桃葉蓼白粉菌的顯微觀察及進(jìn)化關(guān)系分析

孫 博，劉 閏，王占斌，陳黃欣，閻 肅

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

0 引言

桃葉蓼(Polygonum persicariaL.)是一年生的草本植物，在植物分類學(xué)上屬于蓼科(Polygonaceae)蓼屬(PolygonumL.)，桃葉蓼廣泛分布于中國(guó)各地，如東北（黑龍江、吉林、遼寧）、華北、華南等地，多在夏季6—9月開花，開花后一個(gè)月結(jié)果。桃葉蓼是一種藥用草本植物，全草可入藥，具有祛除濕氣，助消化，除腸道寄生蟲的功效，還可用于治療感冒，腹瀉等。桃葉蓼白粉病是桃葉蓼一種常見(jiàn)的病害，在生長(zhǎng)期幾乎每年都普遍發(fā)生。桃葉蓼白粉病具有發(fā)病時(shí)間短，流行速度快的特點(diǎn)，在陰雨和高濕的條件下適宜發(fā)生[1]。葉片葉柄均可發(fā)病，中下部葉片先發(fā)病，逐漸向上部葉片蔓延[2]，起初葉片會(huì)產(chǎn)生細(xì)小、淡白色的病斑，后逐漸擴(kuò)大成灰白色粉末狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)覆蓋整個(gè)葉片[3]，對(duì)桃葉蓼的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響。因此期望能通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌種的分類鑒定為桃葉蓼白粉病的防治提供依據(jù)。

桃葉蓼白粉病原菌在菌物分類學(xué)上分屬于叉絲殼屬，而叉絲殼屬是白粉菌中其中一個(gè)重要的屬。1851年，法國(guó)人J.H.Leveille建立此屬，迄今為止全世界共報(bào)道約70余種。中國(guó)叉絲殼屬的種比較多，根據(jù)鄭儒永等人主編的《中國(guó)真菌志》第一卷記載有41個(gè)種和變種，寄生在19科34屬植物上[4-5]。目前關(guān)于桃葉蓼白粉病的相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外都比較少見(jiàn)，在國(guó)外可見(jiàn)少量的關(guān)于近似物種萹蓄(Polygonum aviculare)的研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅有王偉等[6]曾對(duì)萹蓄白粉病進(jìn)行過(guò)專項(xiàng)研究報(bào)道，但其病原菌的報(bào)道最早可以追溯到1913年[7]。

一般情況下，白粉病病原鑒定工作主要是根據(jù)病原菌無(wú)性階段形態(tài)特征、分生孢子萌發(fā)方式和有性階段閉囊殼的顯微觀察差異判斷[8]，但因?yàn)槠錈o(wú)性階段形態(tài)差異較小，有性階段的閉囊殼也不是一直能夠觀察到，所以分類鑒定工作一直相對(duì)困難。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，rDNA轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)(internal transcribedspacer，ITS)和28S rDNA D1/D2區(qū)已被廣泛應(yīng)用于菌物分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系等研究[9]。為了明確桃葉蓼白粉病病原種類及其分類地位，本文將通過(guò)對(duì)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)病原進(jìn)行鑒定和分類[10]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白粉菌樣本(TL190501)于2018年05月13日采自黑龍江省哈爾濱市外灘濕地生態(tài)公園，寄主植物為桃葉蓼(Polygonum persicariaL.)。提取白粉菌基因組DNA的試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白粉菌形態(tài)學(xué)觀察 用刀片輕輕刮或解剖針挑取桃葉蓼葉片表面的白色菌絲及分生孢子、閉囊殼制成臨時(shí)玻片，光學(xué)顯微鏡觀察分生孢子、子囊孢子大小、形狀，閉囊殼大小、形狀，附屬絲的相關(guān)特征。如病原菌不能很好地展開則輕輕敲擊蓋玻片，使得閉囊殼開裂釋放其內(nèi)部的子囊以及子囊孢子，統(tǒng)計(jì)其內(nèi)部的子囊以及子囊孢子數(shù)量、形態(tài)、大小并記錄觀察相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.2 基因組DNA的提取 本實(shí)驗(yàn)對(duì)桃葉蓼白粉菌基因組DNA提取采用試劑盒法。（1）首先取一定量的桃葉蓼白粉菌菌絲體（注意不要有其他雜菌的菌絲及子實(shí)體），加入液氮后進(jìn)行充分研磨，將研磨得到的真菌粉末裝入1.5 mL離心管中；（2）加入400 μL緩沖液FP1至離心管中，6 μL的RnaseA(10 mg/mL)，置入旋渦震動(dòng)機(jī)中震蕩1 min，室溫放置時(shí)間為10 min；（3）離心管中加入130 μL緩沖液FP2，置入旋渦震蕩機(jī)旋渦振蕩1 min，再置入離心機(jī)12000 r/min條件下離心5 min，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)移，這一步驟重復(fù)2次；（4）然后加入0.7倍體積的異丙醇（約350 μL）至盛有上清液的離心管中，上下?lián)u動(dòng)充分混勻，約30 s后會(huì)出現(xiàn)絮狀的基因組DNA懸浮物，將離心管置入離心機(jī)中12000 r/min離心2 min，棄掉上清液，保留沉淀；（5）加入70%乙醇700 μL，置入旋渦震蕩機(jī)中振蕩5 s混勻，隨后置入離心機(jī)12000 r/min離心2 min，棄掉上清，將這一步驟重復(fù)；（6）開蓋倒置盛有沉淀物的離心管，在室溫下晾干10 min，使乙醇徹底揮發(fā)；（7）在晾干后的盛有沉淀物的離心管中加入適量的洗脫緩沖溶液TE，置于水浴鍋中65℃水浴45 min使DNA溶解，期間每隔5 min需要顛倒離心管混勻數(shù)次助溶，最終獲得DNA溶液。將該DNA溶液利用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ITS序列PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)采用的引物序列為：通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')及ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，通過(guò)擴(kuò)增桃葉蓼白粉菌rDNA獲得的目的DNA片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用PCRMix試劑。反應(yīng)體系50 μL如下：2 μL模板DNA；PCRMix24μL；ddH2O20μL；P1和P2分別為2μL。PCR擴(kuò)增的條件如下：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸2 min；共30次的循環(huán)；72℃最終需要延伸10 min。PCR結(jié)束對(duì)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴化乙錠(EB)染色觀察后，對(duì)檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行下一步序列測(cè)定和分析[3]。

1.2.4 序列分析 將獲得DNA序列輸入GenBank并進(jìn)行BLAST比對(duì)檢索，采用Clustalx l.83將測(cè)序得到的白粉菌結(jié)果與從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中抽取得到的22種白粉菌的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并推理系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃葉蓼白粉菌形態(tài)檢測(cè)

桃葉蓼白粉菌的菌絲體生于桃葉蓼葉正反兩面，多數(shù)生于葉片正面，少數(shù)生于葉片背面，存留至近存留，菌體在桃葉蓼葉面形成厚或薄的白色病斑，隨著病發(fā)嚴(yán)重最后鋪滿全葉，通常在病害后期子囊果成熟以后菌絲體會(huì)消失；分生孢子呈柱形，(26.5-)30.4 ～42.9(-55.3)×(12.9-)14.2 ～16.9(-19.1)μm；萌發(fā)形成附著胞的頂端膨大（圖1-3）。子囊果呈暗褐色，多數(shù)聚生或者近聚生，極少數(shù)散生，多呈扁球形，少數(shù)球形，直徑(87-)94 ～121(-141)μm，有不規(guī)則的多角形壁細(xì)胞，殼壁細(xì)胞直徑6.5 ～16.8(-21.3)μm；附屬絲(8-)12 ～37(-47)根，多見(jiàn)16根，不分枝或不規(guī)則分枝，少數(shù)頂端近雙叉狀分枝1 ～2次，直或彎曲，常作扭曲狀或曲折狀，長(zhǎng)度約為子囊果直徑的(0.3-)0.5 ～1(-1.6)倍，長(zhǎng)(31-)76 ～159(-211)μm，多見(jiàn)局部粗細(xì)不勻或上下近等粗，寬(3.8-)5.1 ～8.9(-10.6)μm，附屬絲薄壁，多平滑，有少數(shù)較粗糙，附屬絲內(nèi)有隔膜0 ～3個(gè)，根部為褐色，向上漸淡至近無(wú)色；子囊4 ～8個(gè)，多數(shù)呈各種不規(guī)則卵形，少數(shù)近球形，部分有明顯的柄，少數(shù)無(wú)柄，(45.8-)51.3 ～72.1(-91.1)×(31.5-)32.0 ～45.8(-51.1)μm；子囊孢子2 ～4個(gè)，多見(jiàn)橢圓形，少數(shù)為矩圓形，略帶淡黃色，(16.5-)19.3 ～31.2(-34.2)×(10.2-)11.7 ～16.2(-17.6)μm。

圖1 桃葉蓼葉面上白粉菌分生孢子(20×60)

圖2 載玻片水滴中顯微觀察桃葉蓼白粉菌分生孢子(20×60)

圖3 桃葉蓼葉片白粉菌分生孢子萌發(fā)形成附著胞(20×60)

2.2 桃葉蓼白粉菌進(jìn)化關(guān)系分析

2.2.1 提取桃葉蓼白粉菌基因組DNA及PCR的擴(kuò)增結(jié)果 實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增桃葉蓼白粉菌rDNA獲得目的DNA片段，用膠回收試劑盒回收并純化，電泳檢測(cè)所得結(jié)果，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果獲得堿基序列長(zhǎng)度為642 bp，結(jié)果如下：TTCCCGTAATGCCGAGGC TTCATTCGTGGCGTCTGCGGCGTGCTGGGCCGAC CCTCCCACCCGTGTCGATTTGTATCTTGTTGCTT TGGCGGGCCGGGCTACGTCGTCGCTGTCCGCAG GGACACGCGTCGGCCGCCCACCGGTTTCGACTG GAGCGCGCCCGCCAAAGACCCAACCAAAACTCA TGTTGTCTGTGTCGTCTTAGCTTTATAATGAAAAT TGATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCT GGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGA ATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC GAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAACACCCC CTCCAGCTGCCGTTGTGTGGCTGCGGTGTTGGGG CTCGTCGCGAAGCGGCGGCCCTTAAAGACAGTG GCGGTCCCGACGTGGGCTCTACGCGTAGTAACTT GCTTCTCGCGACAGAGTGACGCCTGGTGGCTTG CCAGAACAACCCCTATTGGGTCCAGTCACATGGA TCACAGGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCC GCTGAACTTAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAAA A。

2.2.2 桃葉蓼白粉菌ITS序列進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果與分析從Genebank中選取25種植物白粉菌ITS序列（表1），使用MAGA 5.05軟件根據(jù)鄰近距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹推演進(jìn)化關(guān)系與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較。

表1 用于同源性比較分析的白粉菌

將本實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果與部分選取植物白粉菌ITS序列進(jìn)行比較分析（表1）。對(duì)表1白粉菌的ITS序列對(duì)比分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 26種白粉菌序列的比對(duì)分析

用MEGA5.05軟件分析處理26種白粉菌，完成構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)基因進(jìn)化樹和堿基序列比對(duì)圖表可見(jiàn)，進(jìn)化樹有2個(gè)較大的分支，相同種屬植物的白粉菌聚為統(tǒng)一進(jìn)化枝，如桃葉蓼白粉菌(TL190501)的ITS序列與阿塞拜疆萹蓄上的Erysiphe polygoni(LC328323.1)、美國(guó)新變種直立萹蓄上的Erysiphe buhrii(KX826856.1)等6種植物上的白粉菌有比較高的相似度，堿基序列相似度可達(dá)99%，親緣關(guān)系極近；與韓國(guó)蒔蘿上的Erysiphe heraclei(JX499184.1)、韓國(guó)歐芹上的Erysiphe heracleid(KF680162.1)及韓國(guó)山蘿卜上的Erysiphe heraclei(KF111807.1)等6種植物白粉菌在親緣關(guān)系上比較接近，堿基序列相似度約97%；與巴西大豆上的Erysiphe diffusa(AY739112.2)及中國(guó)紫藤上的Erysiphe diffusa(KM260363.1)親緣關(guān)系比較接近，堿基序列相似度約為95.59%；與美國(guó)豌豆上的Erysiphe pisi(FJ378868.1及FJ378871.1)相似度比較低，堿基序列相似度約為94.95%；與法國(guó)橡樹上的Erysiphe alphitoides(EF672350.1)及中國(guó)大葉楊上的Erysiphesp.(HQ012432.1)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，堿基相似度為94%；與美國(guó)鱷梨上的Erysiphesp.(MF577080.1)之間相似度較低，它們堿基序列相似度為94.27%；與日本大葉柳上的Erysiphe adunca(LC028970.1)相似度最低，堿基序列相似度僅為92.25%。

根據(jù)堿基序列比對(duì)圖可看出，桃葉蓼白粉菌(TL190501)與阿塞拜疆萹蓄上的Erysiphe polygoni(LC328322.1及LC328323.1)僅僅在第13位上有所不同，桃葉蓼白粉菌第13位堿基為G，而阿塞拜疆萹蓄(LC328323.1)白粉菌為T，因此可以初步判定兩種白粉菌為同種同屬白粉菌；與韓國(guó)蒔蘿上及韓國(guó)山蘿卜的Erysiphe heraclei（JN603995.1及KF111807.1）在第13、79、97、98、105、164、204、428、460、542位堿基不同，親緣關(guān)系比較接近；與印度羅勒上的Erysiphe Pseudoidiumsp.（AY739112.1）在第13、78、79、82、83、86、89、98、105、119、122、126、130等很多堿基上有所不同；與日本大葉柳(LC028970.1)上的Erysiphe adunca在第 4、7、9、13、18、19、24、31、32、44、47、51、53、54、56等較多堿基上有所不同，可見(jiàn)兩種白粉菌親緣關(guān)系較桃葉蓼白粉菌與阿塞拜疆萹蓄親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而26種植物白粉菌的堿基序列在211 ～378 bp區(qū)間內(nèi)保持著高度的一致性，因此可初步判斷這部分堿基序列可能對(duì)白粉菌性狀穩(wěn)定遺傳這一功能起著保障作用。

3 討論

傳統(tǒng)菌物分類學(xué)有關(guān)白粉菌的分類在白粉菌科(Erysiphaceae)內(nèi)屬的劃分主要是根據(jù)形態(tài)（無(wú)性世代和有性世代）來(lái)進(jìn)行的，如真菌分生孢子的形狀、數(shù)量多少，孢子的大小以及著生的方式，一個(gè)閉囊殼內(nèi)有多少子囊以及所含有的子囊孢子數(shù)量等，其他一些重要特征如閉囊殼外所具有附屬絲的形態(tài)特征等也是分類的重要依據(jù)。目前隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)原有的分類方法與分類系統(tǒng)具有一定的缺陷[11-15]。如鉤絲殼屬(Uncinula)、半內(nèi)生鉤絲殼屬(Pleochaeta)和叉鉤絲殼屬(Sawadaea)，在它們的頂端附屬絲類型都呈現(xiàn)鉤狀卷曲，但實(shí)際上它們的差別卻比較大。節(jié)絲殼屬(Arthrocladiella)和叉絲殼屬(Microsphaera)二者都具有二叉狀分枝，實(shí)際上它們的無(wú)性世代根本不同，前者分生孢子的著生方式為單生，后者分生孢子的著生方式為串生。

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，如分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)手段的應(yīng)用，微生物的分類可以更多地采用一些先進(jìn)的技術(shù)，使科學(xué)家們可以對(duì)白粉菌研究關(guān)注其系統(tǒng)分類學(xué)的關(guān)系[16-18]。微生物學(xué)家對(duì)菌物分類的研究目前不僅僅局限在形態(tài)分類上面，目前對(duì)白粉病菌的鑒定研究擴(kuò)展了白粉菌的種類及其寄主范圍。分子生物學(xué)方法在病原物的鑒定上具有很多的優(yōu)點(diǎn)和可靠性，在對(duì)病原菌物分類及鑒定時(shí)，一些國(guó)際上通用的大型數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank等非常多的生物學(xué)信息可作為物種鑒定重要的參考來(lái)源，從而使微生物的分類能夠更加地準(zhǔn)確、有效。因此通過(guò)顯微觀察結(jié)合分子分類方法的應(yīng)用在真菌的分類學(xué)上就超來(lái)越受到重視[19-20]。

為了減少因?yàn)閭鹘y(tǒng)分類方法造成的誤差，本研究結(jié)合了分子生物學(xué)方法對(duì)桃葉蓼白粉菌進(jìn)行進(jìn)化分析，并通過(guò)構(gòu)建桃葉蓼白粉菌系統(tǒng)發(fā)育樹，為該病原菌的研究提供了有價(jià)值的信息。目前國(guó)內(nèi)外的研究中，對(duì)桃葉蓼的研究幾乎沒(méi)有，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以初步判定桃葉蓼白粉病的病原菌，并通過(guò)序列比對(duì)分析找到親緣關(guān)系接近的菌種，未來(lái)將參考由其同種同屬病原菌侵染發(fā)生的其他白粉病的防治方法，為桃葉蓼白粉病尋找系統(tǒng)的防治措施。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中通過(guò)顯微觀察到桃葉蓼白粉菌分生孢子呈柱形；子囊果呈暗褐色，多數(shù)聚生或者近聚生，多呈扁球形；子囊4 ～8個(gè)，多數(shù)呈各種不規(guī)則卵形，其中多含2 ～4個(gè)橢圓形子囊孢子，可以判斷桃葉蓼白粉病病原菌屬于叉絲殼屬，再結(jié)合序列比對(duì)分析確定該菌種與GenBank中的Polygonum aviculare（登錄號(hào)為L(zhǎng)C328322.1）、Polygonumerectum（登錄號(hào)為KX826856.1）之間的親緣關(guān)系最為接近，堿基序列相似度值達(dá)到99%，可以明確其病原菌與萹蓄為同種同屬。本研究將為桃葉蓼白粉病的鑒定提供合理的依據(jù)，也為桃葉蓼白粉病的防治提供方向和理論基礎(chǔ)。