西洋參果肉、果梗及籽中皂苷類成分分析

李樂(lè)，余慧，付書(shū)正，王翠竹，李平亞，2，劉金平，2，劉云鶴※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)天然藥物研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

西洋參（Panax quinquefolium L.）是五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）植物。原產(chǎn)于加拿大和美國(guó)，1978年開(kāi)始在我國(guó)引種栽培[1,2]。《中國(guó)藥典》收錄的藥用部位為干燥根。近年來(lái)，西洋參莖、葉、花及果實(shí)等非傳統(tǒng)用藥部位受到越來(lái)越多的關(guān)注[3-5]。研究表明，各部位中人參皂苷的組成和含量有所不同[6-8]。例如，各干燥部位中的總皂苷含量差異較大（主根4.25%，側(cè)根4.80%，莖葉11.99%，果肉7.07%，果柄6.23%，種皮0.75%，胚乳0.06%）[6,9]。由于莖葉中總皂苷含量較豐富，“西洋參莖葉總皂苷”現(xiàn)已作為藥品（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030072）應(yīng)用于臨床。隨著地上部分的研究日益深入，西洋參果的研究也取得了較好的進(jìn)展：與根部比較，果中總皂苷含量明顯更為豐富[10,11]，且具有抗氧化、抗心肌缺血、抗腫瘤、降血糖和增強(qiáng)免疫力的作用[12-16]。作者前期首次采用LC-MS法鑒定了西洋參果梗中的小分子物質(zhì)（包括三萜皂苷、甾體和酰胺等101個(gè)化學(xué)成分）[17]，結(jié)果表明與人參果梗和三七果梗相似，早期被丟棄的西洋參果梗同樣富含人參皂苷[18,19]，但未進(jìn)行單體皂苷的定量檢測(cè)。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道了人參籽[20,21]和三七籽[21-23]的化學(xué)成分研究以及西洋參籽種皮及胚乳的總皂苷含量測(cè)定[24，25]，但未見(jiàn)關(guān)于西洋參籽總皂苷及單體人參皂苷含量測(cè)定的報(bào)道。文獻(xiàn)報(bào)道已證明，新鮮藥材與干燥藥材在成分組成和含量上會(huì)存在一定的差異，故對(duì)新鮮西洋參果（果肉、果梗和籽）中的人參皂苷進(jìn)行定量分析十分必要。

紫外-可見(jiàn)分光光度法（Ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis）是測(cè)定總皂苷含量的常規(guī)方法，具有專屬性強(qiáng)、快速和準(zhǔn)確等特點(diǎn)[26，27]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light Scattering Detector,ELSD）為通用的非特異性檢測(cè)器，可檢測(cè)結(jié)構(gòu)中無(wú)紫外吸收基團(tuán)的人參皂苷類成分（例如Ocotillol型人參皂苷PF11）[28]。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLCELSD）法已廣泛用于皂苷類成分的分析[29-32]。因此，為豐富西洋參果的化學(xué)成分研究，本研究首先采用UVVis法測(cè)定西洋參果各部位的總皂苷含量，繼而建立HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定11種單體人參皂苷含量的方法，并測(cè)定各部位的主要單體人參皂苷含量。以期為評(píng)價(jià)西洋參果中皂苷類成分提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用西洋參果等非藥用部位提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

2020年9月，于吉林省靖宇市采集3年生和4年生西洋參的新鮮帶梗果實(shí)，人工剝離得到果肉、果梗和籽3個(gè)部位。西洋參果留樣凍存于吉林大學(xué)天然藥物研究中心。

1.2 試劑與儀器

人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg3、（20R）-Rg3、PF11以及三七皂苷R2對(duì)照品均為自制，經(jīng)NMR、HR-LC-MS鑒定結(jié)構(gòu)，并采用HPLC法測(cè)定純度（均大于99.0%）；香草醛、高氯酸、石油醚和乙醇為分析純，甲醇、乙腈為HPLC級(jí)；AB-8型大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)于南開(kāi)大學(xué)化工廠。

UV-2102C型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯儀器有限公司，上海）；Waters 1525型HPLC色譜儀（Waters公司，上海）；SEDEX 80 ELSD檢測(cè)器（SEDERE，法國(guó)），CS-solution色譜工作站（島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司，上海）；XD2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，上海）；W5S型恒溫水浴鍋（吉豫科教儀器設(shè)備有限公司，長(zhǎng)春）；T.G.L-16aR型飛鴿超離速離心機(jī)（安亭科學(xué)儀器廠，上海）；PTX-FA210S型電子天平（華志電子科技有限公司，福建）。

1.3 總皂苷的制備

1.3.1 西洋參果肉總皂苷 精密稱取新鮮西洋參果肉100 g，加入10倍體積量70%的乙醇，加熱回流提取3次，每次3 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收至無(wú)醇味，加于AB-8大孔吸附樹(shù)脂，水洗，90%的乙醇洗脫，合并醇洗脫液，減壓濃縮，80℃干燥，即得[33]。

1.3.2 西洋參果?？傇碥?精密稱取新鮮西洋參果梗10 g，剪碎（長(zhǎng)約1 cm），加入10倍體積量石油醚，室溫浸泡24 h，過(guò)濾，棄去濾液，取濾渣。參照1.3.1方法，自“加入10倍體積量70%的乙醇”起依法操作。

1.3.3 西洋參籽總皂苷 精密稱取新鮮西洋參籽50 g，加入10倍體積量石油醚，室溫浸泡24 h，過(guò)濾，棄去濾液，取濾渣。參照1.3.1方法，自“加入10倍體積量70%的乙醇”起依法操作。

1.4 總皂苷含量的測(cè)定

1.4.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取1.3中所制備的西洋參果肉、果梗、籽總皂苷適量，精密稱定，分別加甲醇溶解并制成濃度為2.0 mg/mL的供試品溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取人參皂苷Re對(duì)照品溶液20L、40L、80L、120L、160L和200L，分別置于具塞試管中，低溫?fù)]去溶劑，加入1%香草醛高氯酸試液0.5 mL，置60℃恒溫水浴加熱15 min，立即用冰水冷卻2 min，加入77%硫酸溶液5 mL，搖勻；以相應(yīng)試劑作空白，參照《中國(guó)藥典》2020版一部“人參總皂苷”含量測(cè)定方法[34]，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y），Re的量為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 單體皂苷含量的測(cè)定

1.5.1色譜條件 COSMOSIL5C18-PAQ色譜柱（250mm 4.6 mm，5m），柱溫：35℃；乙腈（A）水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。流速：1.0 mL/min，ELSD條件為：載氣N2，漂移管溫度45℃，載氣壓力為0.3 MPa，靈敏度為10。

表1 HPLC-ELSD梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure of the HPLC-ELSD method

1.5.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Re、Rg3、（20R）-Rg3、PF11以及三七皂苷R2對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成濃度為0.2～0.7 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液同1.4.1中供試品溶液制備方法。

1.5.3 方法學(xué)考察

1.5.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按照1.5.2中供試品溶液制備方法制備西洋參果肉供試品溶液6份，按照1.5.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各供試品溶液中11個(gè)單體人參皂苷含量，并計(jì)算RSD值。

1.5.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.5.2中西洋參果肉供試品溶液，室溫下分別放置0 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h后，按照1.5.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各單體皂苷峰面積的自然對(duì)數(shù)的RSD值。

1.5.3.5 回收率試驗(yàn) 取1.3中西洋參果肉樣品，精密加入適量的混合對(duì)照品，按照1.5.2方法制備6份供試品溶液，根據(jù)1.5.1色譜條件測(cè)定，計(jì)算各單體皂苷的回收率（%）和RSD值。

1.5.3.6 樣品含量測(cè)定 取各供試品溶液，按照1.5.1色譜條件進(jìn)樣20L，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各供試品溶液中11個(gè)單體人參皂苷的含量，并折算成鮮果肉、果梗和籽中各單體人參皂苷的含量（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總皂苷含量

測(cè)得人參皂苷Re對(duì)照品的線性回歸方程為y=0.002 4x+0.014 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4，說(shuō)明人參皂苷Re在20～200g范圍含量?jī)?nèi)線性關(guān)系良好。

含量測(cè)定結(jié)果：新鮮西洋參果肉中總皂苷平均含量為4.03%，籽中為0.36%，果梗中則為0.26%。果肉、果梗和籽中的總皂苷含量差異較大，以果肉中總皂苷含量最高，籽和果梗中總皂苷含量相近。

2.2 單體皂苷含量

2.2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1.1 線性關(guān)系 以各單體人參皂苷峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)樣量（g）的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如下回歸方程（表2）。相關(guān)系數(shù)均大于0.999 7，結(jié)果表明，該11個(gè)單體人參皂苷在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 11種單體人參皂苷的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 The linear regression equation，correlation coefficients and linear ranges of 11 kinds of monomer ginsenosides

2.2.1.2 精密度試驗(yàn) 連續(xù)5次進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液中，各單體人參皂苷峰面積自然對(duì)數(shù)的RSD值分別為1.83%、1.75%、1.67%、1.72%、1.59%、2.12%、1.85%、1.47%、1.62%、1.97%和1.54%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.1.3重現(xiàn)性試驗(yàn) 6份西洋參果肉供試品溶液測(cè)定結(jié)果中，各單體人參皂苷含量的RSD值分別為1.57%、0.97%、1.54%、1.35%、1.75%、1.53%、1.84%、1.76%、1.59%、2.12%和1.94%，均小于3%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 西洋參果肉供試品溶液室溫放置24 h后，各單體人參皂苷峰面積自然對(duì)數(shù)的RSD值分別為1.75%、2.15%、1.78%、2.07%、2.09%、1.84%、1.76%、1.94%、1.67%、1.44%和1.59%，均小于3%，表明西洋參果肉供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.5回收率試驗(yàn) 6份西洋參果肉供試品溶液中11種單體人參皂苷的平均回收率分別為96.82%、98.35%、95.97%、96.65%、97.65%、100.25%、101.35%、99.34%、97.59%、100.44%和97.66%，平均回收率為96.82%～101.35%；RSD值分別為2.33%、1.64%、0.97%、1.35%、1.75%、1.44%、1.87%、1.55%、2.11%、2.29%和1.94%，均小于3%。結(jié)果表明該方法回收率較高，準(zhǔn)確度良好。

2.2.2 樣品含量測(cè)定 混合對(duì)照品溶液以及西洋參果肉、果梗、籽供試品溶液的典型色譜圖見(jiàn)圖1。從混合對(duì)照品溶液色譜圖中可見(jiàn)，80 min內(nèi)，11個(gè)單體皂苷均可檢出，且分離度良好。

圖1 混和對(duì)照品溶液（A）、西洋參果肉（B）、果梗（C）以及籽供試品溶液（D）的HPLC-ELSD圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed reference substance solution(A)，American ginseng berry(B)，stem(C)，and seed(D)test solutions

以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各供試品溶液中11個(gè)單體皂苷成分的含量，并折算成鮮果肉、果梗、籽中的各單體人參皂苷的含量（%），結(jié)果見(jiàn)表3，可知3個(gè)部位中單體皂苷種類很相似，但含量卻存在較大差異：新鮮西洋參果肉中含有較多的人參皂苷Rb3（0.98%）、Rg3（0.60%）和PF11（0.45%），果梗中則含有較多的人參皂苷Re（0.04%）、（20R）-Rg3（0.04%）和Rb3（0.03%），而籽中則含有較多的人參皂苷Rb3（0.10%）、PF11（0.04%）和Rb1（0.03%）。

表3 鮮西洋參果肉、果梗以及籽中主要單體皂苷含量Table 3 Contents of main monomer saponins in the fresh berry，stem and seed of American ginseng

3 討論

總皂苷研究結(jié)果表明，新鮮西洋參果肉、果梗和籽中均含有人參皂苷，西洋參果肉中總皂苷含量最為豐富（4.03%），其次是籽（0.36%）、果梗（0.26%）。與文獻(xiàn)報(bào)道比較，西洋參果肉中總皂苷含量高于西洋參主根中總皂苷含量（3.43%）[35]。

單體皂苷研究結(jié)果表明，所建立的11種皂苷同時(shí)測(cè)定的方法簡(jiǎn)單、可行，為人參皂苷的同時(shí)測(cè)定提供參考。分析結(jié)果證明，西洋參果梗、籽中人參皂苷的種類與西洋參果肉相似，但含量存在差異：果梗中Re（0.04%）、Rb3（0.03%）和（20R）-Rg3（0.04%）含量較高，而籽中則含有較多的PF11（0.04%）、Rb1（0.03%）和Rb3（0.10%）。與文獻(xiàn)報(bào)道比較，人參皂苷PF11（0.45%）、Rb3（0.98%）和Rg3（0.60%）在西洋參果肉中的含量高于西洋參根和莖葉，且西洋參果肉中人參皂苷Rb3的含量高于在西洋參根中的含量（0.55%）[32]。此外，西洋參果的HPLC-ELSD譜圖上尚存在一些未鑒定的色譜峰，在將來(lái)的研究中將進(jìn)行進(jìn)一步地分離提取和鑒定。

以上研究說(shuō)明西洋參果是寶貴的人參皂苷來(lái)源。籽常用于栽培，但果梗和果肉都應(yīng)該得到更充分的合理利用。本研究填補(bǔ)了新鮮西洋參果肉、果梗、籽總皂苷以及單體人參皂苷研究的空白，為豐富和進(jìn)一步評(píng)價(jià)西洋參果的化學(xué)組成提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用西洋參果這一非藥用部位提供研究基礎(chǔ)。