蜂蜜中嗜滲酵母計數(shù)的培養(yǎng)基優(yōu)化及方法比較

陸 雯，李秀通，彭醒醒，胡淑紅，周婷婷，王 珍

（綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，杭州 310000）

蜂蜜中出現(xiàn)的酵母主要有嗜滲酵母（Osmophil?ic yeast）和耐高糖酵母（Sugar-tolerant yeasts）［1］，其中嗜滲酵母對蜂蜜品質(zhì)影響較大［2］。新的國家標(biāo)準(zhǔn)增加嗜滲酵母計數(shù)限量要求，也是進(jìn)一步提高蜂蜜產(chǎn)品安全性的需要［3，4］。

嗜滲酵母計數(shù)的檢測主要依據(jù)GB14963—201l《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜》附錄A 規(guī)定的方法進(jìn)行。該方法采用常規(guī)取樣稀釋后，取0.1 mL 進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，最低檢測限量<100 CFU/g，而GB 14963—2011 中嗜滲酵母限量為≤200 CFU/g［5］，在最高稀釋倍數(shù)（10-2）平板上長出3~14 個菌落，表明結(jié)果超限量，而這些數(shù)值不在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則要求中，即檢測過程偏離標(biāo)準(zhǔn)要求。此外，取0.1 mL 進(jìn)行涂布的操作過程，誤差較大，方法結(jié)果準(zhǔn)確度較低，菌落與DG18 瓊脂平板背景色差不明顯等，無論是對檢測機(jī)構(gòu)的檢測及判斷評判還是對監(jiān)督執(zhí)法部門的公正執(zhí)法都具有一定的風(fēng)險。此外，國標(biāo)方法中對嗜滲酵母的培養(yǎng)條件為25±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，較一般的菌落培養(yǎng)周期長。因此，為縮短培養(yǎng)周期及降低檢測限，迫切需要對蜂蜜中嗜滲酵母的計數(shù)方法進(jìn)一步研究。研究表明，生物素有利于釀酒酵母的生長［6，7］，而孟加拉紅被廣泛用于霉菌酵母的培養(yǎng)基中，可使生長的菌落背面顯出較濃的紅色，有助于計數(shù)。本研究通過比較涂布法［5，8］、傾注法［9］、濾膜法［10］的計數(shù)結(jié)果以獲得最佳的操作方法以及在培養(yǎng)基中添加一定含量的生物素和孟加拉紅從而改進(jìn)培養(yǎng)基配方以獲得更適合嗜滲酵母計數(shù)的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisi?aeCICC 1346）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 樣品 人工污染嗜滲酵母的蜂蜜及自然界污染嗜滲酵母的蜂蜜。

1.1.3 培養(yǎng)基 30%的葡萄糖溶液（pH 6.5±0.5）、氯硝胺18%甘油（DG18）、瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯浸出粉、酪蛋白胨、無水葡萄糖、硫酸二氫銨、硫酸鎂、氯硝胺、無水甘油、氯霉素、孟加拉紅購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生物素購自Sigma 公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 生化培養(yǎng)箱（LRH-250F，上海一恒）；拍擊氏均質(zhì)器（BagnMixer400CC，法國inter?science）；電子天平（BSA224S，德國賽多利斯）；精密移液器（Eppendorf）；微生物限度儀（HTY-302 型，杭州泰林）。

1.2 方法

1.2.1 取樣 無菌稱取25 g 樣品于225 mL 30%葡萄糖稀釋液中，均質(zhì)拍打2 min，制備成1∶10 的稀釋液。用無菌吸管吸取1∶10 稀釋液1 mL，加入9 mL 30%葡萄糖無菌稀釋液漩渦混勻制成1∶100 的稀釋液，依此方法可進(jìn)一步稀釋。濾膜法的樣品稀釋為，用無菌吸管吸取1∶10稀釋液10 mL加入90 mL 30%葡萄糖無菌稀釋液漩渦混勻制成1∶100 的稀釋液，依此方法可進(jìn)一步稀釋。

1.2.2 涂布法 根據(jù)樣品污染情況選擇合適稀釋梯度，吸取0.1 mL 稀釋液于DG18 瓊脂平板上，用無菌涂抹棒在平板表面均勻涂布，同一稀釋度接種2 塊平板，同時吸取0.1 mL 30%葡萄糖稀釋液于新的DG18 瓊脂平板，相同方法涂布作為空白對照。

1.2.3 傾注法 選擇合適稀釋度的稀釋液，吸取1 mL 稀釋液于無菌平皿中，同一稀釋度接種2 塊平板，同時吸取1 mL 30%葡萄糖稀釋液于新的空白平皿中作為空白對照，將配制好并冷卻至46 ℃左右的DG18 培養(yǎng)基傾注于加好稀釋液的培養(yǎng)基中，每塊平皿傾注20 mL 左右，并輕輕轉(zhuǎn)動平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混合均勻。

1.2.4 濾膜法 用無菌鑷子夾取0.45 μm 滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定濾杯，將100 mL 稀釋液傾入濾杯過濾，用100 mL 無菌水分3 次潤洗稀釋液容器，將潤洗液繼續(xù)過濾，將過濾后的濾膜貼在已制備好的DG18 平板上，平鋪并避免在濾膜和培養(yǎng)基間夾留氣泡。

1.2.5 培養(yǎng) 接種完后將平板置于25±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，于48 h 后逐日觀察。

1.2.6 菌落計數(shù) 根據(jù)嗜滲酵母的菌落形態(tài)計數(shù)，對于難判斷的菌落選擇顯微鏡檢進(jìn)一步確認(rèn)。

1.3 培養(yǎng)基優(yōu)選

1.3.1 培養(yǎng)基組分 比較氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）及孟加拉紅培養(yǎng)基（RBM）的組分，確定新的培養(yǎng)基組分（g/L）為馬鈴薯浸出粉12 g，酪蛋白胨5.0 g，無水葡萄糖10.0 g，硫酸二氫銨1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯硝胺0.1 g，無水甘油200 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，孟加拉紅0.033 g，生物素的量通過單因素試驗確定，組成新的培養(yǎng)基名稱為PDMG18。

1.3.2 單因素試驗 在已確定組分的基礎(chǔ)上，分別添加生物素0.005、0.010、0.015、0.020 μg。分別用涂布法、傾注法和濾膜法計數(shù)。

1.3.3 PDMG18 與DG18 培養(yǎng)基比較 相同操作方式及培養(yǎng)條件下，分別計數(shù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基（PDMG18）及DG18 培養(yǎng)基上的嗜滲酵母，比較菌落在2種培養(yǎng)基上的生長特點(diǎn)及同一梯度下的數(shù)量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種方法檢測限比較

制備適當(dāng)濃度的菌懸液采用涂布法、傾注法和濾膜法分別進(jìn)行蜂蜜中嗜滲酵母計數(shù)，每種方法均進(jìn)行3 次平行試驗，當(dāng)菌落數(shù)在小于100 CFU/g 時，涂布法無法獲得準(zhǔn)確的菌落數(shù)，而傾注法與過濾法可以得到具體的菌落數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 3 種方法檢測嗜滲酵母的檢測限

2.2 模擬污染嗜滲酵母的蜂蜜檢測

在蜂蜜中添加嗜滲酵母制備成人工污染的蜂蜜，通過3 種方法檢測嗜滲酵母，結(jié)果見表2。由表2可知，濾膜法培養(yǎng)后檢出的菌落數(shù)較涂布法多，傾注法檢出的菌落數(shù)最少。涂布法在操作過程中添加至平板上的稀釋液僅為0.1 mL，對于吸液的器具量程精確度較高，而用涂布棒涂布過程中，涂布棒涂布完成后棒體上會附著部分樣液，造成實際樣液小于0.1 mL 而影響檢測結(jié)果。相較于涂布法，傾注法吸取的稀釋液為每平皿1 mL，吸液誤差較小，但對于培養(yǎng)基的溫度要求較高，一般傾注培養(yǎng)基溫度在46 ℃，可能會造成部分嗜滲酵母死亡，影響檢測結(jié)果。濾膜法的稀釋液為100 mL，且稀釋液容器經(jīng)過多次潤洗收集，過程中的誤差最小，最能反應(yīng)樣品中真實的嗜滲酵母數(shù)量。

表2 3 種方法檢測被污染的蜂蜜中嗜滲酵母結(jié)果

2.3 PDGM18 培養(yǎng)基組分的確定

不同生物素含量對嗜滲酵母計數(shù)的影響見表3。由表3 可知，通過單因素試驗，發(fā)現(xiàn)在其他組分量確定的情況下，生物素添加量為0.010 μg 時檢出的嗜滲酵母數(shù)量最多，且菌落生長狀況最佳。生物素為酵母生長所必需的營養(yǎng)素，不耐熱，需要過濾滅菌后控制培養(yǎng)基溫度在46 ℃左右時添加，經(jīng)混勻后傾注平皿。

表3 不同生物素含量對嗜滲酵母計數(shù)的影響（單位：CFU/g）

2.4 PDGM18 培養(yǎng)時間對嗜滲酵母計數(shù)的影響

制備適當(dāng)濃度的菌懸液，利用PDMG18 培養(yǎng)基采用涂布法、傾注法和濾膜法分別進(jìn)行蜂蜜中嗜滲酵母計數(shù)，每種方法均進(jìn)行3 次平行試驗，于25 ±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，于48 h 后逐日觀察，結(jié)果見表4。由表4 可知，培養(yǎng)2 d 肉眼可見有菌落生長，但因菌落過小無法計數(shù)，培養(yǎng)3 d 能清晰計數(shù)，且直至7 d 數(shù)據(jù)無明顯變化。

表4 PDGM18 培養(yǎng)時間對嗜滲酵母計數(shù)的影響 （單位：CFU/g）

2.5 PDMG18與DG18瓊脂平板測定嗜滲酵母的比較

制備同一濃度的菌懸液，準(zhǔn)備PDMG18 培養(yǎng)基與DG18 培養(yǎng)基，分別用涂布法、傾注法、濾膜法分別測定，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，3 種方法中利用PDGM18 培養(yǎng)基測定的數(shù)據(jù)均比DG18 培養(yǎng)基測定的高。培養(yǎng)至2 d，PDGM18 培養(yǎng)基上的菌落能肉眼可見，但菌落較小無法計數(shù)，培養(yǎng)至3 d，PDGM18 培養(yǎng)基上的菌落較清晰可見，可進(jìn)行計數(shù)；在DG18 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至4 d 菌落能肉眼可見，可進(jìn)行計數(shù)。相較于DG18 培養(yǎng)基，PDGM18 培養(yǎng)基可將計數(shù)時間提前1 d（圖2）。

圖1 3種方法分別用DG18與PDMG18檢測嗜滲酵母的結(jié)果

圖2 DG18 與PDMG18 上嗜滲酵母的生長情況

3 討論

嗜滲酵母是蜂蜜發(fā)酵的主要原因［11，12］，2017 年嗜滲酵母被食品藥品監(jiān)管總局列入蜂蜜檢驗項目中。國家食品藥品監(jiān)督管理總局官網(wǎng)上公布數(shù)據(jù)顯示，國家食品安全監(jiān)督抽檢不合格產(chǎn)品中嗜滲酵母占不合格蜂產(chǎn)品比例約為12.65%；食品安全監(jiān)督抽檢不合格產(chǎn)品中嗜滲酵母占不合格蜂蜜比例約為14.65%［13］。針對蜂蜜嗜滲酵母計數(shù)的國標(biāo)方法檢測限較高，檢測時間較長，需要建立檢測效率較高且檢測限低的方法。通過3 種方法檢測限比較，涂布法、傾注法及濾膜法最大檢測限量分別<100 CFU/g、<10 CFU/g、<1 CFU/g。涂布法受限于接種量且涂布誤差較大；傾注法受培養(yǎng)基溫度的影響較大且菌落生長在培養(yǎng)基內(nèi)，現(xiàn)有培養(yǎng)基DG18 的顏色與菌落顏色接近，影響觀察與計數(shù)；濾膜法不受接種量的限制，可以通過改變?nèi)恿窟_(dá)到最大檢測量，且可反復(fù)沖洗樣品容器減少殘留誤差，但操作較繁瑣。綜合考慮，為更好地監(jiān)測蜂蜜中嗜滲酵母，降低檢測限，濾膜法是值得推薦的方法。此外，本研究根據(jù)嗜滲酵母的原有配方及微量元素對于嗜滲酵母的生長情況，在原有配方中增加新的成分，分別為馬鈴薯浸出粉、生物素、孟加拉紅，結(jié)合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中該成分的量作為基礎(chǔ)，孟加拉紅的作用是增加觀察背景，故直接選擇通用量。通過對生物素進(jìn)行單因素試驗，確定新的培養(yǎng)基組分為馬鈴薯浸出粉12 g，酪蛋白胨5.0 g，無水葡萄糖10.0 g，硫酸二氫銨1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯硝胺0.1 g，無水甘油200 g，瓊脂15 g，氯霉素0.1 g，孟加拉紅0.033 g，生物素0.1 g。在該培養(yǎng)基上通過濾膜法培養(yǎng)，可以提高嗜滲酵母的最低檢測限且使培養(yǎng)時間縮短至3 d。因馬鈴薯浸出粉為混合物，而促進(jìn)蜂蜜中嗜滲酵母快速生長的具體有效成分還有待進(jìn)一步研究。嗜滲酵母的生長與水分含量有關(guān)［14］，一些處理方法也會受影響［15］，因此后期也可對水分含量及處理方法進(jìn)一步優(yōu)化。

4 小結(jié)

在原有嗜滲酵母計數(shù)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加孟加拉紅、馬鈴薯浸出粉和生物素獲得新的培養(yǎng)基PDMG18，對涂布法、傾注法及濾膜法微生物定量檢測進(jìn)行比較，建立了1 種檢測限低、檢測效率較高的適合蜂蜜嗜滲酵母計數(shù)的方法。