一例豬鏈球菌與豬圓環(huán)病毒3 型混合感染的診治

蔡衛(wèi)忠，吳早林，全 濤，楊克禮，田永祥

（1.紅安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北紅安 438499；2.鶴峰縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北鶴峰 445800；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是重要的人畜共患病原，鏈球菌感染可引起腦膜炎、心肌炎和敗血癥等癥狀。豬鏈球菌病是由鏈球菌引起的豬急性、敗血癥型和腦膜炎型的人畜共患傳染?。?］，該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)給相關(guān)從業(yè)人員的生命安全造成了嚴(yán)重的威脅［2］。豬鏈球菌據(jù)其莢膜多糖的差異，有35 個(gè)血清型，引起豬和人發(fā)病的以2 型豬鏈球菌為主［3，4］。臨床上有急性和慢性兩種病例。急性一般未出現(xiàn)癥狀即死亡，主要是敗血癥；慢性主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大、跛行，耳后、腹下、肛門等有出血點(diǎn)等。急性型發(fā)病率和死亡率均較高；慢性型死亡率較低，但影響感染豬的生長(zhǎng)發(fā)育［4］。

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovi?rus）［5］。2016 年以前，在全球范圍內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）有PCV1 和PCV2 兩個(gè)基因型［6］。PCV1 對(duì)豬無致病性。PCV2 感染后主要危害是引起豬體的免疫抑制，導(dǎo)致繼發(fā)其他疫病從而造成死亡［7］。2016 年，美國報(bào)道發(fā)現(xiàn)一種新的圓環(huán)病毒-豬圓環(huán)病毒3 型（Porcine circovirus type 3，PCV3），隨后韓國、波蘭、意大利和中國等國均報(bào)道有PCV3 的 發(fā) 生［8，9］。PCV3 感 染 豬 的 臨 床 表 現(xiàn) 與PCV2 相似。臨床上，PCV3 可單獨(dú)存在，也可與其他病原混合感染［10］。

2021 年10 月份，湖北省紅安縣某規(guī)?；i場(chǎng)保育豬先后大量發(fā)病，出現(xiàn)持續(xù)性、反復(fù)性腹瀉、發(fā)燒、氣喘等癥狀，四肢前端、后背、臀部皮膚發(fā)紺，后背兩側(cè)皮膚有散在紅色點(diǎn)狀丘疹，持續(xù)近20 d，病豬消瘦，部分豬只死亡，經(jīng)濟(jì)損失較大。將豬場(chǎng)送檢的病料送至相關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離鑒定和PCR 檢測(cè)，診斷為豬鏈球菌和PCV3 混合感染。根據(jù)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，制定了綜合防控技術(shù)方案，經(jīng)實(shí)施后，疫情得到了有效控制。將該病的防控工作總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

發(fā)病瀕臨死亡保育豬2 頭，由湖北省紅安縣某規(guī)?；i場(chǎng)送至相關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 試劑

Viral DNA/RNA Miniprep Kit（Axygen Scientif?ic），Ex-Taq 酶、Prime Script One Step RT-PCR Kit、DL 2000 Marker（Takara），M-肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基以及其他生化培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純，購自商業(yè)公司。PCV3 檢測(cè)引物由北京擎科生物工程公司合成。

1.3 樣品處理

無菌采集病料組織直接涂布載玻片，進(jìn)行革蘭氏染色；無菌采集病豬肺、脾及淋巴結(jié)等組織，制作抹片，經(jīng)干燥、火焰固定后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

于超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)取前述病料直接接種于鮮血瓊脂平板，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h 后，挑取典型菌落接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)24~48 h，革蘭氏染色、鏡檢，并做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)。

1.5 病毒核酸的提取

將病料組織與DMEM 溶液按體積比1∶5 混合，充分勻漿，反復(fù)凍融3~5 次，立即提取核酸或置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。病毒核酸按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.6 PCV3 PCR 擴(kuò)增

取提取的DNA，利用文獻(xiàn)［11］中的引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL，包含10 × PCR buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 5.0 μL，ddH2O 補(bǔ)充至50 μL。循環(huán)參數(shù)為94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，拍照記錄結(jié)果。

1.7 防控措施

加強(qiáng)管理，全面消毒。嚴(yán)禁生產(chǎn)區(qū)工作人員出入，飼養(yǎng)員和各類用具嚴(yán)禁串舍。舍外場(chǎng)地和豬舍空欄用2%~3%的氫氧化鈉（燒堿）溶液噴灑消毒。豬舍內(nèi)每3 d 用消毒水帶豬消毒1 次。

緊急接種。對(duì)無明顯癥狀的豬只，用自家苗緊急免疫，2~4 mL/頭。

對(duì)癥治療。對(duì)繼發(fā)感染的豬只，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用高敏抗菌藥物進(jìn)行治療；對(duì)呼吸困難的豬只使用麻黃堿、氨茶堿等止咳平喘藥物進(jìn)行治療；對(duì)發(fā)熱豬只使用安乃近、氨基比林等退燒藥物進(jìn)行治療。

輔助治療。PCV3 為病毒性疫病，使用抗生素治療無效，建議配合使用干擾素、免疫球蛋白、病毒靈、高免血清等廣譜抗病毒的藥物進(jìn)行輔助治療。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定結(jié)果

病料組織接種鮮血瓊脂平板，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后，可見灰白色、稍微隆起的、表面光滑濕潤(rùn)的半透明的小菌落，菌落周圍可見約1 mm 透明溶血環(huán)，呈典型的β-型溶血（圖1）。革蘭氏染色，鏡檢可見大量短鏈狀或長(zhǎng)鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌（圖2）。對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果該菌發(fā)酵麥芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、水楊酸和山梨醇，不發(fā)酵阿拉伯糖和木糖，綜上判定該菌為鏈球菌。

圖1 鮮血瓊脂平板上的菌落

圖2 顯微鏡下的革蘭氏陽性鏈球菌

2.2 PCV3 PCR 檢測(cè)結(jié)果

以病豬組織中提取的病毒DNA 為模板，利用文獻(xiàn)中［11］PCV3 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果所檢測(cè)的組織樣品全部擴(kuò)增出與預(yù)期產(chǎn)物大小相一致的目的條帶（約1 021 bp），即為PCV3 陽性（圖3）。

圖3 PCV3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

綜合檢測(cè)結(jié)果可知，所檢8 份組織樣品均為豬圓環(huán)病毒3 型陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)及細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果，判定該豬場(chǎng)本次暴發(fā)的疫情為豬鏈球菌和豬圓環(huán)病毒3 型的混合感染。

按“1.7”綜合防控措施實(shí)施14 d 后，該豬場(chǎng)的發(fā)病豬頭數(shù)日益減少，豬場(chǎng)已無死亡病例發(fā)生，疫病得到控制。30 d 后疫情平息，生產(chǎn)恢復(fù)正常。

3 討論

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病理變化及細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，8 份組織樣品PCV3 均為陽性，確診該豬場(chǎng)發(fā)生的疫病為豬鏈球菌與PCV3 的混合感染。豬鏈球菌病一年四季均有發(fā)生，飼料營養(yǎng)失衡、飼養(yǎng)環(huán)境差、應(yīng)激等因素均可誘發(fā)該病［12］。但在很多情況下，鏈球菌可繼發(fā)于其他病原感染之后，如PRRSV 感染、PCV2 感染等。

自2017 年以來，中國包括湖北省、山東省及廣東 省 等10 多 個(gè) 省 份 均 發(fā) 現(xiàn) 有PCV3 的 存 在［13，14］。PCV3 初次發(fā)現(xiàn)時(shí)，感染PCV3 的豬并無特征性臨床特征呈現(xiàn)，僅是組織切片中部分組織出現(xiàn)了病理變化［8］。但這些病理變化不一定是豬感染PCV3 后引起的特征性病變。目前由于PCV3 無有效藥物進(jìn)行治療，同時(shí)PCV3 分離培養(yǎng)難度相對(duì)較大，再加上PCV3 的病原學(xué)特性、流行病學(xué)特點(diǎn)、致病機(jī)理等尚不完全清楚，因此PCV3 的預(yù)防和控制更加不易。

混合感染常常使豬病情復(fù)雜化，給疾病的診斷、治療增加了難度，因此對(duì)發(fā)病豬盡早確診、盡早治療，以減少混合感染、繼發(fā)感染病例的發(fā)生。各類養(yǎng)豬場(chǎng)，對(duì)于疫病的防控均應(yīng)貫徹預(yù)防為主的方針，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生。豬舍保持良好的通風(fēng)和適宜的溫濕度；給予豬只充足的營養(yǎng)，減少應(yīng)激；定期消毒，交替使用消毒藥，防止耐藥菌株的產(chǎn)生。只有采取上述綜合防控措施才能最大限度地減少疫病的發(fā)生，確保養(yǎng)殖場(chǎng)健康可持續(xù)發(fā)展。