淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片對(duì)低鈣飲食所致骨質(zhì)疏松幼年大鼠的影響

王玉，趙宏宇，劉新宇，邸琳

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012）

兒童缺鈣導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，使其整體體格發(fā)育異常，導(dǎo)致身材矮小、佝僂病等疾病的發(fā)生[1]，所以對(duì)于缺鈣的兒童應(yīng)該盡早地預(yù)防和治療由于缺鈣導(dǎo)致的生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[2]。中藥防治骨質(zhì)疏松癥是臨床醫(yī)學(xué)中的一個(gè)治療手段[3-5]，在治療骨質(zhì)疏松方面有獨(dú)特的療效。中藥能改變骨組織結(jié)構(gòu)和增加骨密度等[6]，但作用機(jī)理尚不清楚，并且中藥對(duì)于小兒缺鈣的防治研究和藥物開(kāi)發(fā)也較缺少。

在中醫(yī)理論中，淫羊藿中有效成分是淫羊藿苷，通過(guò)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨而達(dá)到治療目的，以其補(bǔ)腎陽(yáng)、益腎精之功而為君藥[7-9]。骨碎補(bǔ)有增加骨密度和骨強(qiáng)度的作用，能促進(jìn)骨細(xì)胞骨形態(tài)形成[10,11]。鹿骨主治虛勞骨弱、風(fēng)濕痹痛等，具有補(bǔ)虛羸和強(qiáng)筋骨等功效[12]。采用剛出生1個(gè)月左右的斷乳大鼠，給予低鈣飼料，淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片為受試物，通過(guò)測(cè)定身長(zhǎng)、體重、血清標(biāo)志物、骨密度以及股骨病理等指標(biāo)研究受試物對(duì)低鈣幼鼠的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取60只出生4周左右的斷乳SD大鼠，體重60～80 g，雌性，購(gòu)自于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK-（遼）2020-0001；由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 受試物及飼料

淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片主要成分為淫羊藿提取物、骨碎補(bǔ)提取物、鹿骨粉和碳酸鈣等，吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院自制；低鈣飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限責(zé)任公司。

1.3 儀器及材料

Faxitron雙能X射線小動(dòng)物骨密度儀（儀器型號(hào)：Faxitron-UltraFocus,VIS-10 15，美國(guó)Faxitron）；Direct-Pure System超純水系統(tǒng)，購(gòu)自Rephile Bioscierce,Ltd（上海樂(lè)楓生物科技有限公司）；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JA2003B型千分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；大鼠秤（型號(hào)：YP10001，上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)）；PINP、BALP ELISA試劑盒（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：202001）；無(wú)機(jī)磷檢測(cè)試劑盒（試劑批號(hào)：2020122301；校準(zhǔn)品批號(hào)：2020120801）；鈣檢測(cè)試劑盒（試劑批號(hào)：2020122801；校準(zhǔn)品批號(hào)：2020122801）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

60只斷乳雌性大鼠正常飼料適應(yīng)3 d后，禁食16 h，稱(chēng)體重，按體重隨機(jī)分為低鈣組、高鈣組（碳酸鈣333 mg/kg）、淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高劑量組[1.7g/（kg bw），含碳酸鈣（333 mg）]、中劑量組[0.85 g/（kg bw），含碳酸鈣（166 mg）]、低劑量組[0.425 g/（kg bw），含碳酸鈣（84mg）]，單只分籠飼養(yǎng)，連續(xù)灌胃4周。低鈣組、高鈣量組與淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中和低劑量組以基礎(chǔ)低鈣飼料喂養(yǎng)，全部自由飲超純水，以避免從飲水中獲得鈣。灌胃給予受試物，每日1次，體積10 mL/（kg bw）。

2.2 指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 大鼠體重、身長(zhǎng)、食量和食物利用率的測(cè)定 每周稱(chēng)體重1次（g），測(cè)量身長(zhǎng)1次（嘴尖到肛門(mén)距離cm），每周稱(chēng)飼料1次，計(jì)算食物利用率（每周增長(zhǎng)體重/每周食量乘以100%），連續(xù)4周。

2.2.2 大鼠骨代謝標(biāo)志物及血鈣、血磷測(cè)定 末次給受試物后24 h處理。試驗(yàn)結(jié)束，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心10 min，取血清，用酶聯(lián)法測(cè)定血清中骨代謝標(biāo)志物：Ⅰ型原膠原N端前肽（PINP）、骨堿性磷酸酶（BALP）。取血清測(cè)定血鈣、血磷濃度，用偶氮胂Ⅲ法測(cè)定血鈣濃度，用磷鉬酸鹽法測(cè)定血磷濃度。

2.2.3 大鼠股骨重量、骨密度和鈣含量測(cè)定 取雙側(cè)股骨，左側(cè)股骨用于骨密度測(cè)定（整根股骨的平均骨密度，采用Faxitron雙能X射線小動(dòng)物骨密度儀直接測(cè)定）和骨鈣測(cè)定[取其中左側(cè)股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，稱(chēng)量骨干重，然后置于馬弗爐中灰化，灰化完成后加硝酸水溶液（1+1）消化，定容，用EDTA滴定]。

2.2.4 大鼠骨病理檢查 右側(cè)股骨用于骨組織病理學(xué)檢查。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠體重、身長(zhǎng)、試食量及食物利用率的影響

淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組及高鈣組大鼠體重、身長(zhǎng)、食量和食物利用率[13]與低鈣組比較，差別無(wú)顯著意義（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 受試物對(duì)食用低鈣飼料大鼠體重、身長(zhǎng)、食量及食物利用率的影響Table 1 Effects of the experiment on the body weight,body length,food intake and food utilization in rats fed with the low calcium diet

3.2 大鼠BALP、PINP及血鈣、血磷的影響

淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高劑量組與低鈣組比較，大鼠血清PINP含量顯著增加，具有極顯著差異（P＜0.01），中劑量組和高鈣組與低鈣組比較，差異顯著（P＜0.05）。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組與低鈣組比較，大鼠血清BALP活性顯著增加，具有極顯著差異（P＜0.01），高鈣組大鼠血清BALP活性有增加趨勢(shì)，但與低鈣組比較兩組差別不顯著（P＞0.05）。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組和高鈣組大鼠與低鈣組比較，血鈣含量顯著增加，差異顯著（P＜0.05）。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組和高鈣組大鼠與低鈣組比較，血磷含量差異不顯著（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 受試物對(duì)飼喂低鈣飼料大鼠BALP、PINP及血鈣和血磷的影響Table 2 Effects of the test substance on BALP,PINP,blood calcium and blood phosphorus in rats fed with the low calcium diet

3.3 藥物對(duì)大鼠股骨重量、骨密度和鈣含量的影響

淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高劑量組及高鈣組大鼠股骨骨密度與低鈣組比較，顯著增加，有極顯著差別（P＜0.01），中劑量組大鼠股骨骨密度與低鈣組比較，顯著增加，有顯著差別（P＜0.05）。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組及高鈣組大鼠股骨重量與低鈣組比較，顯著增加，有極顯著差別（P＜0.01）。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組及高鈣組大鼠骨鈣含量與低鈣組比較，顯著增加，有極顯著差別（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 受試物對(duì)飼喂低鈣飼料大鼠骨密度、股骨重量、骨鈣的影響Table 3 Effects of the test substance on the bone mineral density,femur weight and bone calcium of rats fed with the low calcium diet

圖1為大鼠左側(cè)股骨雙能X射線掃描骨密度圖，每5只一張圖片。

圖1 大鼠左側(cè)股骨雙能X射線掃描骨密度圖Fig.1 The bone density of rat left femur by the dual-energy X-ray scanning

3.4 大鼠骨病理檢查結(jié)果

圖2為股骨病理圖片。低鈣組飼喟后大鼠股骨骨皮質(zhì)變薄，骨皮質(zhì)內(nèi)破骨細(xì)胞增多；骨小梁變細(xì)，骨小梁間距增加，骨小梁分布疏松。骨組織內(nèi)未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，未見(jiàn)軟骨退變。

圖2 對(duì)大鼠股骨病理學(xué)影響Fig.2 Effects on the pathology of the rat femur

高鈣組和淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高劑量組、中劑量組和低劑量組與低鈣組比較，高鈣組動(dòng)物股骨骨皮質(zhì)明顯增厚，骨皮質(zhì)內(nèi)少見(jiàn)破骨細(xì)胞；骨小梁增粗，骨小梁間距縮小，骨小梁分布數(shù)量增加。骨組織內(nèi)未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，未見(jiàn)軟骨退變。其中高劑量組動(dòng)物股骨骨皮質(zhì)增厚程度增加，動(dòng)物骨形態(tài)評(píng)分明顯改善。

依據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)股骨染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大鼠股骨組織常規(guī)染色觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistical observation of routine staining of the rat femur tissue

4 討論與結(jié)論

幼兒是骨形成的重要階段，幼兒缺鈣對(duì)兒童骨骼生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的危害[14]。有研究表明，在兒童和青少年時(shí)期增加骨量峰值，可以降低老年罹患骨質(zhì)疏松的發(fā)病率[15]。

本研究中食用低鈣組飼料的幼齡大鼠的身長(zhǎng)、體重、食量和食物利用率與其他組比較均沒(méi)有顯著性差別，但是通過(guò)骨掃描和病理學(xué)檢查，骨密度和骨組織結(jié)構(gòu)與高鈣組和淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片組比較，均低于高鈣組和給藥組。股骨重量和骨鈣含量低鈣組也明顯低于高鈣組和給藥組。

BALP與PINP都是骨形成標(biāo)志物[16]。PINP是I型原膠原N端前肽，是監(jiān)測(cè)骨代謝微小變化最敏感的指標(biāo)[17]，用于監(jiān)測(cè)骨形成的標(biāo)志物，PINP與成骨細(xì)胞的活躍程度呈線性相關(guān)，主要反映I型膠原蛋白的合成速率和骨轉(zhuǎn)換情況，由于低鈣組大鼠食用低鈣飼料，所以骨骼成長(zhǎng)礦化受阻，I型膠原蛋白的合成速率和骨轉(zhuǎn)換要低于高鈣組[18-20]，所以血清中PINP與高鈣組比較，低于高鈣組。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中劑量組血清中PINP高于低鈣組，說(shuō)明淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片的高、中劑量起到了與高鈣組相似的效果，得出顯著性結(jié)果。BALP是骨特異性堿性磷酸酶，是成骨細(xì)胞的一種細(xì)胞外酶，利于骨形成，合成于骨基質(zhì)成熟階段，與骨的正常生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[21,22]。由于低鈣組食用低鈣飼料，合成骨基質(zhì)少于高鈣組，所以高鈣組血清中BALP高于低鈣組血清中BALP。淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片高、中、低劑量組血清中BALP高于低鈣組。

血磷、血鈣是骨密度檢查時(shí)常規(guī)檢測(cè)的指標(biāo)[23,24]，低鈣組大鼠由于缺乏鈣的攝入和補(bǔ)充，造成低血鈣，高鈣組和給藥組的各劑量組血鈣都在正常水平。血磷的含量在血液中是比較穩(wěn)定的，低鈣并沒(méi)有造成血磷含量波動(dòng)，各組之間并沒(méi)有顯著性差異。

綜上所述，淫羊藿骨碎補(bǔ)鹿骨片具有提高低鈣飲食所致骨質(zhì)疏松幼年大鼠骨密度和骨鈣的功效。