降解玉米秸稈放線菌的篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉曉飛 ,侯 艷, 鄭志輝 ,馬京求, 戚月娜, 郝 冬

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028)

伴隨著時(shí)代的創(chuàng)新與開拓，可循環(huán)利用的生物質(zhì)能源已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)問題[1].在中國(guó)，農(nóng)作物秸稈是最為豐富的農(nóng)業(yè)廢棄物之一，同時(shí)也是最為豐富的可再生資源之一，年總產(chǎn)量約為8×109t[2].其主要構(gòu)成成分木質(zhì)纖維素已被認(rèn)可為環(huán)境友好、取之不盡的原材料能源[3].但由于處理方式不當(dāng)造成極大的資源浪費(fèi)以及環(huán)境問題，秸稈的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和成分也導(dǎo)致了其難以降解利用[4].而物理、化學(xué)、生物法因其自身優(yōu)勢(shì)被認(rèn)為是有效處理秸稈的方法[5].GUO H[6]等人用物理法使秸稈中纖維素降解了17.76%.且比較了物理、化學(xué)和微生物法處理玉米秸稈，發(fā)現(xiàn)微生物法降解秸稈后會(huì)最大程度地保留玉米秸稈中的營(yíng)養(yǎng)成分.WANG P[7]等用化學(xué)法處理秸稈，發(fā)現(xiàn)三種木質(zhì)纖維素材料的降解率均有所提高，纖維素提高了40.08%、半纖維素提高了45.71%、木質(zhì)素提高了52.01%.WEI Y[8]等人將嗜熱放線菌接種在小麥、大豆、玉米和水稻秸稈中，結(jié)果表明，接種放線菌后不僅改變了原有菌群群落的結(jié)構(gòu)，且可使秸稈內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.PEI-PEI LI[9]等人創(chuàng)建了一種微生物降解體系A(chǔ)DS-3，該體系的酶活可達(dá)0.15 U/mL，表明該體系可對(duì)纖維素進(jìn)行降解.目前，物理化學(xué)法處理秸稈成本高、反應(yīng)不完全、易造成二次污染，且依然改變不了纖維素降解率低下的問題，而生物法具有反應(yīng)條件溫和、投資小、成本低、無污染等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過對(duì)比并綜合考慮為最佳的解決途徑.

本實(shí)驗(yàn)已在寒地土壤中篩選出一株放線菌CPA-3-4，而該菌具有高效降解纖維素的能力.在研究中以秸稈為底物進(jìn)行微生物發(fā)酵，采用單因素、響應(yīng)面優(yōu)化秸稈的發(fā)酵條件，從而確定最優(yōu)條件.在最優(yōu)條件下，采用范式洗滌法測(cè)定發(fā)酵前后秸稈中主要成分的變化情況，通過掃描電鏡、傅里葉紅外光譜對(duì)發(fā)酵前后秸稈進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，可知CPA-3-4對(duì)纖維素的降解能力，為研究微生物降解秸稈提供創(chuàng)新思路.

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

樣品：土壤、玉米秸稈.

上述兩種樣品由黑龍江省牡丹江市獲得(東經(jīng)128°02′、北緯43°24′).

1.1.2 儀器與設(shè)備

見表1.

表1 儀器與設(shè)備

1.1.3 培養(yǎng)基制備

CPA固體培養(yǎng)基：纖維素0.25%，MgSO40.02%，丙酮酸鈉0.2%，CaCl20.05%，脯氨酸0.1%，K2HPO40.02%，KNO30.025%，F(xiàn)eSO40.001%，瓊脂2%，pH 7.2～7.4.

ISP3固體培養(yǎng)基：燕麥片2%，MgSO40.02%，KNO30.02%，K2HPO40.05%，瓊脂2%，pH 7.2～7.4.

CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 1.5%，酵母膏0.1%，NH4NO30.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.05%，pH 7.2～7.4.

GY液體培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，葡萄糖1%，MgSO40.05%，K2HPO40.05%，pH 7.2～7.4.

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈2 g，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，pH 7.2～7.4.

1.2 方法

1.2.1 放線菌的初篩

土樣經(jīng)自然風(fēng)干后，用酒精灼燒后的研缽研磨，取5 g于100 mL錐形瓶，稱取45 mL無菌水加入后封口，在28 ℃，180 r/min的條件下震蕩1 h，經(jīng)過濾即是10-1原液，為得到濃度為10-3、10-4、10-5的樣品，將其進(jìn)行稀釋處理，分別取稀釋后的菌液200 μL，于CPA培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布處理，于28 ℃條件下進(jìn)行倒置培養(yǎng)，15 d后將培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的放線菌挑至ISP3固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行單菌落篩選，直到得到單一菌落便可進(jìn)行傳代培養(yǎng).

1.2.2 放線菌的復(fù)篩

CMC-Na培養(yǎng)基被用于鑒定篩選出的單一菌落，將菌落點(diǎn)至培養(yǎng)基中在28 ℃下恒溫倒置培養(yǎng)7 d，配制1 g/L剛果紅溶液注入平板中，30 min后，1 mol/L NaCl溶液洗脫30 min，將每一個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)量處理、并記錄其透明圈的直徑D與菌落生長(zhǎng)的直徑d.

1.2.3 纖維素酶活力的測(cè)定

菌株的纖維素酶酶活的測(cè)定，參照文獻(xiàn)[10]的方法.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制，并在540 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定菌株的四種酶活力：濾紙酶活力(FPA)、外切葡聚糖酶活力(C1)、內(nèi)切葡聚糖酶活力(Cx)和β-葡萄糖苷酶酶活力.

1.2.4 菌種鑒定

1)形態(tài)學(xué)觀察

將所篩的菌株接在ISP3培養(yǎng)基上經(jīng)過28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行菌株的形態(tài)學(xué)觀察；經(jīng)觀察后將菌株接種于GY培養(yǎng)基并經(jīng)過28 ℃，180 r/min培養(yǎng)7 d，取適量菌體置于載玻片上，將菌體用番紅溶液處理，利用顯微鏡鏡檢觀察其微觀結(jié)構(gòu).

2)分子生物學(xué)鑒定

提取所篩菌株的DNA可參照文獻(xiàn)[11]，PCR擴(kuò)增其16S rRNA序列，連接載體pMD18-T后，轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性克隆重組子，送至檢測(cè)機(jī)構(gòu)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Ez Bio Cloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)數(shù)據(jù)庫(kù)分析對(duì)比序列的相似性，用臨近法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.5 玉米秸稈降解率的測(cè)定

利用失重法[12]對(duì)玉米秸稈進(jìn)行降解率(Y)的測(cè)定.具體計(jì)算公式如下：

Y=(m-m1)/m×100%

其中:Y為秸稈降解率；m為培養(yǎng)基中秸稈粉末質(zhì)量；m1為降解后秸稈粉末質(zhì)量.

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

以Y為指標(biāo)，探究發(fā)酵天數(shù)(1、3、5、7、9 d)、培養(yǎng)基初始pH值(4、5、6、7、8)、發(fā)酵轉(zhuǎn)速(140 、160 、180 、200、220 r/min)、發(fā)酵溫度(24、26、28、30、32 ℃)及接菌量(1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)Y的影響，按上述單因素依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)均在前一因素實(shí)驗(yàn)的較優(yōu)結(jié)果上進(jìn)行.

1.2.7 玉米秸稈發(fā)酵條件的優(yōu)化

利用軟件Design-Expert version8.0.6響應(yīng)面法優(yōu)化秸稈的降解條件.選擇對(duì)纖維素降解率影響較大的因素為影響因素，以秸稈降解率(Y)為響應(yīng)值，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化.通過方差分析以及檢驗(yàn)回歸方程中各項(xiàng)影響及顯著性水平.利用等高線圖，分析影響因子間的相互作用以及對(duì)Y的影響，在一定范圍內(nèi)得出最優(yōu)發(fā)酵條件及降解率，并進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證.

1.2.8 玉米秸稈中主要成分的測(cè)定

測(cè)定發(fā)酵前與最優(yōu)條件下發(fā)酵后的秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及灰分各組分的含量采用范式洗滌法[13].

1.2.9 玉米秸稈掃描電鏡結(jié)構(gòu)觀察

1.2.10 玉米秸稈紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[15]處理秸稈，對(duì)發(fā)酵前與最優(yōu)條件下發(fā)酵后的玉米秸稈進(jìn)行紅外光譜掃描觀察.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 剛果紅染色菌株CPA-3-4的鑒定結(jié)果

菌株CPA-3剛果紅鑒定結(jié)果如圖1所示.

圖1 菌株CPA-3-4剛果紅染色結(jié)果

如圖1所示可知，其中剛果紅染色透明圈直徑(D)與菌落生長(zhǎng)直徑(d)分別為(22.90±5.48)mm和(4.50±0.57) mm，CPA-3-4的透明圈與菌落的比值為D/d=5.02±0.75.該結(jié)果表示CPA-3-4具備較好的纖維素降解效果.

2.2 菌株CPA-3-4纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果

1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示.

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2所示葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制可利用origin 8.0，該曲線的回歸方程為Y=1.1214x-0.117 9，R2=0.998 49，擬合度較好.

2)酶活測(cè)定結(jié)果

從現(xiàn)在以至未來，人類社會(huì)已然進(jìn)入“一切皆可編程、萬(wàn)物均要互聯(lián)”的時(shí)代，面對(duì)人工智能以及數(shù)據(jù)開放造成的物理和人身傷害，360集團(tuán)發(fā)布了“360安全大腦-分布式智能網(wǎng)絡(luò)安全防御系統(tǒng)”，系統(tǒng)匯聚了360十余年的海量數(shù)據(jù)和4000多項(xiàng)大數(shù)據(jù)與人工智能專利技術(shù)，構(gòu)建起一個(gè)集感知、學(xué)習(xí)、推理、預(yù)測(cè)以及決策于一體的智能防御系統(tǒng)，為基礎(chǔ)設(shè)施安全、社會(huì)安全、城市安全以及個(gè)人安全保駕護(hù)航。

經(jīng)測(cè)定菌株CPA-3-4四種酶FPA、C1、CX和β-糖苷酶酶活分別為：(11.90±0.45) U/mL、(12.42±1.07) U/mL、(30.34±1.02) U/mL和(29.27±0.43) U/mL，結(jié)果表明，纖維素酶可由菌株CPA-3-4產(chǎn)生，且擁有降解纖維素的作用，與剛果紅染色鑒定結(jié)果是一致的.且與PEI-PEI LI[9]等人創(chuàng)建的微生物體系A(chǔ)DS-3纖維素酶酶活最高可達(dá)0.15 U/mL相比，由菌株CPA-3-4產(chǎn)生的纖維素酶活是較高的.

2.3 菌種鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株CPA-3-4形態(tài)觀察結(jié)果

菌株CPA-3-4形態(tài)觀察結(jié)果如圖3、4所示.

圖3 單菌落形態(tài)圖

圖3所示為菌株CPA-3-4在ISP3培養(yǎng)基的生長(zhǎng)形態(tài)，可以看出CPA-3-4產(chǎn)生白色孢子及乳白色基內(nèi).圖4鏡檢圖可明顯看出CPA-3-4菌絲形態(tài)，說明CPA-3-4具有典型的放線菌特征.

圖4 番紅染色鏡檢圖

2.3.2 分子鑒定結(jié)果

菌株CPA-3-4繪出的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖5所示.

圖5 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)鑒定CPA-3-4的16S rRNA序列共1 518 bp，圖5所示，菌株CPA-3-4與菌株StreptomycesrishiriensisNBRC 13407T的16S rRNA序列同源性最高可達(dá)99.52%，二者形成一個(gè)單獨(dú)且穩(wěn)定的分支，鏈霉菌屬與菌株CPA-3-4同源性較高，可確定菌株CPA-3-4屬于鏈霉菌屬.

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.1 發(fā)酵天數(shù)

發(fā)酵天數(shù)對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響如圖6所示.

圖6 發(fā)酵天數(shù)對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響

如圖6所示可知如下結(jié)論，發(fā)酵天數(shù)的增加，Y值逐漸增大，在培養(yǎng)第7天處達(dá)到最高值為17.835%，7 d后Y值下降.這可能是由于隨著天數(shù)的延長(zhǎng)，菌株CPA-3-4繁殖數(shù)量增加，發(fā)酵作用增強(qiáng)，降解作用也隨之增強(qiáng)，7 d后CPA-3-4產(chǎn)酶活力下降，或經(jīng)代謝后體系內(nèi)產(chǎn)生大量二氧化碳，造成氧氣量不足，菌種死亡率上升，致使玉米秸稈降解率下降.

2.4.2 培養(yǎng)基初始pH

培養(yǎng)基初始pH對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響如圖7所示.

圖7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響

圖7所示，隨著培養(yǎng)基初始pH逐漸增大，Y值表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在pH=7時(shí)降解率最高，為18.895%.這可能是因?yàn)榫闏PA-3-4在pH范圍4～8都可生長(zhǎng)，但pH 7是其最適生長(zhǎng)pH，在此pH條件下CPA-3-4代謝作用最強(qiáng)，因此玉米秸稈降解率也最大.

2.4.3 發(fā)酵轉(zhuǎn)速

發(fā)酵轉(zhuǎn)速對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響如圖8所示.

圖8所示，隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增加Y值呈現(xiàn)增大先上升后下降的趨勢(shì)，且在轉(zhuǎn)數(shù)處于180 r/min處時(shí)達(dá)到最大值20.565%.可能是由于隨著轉(zhuǎn)速的不斷增大，降解體系內(nèi)的溶氧量也會(huì)隨之增大[16]，降解效率變高是因?yàn)榫闏PA-3-4的代謝與發(fā)酵作用增強(qiáng)，然而，當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)超過180 r/min時(shí)，由于轉(zhuǎn)速過高致使菌體破裂死亡，致使Y值下降.

圖8 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響

2.4.4 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響如圖9所示.

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響

圖9所示，玉米秸稈降解率隨著發(fā)酵溫度不斷上升，先升高后下降，當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)降解率最高，為21.915%.這可能是由于溫度影響著降解過程中的pH變化[17]，且28 ℃為菌株CPA-3-4的最適生長(zhǎng)溫度，CPA-3-4在此溫度下培養(yǎng)可出現(xiàn)生長(zhǎng)繁殖旺盛的狀態(tài)，降解作用也達(dá)到高峰.

2.4.5 接菌量

接菌量對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響如圖10所示.

圖10所示，當(dāng)接菌量4%時(shí)Y值最高，為22.814%.接菌量在1%～4%范圍時(shí)，Y值顯著增高，這是由于隨著CPA-3-4菌量的增加，其代謝作用增強(qiáng)即其所產(chǎn)的纖維素酶量增加，當(dāng)接菌量超出4%后，由于菌濃度過高，菌種死亡造成降解率下降的原因可能是體系內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及溶氧量不足以支撐菌種生長(zhǎng).

圖10 接菌量對(duì)玉米秸稈降解率(Y)的影響

2.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可選取作為響應(yīng)面的影響因素有四種分別為：培養(yǎng)基初始pH(A)、發(fā)酵轉(zhuǎn)速(B)、發(fā)酵溫度(C)、接菌量(D)，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面的因素水平表，如表2所示.利用軟件Design-Expertversion 8.0.6，對(duì)表3中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸擬合，求得降解率與各因素的回歸方程，公式如下.

表2 響應(yīng)曲面因素水平表

表3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

降解率(Y)=28.15 + 0.51A + 1.44B + 0.44C + 0.73D - 0.29AB - 0.42AC + 0.14AD - 0.062BC + 0.46BD + 1.18CD - 3.74A2- 3.64B2- 2.28C2- 5.37D2

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，如表4所示.

由以上結(jié)果分析可知：此響應(yīng)模型的P<0.000 1，表明該回歸方程極其顯著，且與各個(gè)單因素之間的關(guān)系也是極其顯著的；而其失擬項(xiàng)結(jié)果為P=0.347 2>0.05，說明其差異性是不顯著的.由此可表明該模型擬合度較好，可用于優(yōu)化玉米秸稈降解實(shí)驗(yàn).得到的等高線圖與3D效果圖如圖11～13所示.

圖12 發(fā)酵轉(zhuǎn)速、接菌量對(duì)玉米秸稈降解率影響的等高線及響應(yīng)曲面

圖13 發(fā)酵溫度和接菌量對(duì)玉米秸稈降解率影響等高線及響應(yīng)曲面

綜合以上單因素和響應(yīng)曲面分析結(jié)果，使用Design-Expertversion 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)值的最優(yōu)條件選擇，得出最優(yōu)的工藝參數(shù)是：培養(yǎng)基初始pH 7.06，發(fā)酵轉(zhuǎn)速184 r/min，發(fā)酵溫度28.22℃，接菌量4.09%，在此工藝參數(shù)下預(yù)測(cè)的Y值為28.363 8%.考慮實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，確定4個(gè)因素的值為：培養(yǎng)基初始pH 7，發(fā)酵轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵溫度28 ℃，接菌量4%.在此條件下重復(fù)試驗(yàn)得到Y(jié)值為28.36%，與預(yù)測(cè)Y值相差不大.

2.6 玉米秸稈中成分測(cè)定結(jié)果

玉米秸稈降解前后主要成分測(cè)定結(jié)果見表5.

表5 玉米秸稈降解前后成分測(cè)定結(jié)果

由表5內(nèi)數(shù)據(jù)可以看出，秸稈經(jīng)菌株CPA-3-4降解后，其內(nèi)部的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量均有所下降，說明CPA-3-4對(duì)纖維素、半纖維素、木質(zhì)素均具備一定的降解效果，降解率分別為39.99%、22.25%、26.87%.

2.7 玉米秸稈掃描電鏡觀察結(jié)果

采用掃描電鏡(SEM)觀察玉米秸稈降解前后的表面組織結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見圖14、15.

圖14 降解前玉米秸稈表面組織結(jié)構(gòu)

圖15 降解后玉米秸稈表面組織結(jié)構(gòu)

圖14、15可知，降解前玉米秸稈表面組織的結(jié)構(gòu)排布緊密，呈長(zhǎng)條狀.接種菌株CPA-3-4降解后，玉米秸稈表面組織結(jié)構(gòu)有明顯裂解、塌陷現(xiàn)象，且出現(xiàn)了許多孔洞.說明菌株CPA-3-4具有良好的降解纖維素的效果.

2.8 玉米秸稈紅外光譜分析結(jié)果

玉米秸稈降解前后紅外光譜結(jié)果見圖16.

圖16 玉米秸稈降解前后紅外光譜分析

3 討 論

秸稈是農(nóng)業(yè)廢棄物之一，也是世界公認(rèn)的重要的生物質(zhì)資源之一，近年來微生物法降解秸稈已成為許多研究人員的側(cè)重方向[20].馮紅梅等[21]從高溫期堆肥樣品中篩出6株可高效降解纖維素的菌株，并將其復(fù)配成混合菌群，并對(duì)該菌群優(yōu)化最佳產(chǎn)酶條件，最優(yōu)條件下該菌群最高酶活可達(dá)135.9 U/mL.GUOXIANG Z等[22]通過連續(xù)富集培養(yǎng)，獲得了一種木質(zhì)纖維素降解微生物群落LTF-27.該菌落可有效的分解稻草中的木質(zhì)纖維素材料.XIUJIE G等[23]從低溫秸稈腐殖質(zhì)中篩選出3株高效降解菌，構(gòu)建原位降解菌系，單因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化該菌系最優(yōu)降解秸稈的條件.最優(yōu)條件下，玉米秸稈平均失重率為60.55%.秸稈中存在許多的的氮、磷、鉀等農(nóng)作物必須的微量元素，降解還田后不僅可增加土壤的養(yǎng)分，還可以增強(qiáng)土壤中轉(zhuǎn)化酶活力，使有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷，更利于農(nóng)作物吸收[24].本實(shí)驗(yàn)篩選分離得到的菌株CPA-3-4纖維素的降解能力雖不及復(fù)合菌系，但也可為秸稈還田等提供理論參考，也可將其馴化提高其產(chǎn)纖維素酶的能力或與其他菌株復(fù)配成復(fù)合菌系用于秸稈的降解.

4 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)篩選分離得到一株能夠降解纖維素的菌株，命名為CPA-3-4，經(jīng)16S rRNA分子鑒定確定其為鏈霉菌屬.經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具備較好降解纖維素的效果.在最優(yōu)條件下接種CPA-3-4進(jìn)行玉米秸稈的降解，降解率為28.36%.本文探究了菌株CPA-3-4降解纖維素的能力，以期單一或復(fù)配發(fā)酵秸稈后直接還田或與礦物肥料結(jié)合用作復(fù)合肥料，用以減小土壤破壞以及增強(qiáng)土壤肥力.