié)皮、藻-蘚混生結(jié)皮以及全蘚結(jié)皮階段土壤P-獲取酶與N-獲取酶之間的斜率均大于1，且在藻-蘚混生結(jié)皮階段呈顯著水平，說(shuō)明微生物對(duì)P-獲取酶的釋放速率相對(duì)N-獲取酶較快。同時(shí)，土壤有機(jī)碳、全磷含量與參與C、P循環(huán)的胞外酶活性之間的斜率均顯著大于1，呈現(xiàn)非等容模型，反映了土壤胞外酶活性對(duì)土壤養(yǎng)分的依賴(lài)。

3.3 土壤C、N、P-胞外酶活性-酶化學(xué)計(jì)量特征的相關(guān)性分析

在植被與土壤協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，調(diào)控C、N、P循環(huán)的土壤胞外酶活性會(huì)受到相應(yīng)的土壤養(yǎng)分狀況影響，由于不同發(fā)育階段生物土壤結(jié)皮固定C、N的能力不同，對(duì)應(yīng)胞外酶活性就不同，進(jìn)而使化學(xué)計(jì)量學(xué)特征發(fā)生分異［42］。土壤養(yǎng)分含量通過(guò)微生物間接調(diào)控土壤胞外酶的分泌，使得土壤養(yǎng)分與酶活性之間具有一定的相關(guān)關(guān)系。本研究中，土壤C、N、P 含量與其獲取酶化學(xué)計(jì)量的相關(guān)性分析顯示，SOC、TN、TP 與C-、N-、P-獲取酶［BG、（NAG+LAP）、AP］呈顯著正相關(guān)，表明土壤微生物活動(dòng)受到SOC、TN、TP 含量的調(diào)控，其含量越高，土壤C-、N-、P-獲取酶活性越高，這反映了SOC、TN、TP 是土壤酶生產(chǎn)和分泌的能量來(lái)源。本研究發(fā)現(xiàn)土壤N：P、C：P分別與土壤（NAG+LAP）：AP、BG：AP無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，表明土壤胞外酶活性對(duì)生物土壤結(jié)皮發(fā)育過(guò)程中土壤養(yǎng)分變化的響應(yīng)機(jī)理不同［43］。綜上所述,面對(duì)土壤C：N：P生態(tài)化學(xué)計(jì)量的分異,土壤胞外酶會(huì)調(diào)整自身C：N：P 生態(tài)化學(xué)計(jì)量進(jìn)行適應(yīng)。本研究表明生物土壤結(jié)皮和土層深度均與土壤胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量顯著相關(guān)（表6），生物土壤結(jié)皮的發(fā)育和土層深度對(duì)土壤胞外酶活性的影響呈交互作用。說(shuō)明胞外酶活性及其化學(xué)計(jì)量是由養(yǎng)分有效性介導(dǎo)的，生物土壤結(jié)皮不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)供給影響微生物的繁殖和生長(zhǎng)，進(jìn)而決定酶的分泌［44］。

4 結(jié)論

（1）隨著生物土壤結(jié)皮的發(fā)育，參與C、N、P 循環(huán)的土壤胞外酶活性均有明顯增強(qiáng)，全蘚結(jié)皮階段的土壤胞外酶活性顯著高于全藻結(jié)皮。反映出生物土壤結(jié)皮的形成豐富了土壤微生物的種類(lèi)和數(shù)量，從而提高了土壤胞外酶的活性。而在相同生物土壤結(jié)皮發(fā)育階段，土壤胞外酶活性隨土層加深而減弱。

（2）標(biāo)準(zhǔn)化主軸估計(jì)分析得出土壤有機(jī)碳、全磷含量與C-獲取酶、P-獲取酶活性之間的斜率均顯著大于1，呈現(xiàn)非等容模型，表明土壤胞外酶及其化學(xué)計(jì)量對(duì)土壤養(yǎng)分的依賴(lài)，反映了土壤胞外酶及其化學(xué)計(jì)量與土壤養(yǎng)分循環(huán)的密切關(guān)系。

（3）各生物土壤結(jié)皮發(fā)育階段土壤N-獲取酶、P-獲取酶相對(duì)于C-獲取酶的斜率呈現(xiàn)等容關(guān)系，表明胞外酶化學(xué)計(jì)量比在外界的條件變化下保持穩(wěn)態(tài)，微生物內(nèi)穩(wěn)性在調(diào)控養(yǎng)分資源的獲取中扮演重要作用。