遮光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對蛋雞卵泡發(fā)育的影響

李先強，王家鄉(xiāng)，吳艷，程詩彬，皮勁松，伍志敏，張穎，劉艷芳，朱昌友

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434023；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064；3.武漢民族科技飼料有限公司，湖北武漢 430223；4.湖北省科技信息研究院，湖北武漢 430071；5.湖北省畜牧良種場，湖北荊州 434010）

光照是密閉家禽舍中必不可少的環(huán)境因素之一。光線不僅為家禽提供照明，還影響家禽的生理反應(yīng)、行為、生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。家禽對光線感知尤其敏感，光線可對家禽生長和繁殖產(chǎn)生重大影響。家禽缺乏光照時會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，促進顆粒細胞凋亡、自噬及卵母細胞損傷，從而影響卵泡發(fā)育。也有研究表明，光照可以通過影響家禽體內(nèi)卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、促性腺激素釋放激素（GnRH）等繁殖激素的水平變化來影響蛋雞卵泡發(fā)育。光照還可以促進仔雞能量攝入，較高的能量攝入促進下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸激活，增加了體內(nèi)脂質(zhì)沉積，并且刺激生殖激素水平，從而全面加速仔雞的性成熟。此外，光照還可以通過促進褪黑素分泌來減輕家禽氧化應(yīng)激，間接影響卵泡發(fā)育。卵泡發(fā)育的狀態(tài)直接影響家禽的等級卵泡和排卵卵泡數(shù)量，從而對家禽產(chǎn)蛋數(shù)量產(chǎn)生相應(yīng)的影響。迄今為止，尚無關(guān)于遮光引起的氧化應(yīng)激對雞卵巢功能和卵泡發(fā)育的影響的相關(guān)報道。因此，本文研究了遮光引起的氧化應(yīng)激對蛋雞卵泡發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 將30 只體重約1.8 kg 且產(chǎn)蛋率相近（約為80%）的40 周齡健康產(chǎn)蛋雞（隨機分為遮光組、正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組，每組10 只，蛋雞由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。在室溫下，將每只母雞放在籠子里，喂養(yǎng)基本飲食，自由進食和喝水。遮光組使用遮光布覆蓋雞籠，以將雞籠內(nèi)的光強度降低至零，而不會影響通風(fēng)和食物攝入。正常光照組未做其他處理，其光照程序為16 h 光照:8 h 黑暗。遮光+復(fù)合維生素組除了用遮光布覆蓋外，還在飼料中添加200 mg/kg 的復(fù)合維生素并將其混勻。復(fù)合維生素由珠海市維諾種養(yǎng)有限公司提供。

1.2 樣品采集 處理7 d 后，遮光組產(chǎn)蛋雞的采食量顯著降低，平均產(chǎn)蛋率由80% 降至28%，但遮光+復(fù)合維生素組產(chǎn)蛋雞的采食量和產(chǎn)蛋量無顯著變化。每組隨機抽取5 只蛋雞進行采血，室溫靜置30 min 后，血清自然析出，分離血清并保存在4℃。之后立即脫頸處死蛋雞，解剖并采集卵泡，收集卵巢和肝臟組織。

1.3 顆粒細胞的分離和培養(yǎng) 收集3 組雞的小黃卵泡，并將其置于冰冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中。用無菌眼科鑷子除去卵泡的外血管和結(jié)締組織，將卵泡切開并迅速擠壓以排出蛋黃。用鑷子在PBS 中輕輕搖動卵泡，以分離顆粒細胞層。將與粒狀細胞層混合的液體轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，加入5 mL 提前溶解的 0.1% II 型膠原酶，并將樣品在37℃振蕩孵育30 min 以進行消化。終止消化時，添加5 mL 含10% FBS 的M199 培養(yǎng)基，將樣品輕輕吸移10～20 次，并用200 目細胞篩過濾，用M199培養(yǎng)基沖洗濾網(wǎng)，并將其以1 000 r/min 離心10 min。棄去上清液，收集細胞沉淀并用培養(yǎng)液洗滌2 次。將細胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基（1%青霉素-鏈霉素溶液+10%胎牛血清+M199 培養(yǎng)基）中。將細胞懸浮液在完全培養(yǎng)溶液中稀釋至1×106 細胞/mL 濃度。將懸浮的顆粒細胞加到細胞培養(yǎng)皿中，放置于37℃細胞培養(yǎng)箱中。

1.4 CCK-8（細胞計數(shù)試劑盒8）檢測顆粒細胞增殖活性 將分離的和培養(yǎng)的顆粒細胞組鋪在6 孔細胞板上，并分別在細胞貼壁24、48、72、96 h 后，加入CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育1 h，測量450 nm 處的吸光度。

1.5 蛋雞氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 采用ELISA 試劑盒（合肥萊爾生物技術(shù)有限公司，2020）測量血清、肝臟組織、卵巢組織和顆粒細胞中FSH、LH、孕酮（P）、活性氧（ROS）含量、丙二醛（MDA）水平和總抗氧化（T-AOC）水平，以及抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）活性。還通過ELISA試劑盒檢測了血清、肝臟組織、卵巢組織和顆粒細胞中的DNA 氧化損傷（8-OHdG）。

1.6 蛋雞卵巢組織和顆粒細胞Q-PCR 分析 使用Trizol 從卵巢組織和顆粒細胞中提取RNA，然后進行反轉(zhuǎn)錄（TaKaRa，中國大連）合成總cDNA，使用熒光定量試劑盒（TOYOBO，日本大阪），50 μL 反應(yīng)體系：1×SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 25 μL、Upstream primer（10 μmol/L）5 μL、Downstream primer（10 μmol/L）5 μL、cDNA template 5 μL、ddHO 5 μL。表1 反應(yīng)程序進行Q-PCR，分析氧化應(yīng)激相關(guān)基因和的表達水平。

表1 Q-PCR 反應(yīng)程序

1.7 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 26.0 軟件的單因素方差分析，Duncan's 法進行多重比較，利用GraphPad Prism 5 進行作圖，顯著性差異以<0.05 表示，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 實驗結(jié)果

2.1 遮光處理后蛋雞顆粒細胞增殖活性的檢測 CCK-8試驗結(jié)果表明（圖1），遮光組24、48、72 h 和96 h的相對增殖活性分別為1.293、1.479、1.093 和0.813，遮光+復(fù)合維生素組分別為1.652、2.029、1.582 和0.866，對照組均為1。與對照組相比，遮光組和遮光+復(fù)合維生素組的顆粒細胞增殖均從0～48 h 開始增加，而在48～96 h 后則明顯減少。此外，遮光+復(fù)合維生素組的顆粒細胞增殖活性始終高于遮光組。這表明遮光處理時，顆粒細胞的增殖活性下降。

圖1 遮光處理對卵泡中顆粒細胞增殖活性的影響

2.2 遮光處理后蛋雞氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測的變化

2.2.1 遮光處理后蛋雞體內(nèi)激素含量的變化 由表2 可知，遮光處理7 d 后，遮光組蛋雞的血清（<0.01）、肝臟和顆粒細胞（<0.05）中FSH 水平低于正常光照組，遮光組蛋雞血清、肝臟和顆粒細胞中FSH 水平低于遮光+復(fù)合維生素組（<0.01），正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組間無顯著差異。遮光組血清（<0.05）、卵巢（<0.01）和顆粒細胞（<0.05）的LH 水平低于正常光照組，遮光組血清（<0.05）、肝臟和卵巢（<0.01）的LH 水平低于遮光+復(fù)合維生素組，正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組間無顯著差異。遮光+復(fù)合維生素組卵巢組織中的LH 水平高于正常光照組（<0.05）。遮光組血清、肝臟（<0.01）和顆粒細胞（<0.05）中P水平高于正常光照組，遮光組血清（<0.01）、肝臟、卵巢和顆粒細胞（<0.05）中P水平高于遮光+復(fù)合維生素組，正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組沒有顯著差異。

表2 遮光對蛋雞血清、肝臟、卵巢組織和顆粒細胞中激素水平的影響

2.2.2 遮光處理后蛋雞體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的變化 由表3可知，遮光處理7 d 后，遮光組血清、肝臟和顆粒細胞的ROS 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05），后2 組無顯著差異。遮光組蛋雞血清和顆粒細胞的MDA 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05），遮光組卵巢組織MDA 水平高于正常光照組（<0.05）。正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組的MDA 水平無顯著差異。遮光組血清、肝臟和顆粒細胞的T-AOC 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。遮光組卵巢組織中的T-AOC 水平高于遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組的血清和卵巢組織中的T-AOC 水平無顯著差異。遮光+復(fù)合維生素組肝臟和顆粒細胞中的T-AOC 水平高于正常光照組（<0.05）。遮光組卵巢組織和顆粒細胞的SOD 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。遮光組血清SOD 水平高于遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。正常光照組與遮光+復(fù)合維生素組的SOD 水平無顯著差異。遮光組血清、肝臟和顆粒細胞的GSH 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。正常光照組肝臟的GSH 水平高于遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組的血清、卵巢組織和卵泡顆粒細胞GSH 水平無顯著性差異。遮光組肝臟、卵巢組織和顆粒細胞的CAT 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05），遮光組血清CAT 水平高于遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。遮光組的血清、肝臟、卵巢組織和顆粒細胞中的8-OHdG 水平高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.05）。正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組的血清、肝臟和卵巢組織中的8-OHdG 水平無顯著差異。遮光+復(fù)合維生素組卵泡顆粒細胞中的8-OHdG 水平高于正常光照組（<0.05）。

表3 遮光對蛋雞血清、肝臟、卵巢組織和顆粒細胞中的抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 遮光處理后蛋雞氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達水平的變化 由表4 可知，遮光處理7 d 后，與正常光照組相比，卵巢組織中遮光組的抗凋亡基因的表達水平降低（<0.01），抗氧化酶（<0.05）、、促凋亡（<0.01）基因表達水平升高；遮光組抗氧化酶（<0.05）、和促凋亡（<0.01）基因表達水平高于遮光+復(fù)合維生素組；正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組的和基因表達水平無顯著差異。

表4 遮光處理對卵巢組織和顆粒細胞中相關(guān)基因表達水平的影響

遮光處理7 d 后，在顆粒細胞中遮光組抗表達水平低于其他2 組（<0.01），遮光組S和基因表達高于正常光照組和遮光+復(fù)合維生素組（<0.01），其他基因的表達差異均不顯著。

3 討 論

3.1 遮光處理對蛋雞卵泡發(fā)育相關(guān)激素的影響 遮光的家禽會引起氧化應(yīng)激，并伴隨一系列激素水平的變化。遮光后，蛋雞的FSH 和LH 含量顯著降低，P含量顯著升高。光照可通過影響HPG 軸而直接影響家禽的繁殖性能。在光照應(yīng)激對雌性大鼠性激素水平和卵巢組織腫瘤壞死因子、干擾素蛋白表達的影響研究中，光照組大鼠血清雌二醇（E）水平顯著低于對照組，F(xiàn)SH 和LH 水平顯著高于對照組。不同波長的光照會對家禽的HPG 軸產(chǎn)生不同的影響，血漿E含量在綠色光照蛋雞中升高，P水平則在紅色和藍色光照蛋雞中升高。在光刺激作用下，GnRH 刺激垂體前葉釋放促性腺激素（FSH 和LH），這反過來又觸發(fā)性腺發(fā)育和類固醇激素的合成（大卵泡顆粒細胞中的P和小卵泡中的E）。卵泡發(fā)育離不開FSH 和LH，光照也可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生而間接影響FSH 和LH 等激素分泌，在各種因素引起的氧化應(yīng)激模型中均檢測到FSH 和LH 水平的變化。高溫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激蛋雞中FSH、LH、E顯著升高。在研究氯化汞在蛋雞卵巢中引起的氧化應(yīng)激時，用27.240 mg/kg Hg 處理可顯著降低蛋雞卵巢中FSH 和LH 含量。在對哺乳動物的氧化應(yīng)激研究中，也發(fā)現(xiàn)了FSH 和LH 的變化。如雙酚-a 類似物（雙酚-s）在小鼠卵巢組織中誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，并降低了LH 和FSH 含量?？鼘幷T導(dǎo)的氧化應(yīng)激大鼠的血清FSH 和LH 濃度顯著降低。在槲皮素對氯化鎘致雌性Wistar大鼠子宮和卵巢氧化應(yīng)激的影響研究中，檢測到大鼠卵巢中FSH 和LH 含量顯著降低。一線抗結(jié)核藥物的使用會導(dǎo)致大鼠氧化應(yīng)激，并顯著降低大鼠卵巢中的FSH 和LH 濃度。這些研究表明，氧化應(yīng)激會影響家禽中某些激素的分泌。遮光引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致家禽卵泡數(shù)量減少，改變相關(guān)激素分泌，并抑制卵泡發(fā)育，最終導(dǎo)致母雞產(chǎn)蛋減少。

3.2 遮光處理對蛋雞抗氧化指標(biāo)的影響 氧化應(yīng)激的發(fā)生伴隨著體內(nèi)抗氧化酶活性的變化。本研究發(fā)現(xiàn)在遮光條件下7d 后，蛋雞血清、肝臟、卵巢和卵泡顆粒細胞中的ROS、T-AOC、MDA、SOD、GSH、CAT 和其他物質(zhì)含量均呈現(xiàn)上升水平，抗氧化基因和的表達也顯著升高。蛋雞發(fā)生氧化應(yīng)激時，其體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，緊接著其抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用，總抗氧化能力T-AOC 及SOD、GSH、CAT 等活性升高，清除過量的ROS，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 含量也升高。不同因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激均會伴隨著機體抗氧化系統(tǒng)的改變。如大腸桿菌病導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，其MDA 水平及SOD、GPX 活性均顯著升高。在傷寒引起的氧化應(yīng)激蛋雞中，ROS、谷胱甘肽還原酶、GPX 和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性較高。在過量飼料氟對蛋雞產(chǎn)蛋性能及抗氧化能力的影響研究中，飼料添加800 mg/kg 和1 000 mg/kg 氟的母雞血清GPX 活性和MDA 含量均高于對照組。除蛋雞外，氧化應(yīng)激在哺乳動物中也會表現(xiàn)出一系列氧化指標(biāo)的變化。鄰苯二甲酸鹽（DEHP）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過顯著增加MDA 濃度以及谷胱甘肽合成酶（GSS）和SOD 的表達來抑制小鼠卵泡發(fā)育。在研究三聚氰胺對小鼠卵巢的氧化應(yīng)激時，發(fā)現(xiàn)三聚氰胺組的ROS、MDA、GPX 和SOD顯著高于對照組。在除草劑（2，4-二氯苯氧基乙酸）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激大鼠中，ROS 和MDA 含量以及GPX和CAT 活性顯著增加。營養(yǎng)限制誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激母羊中SOD、CAT 和GPX 濃度顯著增加。在研究左旋肉堿（LC）和氧化鋅納米顆粒（ZnONPs）對糖尿病大鼠的抗氧化作用時，其卵巢組織中GSH、CAT、SOD 的活性和MDA 含量均顯著增加。這些結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致，細微的差異可能部分是由于不同刺激引起的氧化應(yīng)激。

3.3 遮光處理對蛋雞顆粒細胞凋亡的影響 遮光會引起蛋雞發(fā)生氧化應(yīng)激，這可能會通過影響顆粒細胞的凋亡而引起卵巢損傷。本研究觀察到在遮光7 d 后，抗凋亡基因的表達水平顯著下降，促凋亡基因表達顯著提高。無論是遮光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，還是其他因素引起的氧化應(yīng)激，都會導(dǎo)致蛋雞顆粒細胞凋亡，卵泡發(fā)育受阻，從而降低其產(chǎn)蛋率。有研究表明，過量的鎘可引起蛋雞卵巢的氧化應(yīng)激、顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖。在鎘致蛋雞顆粒細胞氧化損傷和凋亡的研究中，鎘主要通過促進基因表達和抑制表達來發(fā)揮其毒性作用。高溫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激蛋雞卵泡顆粒細胞中水平顯著升高，而水平顯著降低。飼喂氧化玉米油的母雞發(fā)生氧化應(yīng)激，卵泡顆粒細胞中和表達顯著降低，而和的表達則顯著上升。在對哺乳動物氧化應(yīng)激研究中，一些化學(xué)試劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可檢測到同樣的結(jié)果。甘氨酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠卵巢中表達水平升高，表達水平下降。在壬基酚（NP）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激大鼠中，NP 處理的大鼠卵巢顆粒細胞水平顯著降低，水平顯著增加。聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）誘導(dǎo)大鼠氧化應(yīng)激，從而增加卵巢組織中的表達并降低的表達。在丙烯酰胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠卵巢中，表達顯著增加，的表達則顯著減少。以上研究結(jié)果與本文結(jié)果一致，表明氧化應(yīng)激通過調(diào)控卵泡顆粒細胞中凋亡相關(guān)基因的表達，從而促進顆粒細胞的凋亡，導(dǎo)致卵泡閉鎖。

4 結(jié) 論

禽類在光照缺失時，機體會產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。一方面，遮光誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過影響HPG 軸中卵泡發(fā)育相關(guān)激素的合成與分泌，降低FSH、LH 分泌，增加P分泌，來調(diào)控卵泡發(fā)育。同時，氧化應(yīng)激的發(fā)生伴隨著DNA 氧化損傷和抗氧化系統(tǒng)的變化，如遮光后蛋雞血清和顆粒細胞中SOD、GSH、CAT 等酶活性和T-AOC 均顯著增強，肝臟中除SOD外均顯著增強，卵巢中除GSH 外均顯著增強。另一方面，氧化應(yīng)激影響顆粒細胞中凋亡相關(guān)基因的表達水平的變化，即抑制和促進的表達，從而促進顆粒細胞凋亡和加速卵泡閉鎖，進而引起卵巢功能障礙。在家禽生產(chǎn)中，合理調(diào)節(jié)光照和減輕光照應(yīng)激是家禽健康發(fā)展所必需的。