廣靈大尾羊TP53INP2基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其在不同脂肪組織中的表達(dá)研究

侯文欣，潘洋洋，車雨彤，秦朋云，趙祥，喬利英，劉建華，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

在自然界中，生物體經(jīng)常面臨能量獲取不足的情況，所以需要在能量充足時(shí)將多余能量?jī)?chǔ)存起來(lái)。脂肪組織能夠動(dòng)態(tài)的儲(chǔ)存能量，在機(jī)體能量消耗過(guò)多或攝入不足時(shí)供能，但過(guò)多的脂肪分解會(huì)減少體內(nèi)脂肪沉積。脂肪沉積分為內(nèi)臟脂肪沉積和肌內(nèi)脂肪沉積，多余的內(nèi)臟脂肪沉積會(huì)影響家畜產(chǎn)肉率，而肌內(nèi)脂肪的沉積會(huì)提高肉質(zhì)口感。羊肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，食之能暖身補(bǔ)身，深入探究羊肉脂肪沉積相關(guān)基因的重要性不言而喻。

腫瘤蛋白p53 誘導(dǎo)的核蛋白2（Tumor Protein 53-Induced Nuclear Protein 2，TP53INP2）又稱糖尿病和肥胖調(diào)控蛋白（DOR），在人的淋巴細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)。TP53INP2 蛋白能夠作為甲狀腺激素受體（TR）的轉(zhuǎn)錄輔激活因子參與甲狀腺激素介導(dǎo)的成肌分化和成骨分化過(guò)程。TP53INP2 蛋白在細(xì)胞代謝中發(fā)揮雙重作用。一方面，TP53INP2 蛋白通過(guò)促進(jìn)rDNA 啟動(dòng)子處RNA 聚合酶I 前起始復(fù)合物的組裝促進(jìn)rDNA 轉(zhuǎn)錄，參與核糖體生物合成；另一方面，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，該蛋白在細(xì)胞核中與自噬相關(guān)蛋白LC3 結(jié)合，移至細(xì)胞質(zhì)中參與細(xì)胞自噬。許多研究表明，自噬在脂肪形成和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，基因與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)，但在小鼠和牛中所起的作用相反。過(guò)表達(dá)小鼠3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞中的基因，發(fā)現(xiàn)形成的脂滴減少，脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)量降低，表明基因抑制小鼠前體脂肪細(xì)胞的分化。但是過(guò)表達(dá)秦川牛前體脂肪細(xì)胞中的基因，導(dǎo)致形成的脂滴增加，脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)量升高，表明基因促進(jìn)牛前體脂肪細(xì)胞的分化。造成這種結(jié)果的原因可能是物種差異，也可能是基因參與的脂肪細(xì)胞分化通路不同。牛和羊均屬于反芻動(dòng)物，通過(guò)研究綿羊基因在前體脂肪細(xì)胞分化中的作用，與在小鼠和牛中的作用進(jìn)行比較，可以初步判斷是否因?yàn)槲锓N差異導(dǎo)致上述結(jié)果。

目前有關(guān)綿羊基因的報(bào)道較少。本課題組前期高通量測(cè)序結(jié)果表明，基因在廣靈大尾羊和湖羊尾部脂肪中表達(dá)量差異顯著。廣靈大尾羊?yàn)殚L(zhǎng)脂尾型羊，湖羊?yàn)槎讨残脱?。前期高通量測(cè)序的差異結(jié)果提示該基因可能對(duì)脂肪沉積起作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選用廣靈大尾羊進(jìn)行研究，克隆基因CDS 區(qū)，分析基因mRNA 序列及其編碼蛋白的性質(zhì)，并檢測(cè)5 種脂肪組織中該基因的表達(dá)情況，為研究基因在綿羊脂肪代謝中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 在屠宰場(chǎng)隨機(jī)挑選4 只8 月齡的廣靈大尾羊，屠宰后在無(wú)菌條件下迅速采集皮下脂肪、尾部脂肪、腹膜后脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪組織。將各組織分裝于標(biāo)記好的凍存管后，迅速放入液氮中，后轉(zhuǎn)至-80℃保存。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeSTARHS（Premix）、DL 2000 DNA Marker、DNA Loading Buffer、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和TB GreenPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）均購(gòu)自日本TaKaRa 公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 購(gòu)自美國(guó)Omega 公司；50×TAE 溶液、大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖和氨芐青霉素均購(gòu)自北京索萊寶公司；pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro 載體購(gòu)自漢恒生物科技（上海）有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 基因引物 根據(jù)NCBI 上綿羊的基因序列（XM_027977111.1），使用Primer Primier 5.0 軟件和GenScript Primer Design 在線工具設(shè)計(jì)特異性引物，選用作為內(nèi)參基因（所有引物見表1），引物均由Thermo Fisher 公司合成。

表1 引物信息

1.4 RNA 與cDNA 獲取 參考Trizol 試劑盒說(shuō)明書提取5 種脂肪組織的總RNA 后，吸取1 μL 打入核酸蛋白測(cè)定儀孔內(nèi)，檢測(cè)RNA 的濃度和純度值（OD/OD）。檢測(cè)合格后參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，測(cè)濃度和純度后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5基因CDS 區(qū)克隆與測(cè)序 PCR 反應(yīng)體系為15.8 μL：2×PrimeSTAR HS（Premix）7.6 μL，引物各0.6 μL，模板cDNA 1 μL，ddHO 6 μL。程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 10 s，72 ℃ 60 s，設(shè)為30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)完畢后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)正確條帶快速切膠，并回收純化目的片段。參照無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書連接目的片段與載體后，轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞中，涂抹在固體培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。挑選5個(gè)單克隆菌落進(jìn)行搖菌后，送至Thermo Fisher 公司測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN Version 6（Lynnon Biosoft，USA）軟件分析綿羊基因的測(cè)序結(jié)果；使用DNASTAR.Lasergene.v7.1（DNASTAR Inc.，USA）軟件將該基因的mRNA 序列與山羊（XM_01805 7741.1）、黃牛（XM_003586843.5）、野豬（XM_003 359949.4）、小鼠（NM_178111.3）、大鼠（NM_00127 0947.1）、人類（NM_021202.3）和黑猩猩（XM_0011 60082.4）進(jìn)行比對(duì)；使用Mega-X Version 10.1.8（Mega Limited，NZL）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析TP53INP2蛋白的理化性質(zhì)；使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析TP53INP2 蛋白的親疏水性；使用NetPhos 3.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白的磷酸化位點(diǎn)；使用PSORT II（https://www.genscript.com/tools/psort）預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白的亞細(xì)胞定位；使用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù) 測(cè)TP53INP2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP 4.1 Server（http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白的信號(hào)肽；使用NetNGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白的N-糖基化位點(diǎn)；使用NetOGlyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白的O-糖基化位點(diǎn)；使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用Phyre 2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2 output/）構(gòu)建TP53INP2 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以1.4 中獲取的cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為10 μL：TB Green Premix Ex Taq II 5 μL；上、下游引物各0.4 μL；cDNA 2 μL；ddHO 2.2 μL。程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃15 s，72℃ 20 s，設(shè)為40個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 1 min?？截惙磻?yīng)結(jié)束后的結(jié)果用于數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 以腹膜后脂肪為對(duì)照，為內(nèi)參，采用2法計(jì)算拷貝數(shù)據(jù)；使用GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc.，USA）軟件作圖并分析，差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1基因CDS區(qū)克隆與測(cè)序PCR反應(yīng)結(jié)束后的電泳結(jié)果顯示，675 bp 處有一條清晰明亮的條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與綿羊（XM_027977111.2）目的序列完全一致，表明成功克隆出廣靈大尾羊基因的CDS 區(qū)。

圖1 TP53INP2基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2mRNA 序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建 綿羊mRNA 序列與山羊、黃牛、大鼠、人類、小鼠、野豬和黑猩猩的相似性分別為99%、96.4%、65.5%、72.4%、65.4%、80.8% 和72.3%（圖2）。Mega-X 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中，綿羊與山羊親緣關(guān)系最近，與大鼠和小鼠親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3），與序列相似性比對(duì)分析結(jié)果相一致。

圖2 不同物種間TP53INP2mRNA 序列相似性比對(duì)

圖3 不同物種間TP53INP2mRNA 序列進(jìn)化樹遺傳距離關(guān)系

2.3 TP53INP2 蛋白理化性質(zhì)與親疏水性分析 將TP53INP2 蛋白序列輸入ProtParam 軟件中，結(jié)果顯示該基因可編碼224個(gè)氨基酸，TP53INP2 蛋白分子質(zhì)量為24 320.28 u，理論等電點(diǎn)（pI）為5.54，分子式為CHNOS，總原子數(shù)為3 382；不穩(wěn)定系數(shù)為77.63，是不穩(wěn)定蛋白；親水性總平均值為-0.596。利用ProtScale 軟件做進(jìn)一步的親疏水性分析，結(jié)果如圖4 所示，縱坐標(biāo)負(fù)值表示親水區(qū)，可見組成TP53INP2蛋白的氨基酸多集中在負(fù)值，整體表現(xiàn)為親水性，與ProtParam 軟件預(yù)測(cè)親水性的結(jié)果相同。

圖4 TP53INP2 蛋白親疏水性分析

2.4 磷酸化位點(diǎn)與糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) NetPhos 3.0 Sever軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)如圖5 所示，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點(diǎn)分別存在14、2、1個(gè)。NetNGlyc 1.0 Server 和NetOGlyc 4.0 Server軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白不存在N-糖基化位點(diǎn)，存在7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，分別位于第7、11、50、124、140、189、202 位氨基酸處。

圖5 TP53INP2 蛋白磷酸化位點(diǎn)

2.5 信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白前70個(gè)氨基酸的C-score、S-score 和Y-score 均小于0.2，在閾值0.5之下，說(shuō)明該蛋白不存在信號(hào)肽。TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)表明，TP53INP2 蛋白不存在跨膜區(qū)。PSORT II 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白主要分布在細(xì)胞核（47.8%），少量分布在細(xì)胞質(zhì)（8.7%）、液泡（4.3%）和線粒體（4.3%）中。

2.6 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) TP53INP2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的-螺旋、延伸鏈、-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲分別占23.66%、13.39%、1.79% 和61.16%（圖6）。所構(gòu)建的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7 所示。

圖6 TP53INP2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 TP53INP2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果分析基因在廣靈大尾羊5 種脂肪組織中均有表達(dá)，其中在皮下脂肪組織中表達(dá)量最高，其次是尾部脂肪組織，腹膜后脂肪組織中表達(dá)量最低；在皮下脂肪組織與其余4 種脂肪組織中均有顯著差異；在腹膜后脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪組織中的差異不顯著（圖8）。

圖8 TP53INP2基因在廣靈大尾羊各脂肪組織的表達(dá)量

3 討 論

自噬是一種細(xì)胞必需的、保守的自我進(jìn)食過(guò)程，可降解可溶性蛋白、聚集蛋白、細(xì)胞器、大分子復(fù)合物和異物，該過(guò)程需要形成自噬體的雙膜結(jié)構(gòu)，最終與溶酶體融合。有研究表明，TP53INP2 能夠調(diào)控哺乳動(dòng)物和果蠅細(xì)胞中自噬體的形成來(lái)參與細(xì)胞自噬。在小鼠骨骼肌中，敲除基因，骨骼肌自噬水平下降，小鼠肌肉肥大，表明TP53INP2 通過(guò)激活自噬負(fù)調(diào)控小鼠骨骼肌的生成。此外，TP53INP2 還可以促進(jìn)糖原合成酶激酶3（GSK3）的隔離，通過(guò)將其隔離到膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)中激活WNT 通路抑制脂肪前體細(xì)胞的分化，而TP53INP2 隔離GSK3的作用依賴于自噬活性。近年來(lái)研究表明，在細(xì)胞核內(nèi)TP53INP2能與LC3 結(jié)合，之后TP53INP2-LC3 復(fù)合物從細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)，與自噬相關(guān)蛋白ATG7 相互作用，從而促進(jìn)自噬體的生物發(fā)生。本研究預(yù)測(cè)顯示，綿羊TP53INP2 蛋白大量定位于細(xì)胞核內(nèi)，少量定位于細(xì)胞質(zhì)，提示該蛋白通過(guò)自噬調(diào)控綿羊的肌肉和脂肪生成。

基因在進(jìn)化上高度保守，研究表明，小鼠TP53INP2 氨基酸序列與哺乳動(dòng)物的相似性均大于70%。在本研究中，綿羊基因的mRNA序列與哺乳動(dòng)物的相似性均大于64.8%，說(shuō)明該基因在進(jìn)化上高度保守。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示，TP53INP2蛋白等電點(diǎn)為5.54。理論等電點(diǎn)可以在等電聚焦電泳以及使用離子交換層析分離純化蛋白時(shí)作為參考。不穩(wěn)定系數(shù)起判斷目的蛋白穩(wěn)定性的作用，當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)大于40 為不穩(wěn)定蛋白。TP53INP2 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為77.63，說(shuō)明該蛋白是不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上，能夠使蛋白質(zhì)在具有電荷后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以此來(lái)調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活性。本研究預(yù)測(cè)顯示，TP53INP2 蛋白存在17個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白的功能可能由氨基酸的磷酸化產(chǎn)生。蛋白質(zhì)糖基化主要分為N-糖基化和O-糖基化，對(duì)蛋白質(zhì)折疊、可溶性、穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位起重要作用。O-糖基化主要將糖基加至絲氨酸或蘇氨酸上，與磷酸化存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這種競(jìng)爭(zhēng)性修飾對(duì)轉(zhuǎn)錄很重要。TP53INP2 蛋白存在7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白可能通過(guò)磷酸化位點(diǎn)與糖基化位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。信號(hào)肽是蛋白質(zhì)N-末端的短肽鏈，靶向真核生物的分泌途徑。TP53INP2 蛋白不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，說(shuō)明該蛋白不屬于膜蛋白和分泌蛋白。有研究表明，TP53INP2 蛋白在人和大鼠中主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，與TR 相互作用，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。在本研究中，預(yù)測(cè)TP53INP2 蛋白主要定位于細(xì)胞核，提示該蛋白在綿羊中發(fā)揮同樣作用。無(wú)規(guī)則卷曲容易被側(cè)鏈相互作用影響，是造成蛋白不穩(wěn)定的重要原因。預(yù)測(cè)顯示，TP53INP2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的無(wú)規(guī)則卷曲占比高達(dá)61.16%，說(shuō)明該蛋白穩(wěn)定性差，這與理化性質(zhì)預(yù)測(cè)該蛋白是不穩(wěn)定蛋白的結(jié)果相符。

脂肪遍及全身各個(gè)地方，可將白色脂肪組織分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪。通常，皮下脂肪指所有皮膚下層的脂肪組織，尾脂也屬于皮下脂肪，具有保溫、儲(chǔ)能及參與代謝等功能；內(nèi)臟脂肪指沉積于內(nèi)臟周邊的脂肪組織，對(duì)內(nèi)臟起保護(hù)作用，儲(chǔ)能能力比皮下脂肪小。有研究表明，在秦川牛脂肪細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)基因能引起基因表達(dá)量的升高，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化。在廣靈大尾羊中，尾部脂肪基因的表達(dá)量高于腎周、小網(wǎng)膜和腸系膜脂肪，表現(xiàn)為皮下脂肪表達(dá)量高于內(nèi)臟脂肪。基因在脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中起主要調(diào)控作用，活化的基因能夠增加脂肪細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。在本研究中，基因在廣靈大尾羊皮下脂肪的表達(dá)量最高，尾部脂肪的表達(dá)量高于腎周、腸系膜和腹膜后脂肪，整體表現(xiàn)為皮下脂肪表達(dá)量高于內(nèi)臟脂肪，與基因的表達(dá)趨勢(shì)相同。推測(cè)基因可能通過(guò)促進(jìn)基因的表達(dá)促進(jìn)綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化。

4 結(jié) 論

TP53INP2 蛋白是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白，存在17個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，可能通過(guò)磷酸化位點(diǎn)與O-糖基化位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用?；蛟趶V靈大尾羊5 種脂肪組織中均有表達(dá)，總體呈皮下脂肪表達(dá)量高于內(nèi)臟脂肪，該結(jié)果提示基因可能有促進(jìn)綿羊脂肪沉積的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為研究基因在綿羊脂肪代謝中的作用提供一定參考。