水稻全基因組磷脂酶家族蛋白篩選及其生物信息學(xué)分析

曹夢(mèng)雨，桑世飛，王亞男，周靜，王君怡，張文玲，姬生棟

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.河南省種子管理站，鄭州450046)

磷脂酶是植物磷脂信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的重要成分，目前植物中已經(jīng)鑒定出4種形式的磷脂酶[1]，參與調(diào)控植物體內(nèi)的多種生理過(guò)程，并對(duì)各種生物與非生物脅迫作出相應(yīng)的響應(yīng).磷脂酶家族基因(OsPLX)可從多個(gè)途徑參與非生物脅迫信號(hào)和發(fā)育事件[2]，如大豆磷脂酶C基因GmPLC10具有耐干旱的作用，能幫助植物有效抵御干旱脅迫[3]，擬南芥磷脂酶C2參與擬南芥的細(xì)胞凋亡及丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)病原體的攻擊[4]，擬南芥磷脂酶D1和磷脂酶D2則與植物響應(yīng)鹽堿脅迫相關(guān)[5].在擬南芥磷脂酶基因家族的研究中，諸多研究都提出了磷脂酶參與許多信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控細(xì)胞的過(guò)程，如應(yīng)激信號(hào)和耐受性[6]，顯然作為磷脂酶家族相關(guān)基因，在水稻中很可能也參與這些代謝調(diào)控.

水稻磷脂酶A家族的OspPLAIIβ基因編碼花粉特異性磷脂酶，其突變體具備誘導(dǎo)水稻形成單倍體的功能[7].過(guò)表達(dá)OspPLAIIIα基因會(huì)導(dǎo)致水稻表現(xiàn)出半矮化，同時(shí)引起莖、根、葉、種子以及穗的長(zhǎng)度降低，機(jī)械強(qiáng)度下降，還會(huì)導(dǎo)致組織中的纖維素含量降低，影響到了植株發(fā)育，而OspPLAIIIα基因敲除系卻具有更長(zhǎng)的穗和籽粒[8].OspPLAIIIδ是直立型密穗基因，與野生型相比，OspPLAIIIδ基因突變系的穗從生長(zhǎng)到成熟一直能夠保持直立，穗粒形狀大小及穗長(zhǎng)都發(fā)生了變化[9].磷脂酶C家族中的OsNPC1基因具有組成型表達(dá)的特征，與野生型相比，水稻中過(guò)表達(dá)OsNPC1基因會(huì)使植株表現(xiàn)出莖節(jié)較脆，莖節(jié)中硅含量降低，但穎殼中硅含量增加，穗莖尖較脆，落粒性增加的特征[10].磷脂酶D亞家族的OsPLDα4和OsPLDα5基因均受二化螟、機(jī)械損傷和JA處理的誘導(dǎo)表達(dá)[11].抑制OsPLDβ1表達(dá)的植株在發(fā)育后期表現(xiàn)出類(lèi)似超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡以及植物抗毒素的積累，在沒(méi)有病原菌侵染的情況下可自發(fā)激活防御反應(yīng)，并且OsPLDβ1通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)防御反應(yīng)來(lái)參與水稻的抗病性[12].OsPLDα基因在植物響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)H+-ATPase的活性和表達(dá)來(lái)影響水稻對(duì)鹽的耐受性[13].目前磷脂酶A亞家族更傾向參與到植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而磷脂酶D亞家族在逆境脅迫方面扮演了重要角色.然而擬南芥磷脂酶A IIA則參與到生物與非生物脅迫[14]，表明磷脂酶基因家族基因的功能在進(jìn)化中可能出現(xiàn)了一定分化.以往關(guān)于磷脂酶家族基因的研究工作多集中在模式植物擬南芥和其他一些雙子葉植物中，對(duì)單子葉植物中磷脂酶基因的報(bào)道較少，借助同源比對(duì)方法對(duì)水稻磷脂酶家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入研究水稻磷脂酶家族基因功能提供參考.

1 材料和方法

1.1 水稻磷脂酶家族基因鑒定及理化性質(zhì)分析

從RiceData數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載磷脂酶家族基因的編碼區(qū)序列.在RGAP水稻數(shù)據(jù)庫(kù)將已下載的磷脂酶家族核苷酸序列采用同源搜索的方法，BLAST水稻蛋白質(zhì)模型數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為相似度大于40%，覆蓋度大于40%，搜索的E值設(shè)為10-5，獲得水稻磷脂酶家族基因及同源基因.利用ExPASy-ProtParam tool獲得磷脂酶家族基因的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸數(shù)目.通過(guò)TMHMM在線(xiàn)分析蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)[15].利用ProtComp v.9.0軟件對(duì)磷脂酶家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[16].

1.2 水稻磷脂酶家族基因生物信息學(xué)分析

基因進(jìn)化及基序分析采用MEGA-X軟件中的Clustal W對(duì)磷脂酶家族的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，采用極大似然法將比對(duì)后的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000[17].通過(guò)MEME在線(xiàn)分析磷脂酶家族蛋白質(zhì)序列的基序種類(lèi)與特征[18].通過(guò)Ensembl Plants 網(wǎng)站獲得水稻12條染色體的長(zhǎng)度數(shù)據(jù)，在RiceData網(wǎng)站搜索獲得磷脂酶家族基因的起始位點(diǎn)，最后使用MapChart 2.32繪制磷脂酶家族基因在染色體上的定位圖[19].利用Rice eFP Browser網(wǎng)站(http://bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi)公布的水稻(亞種.indica var IR64)材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，調(diào)取穗和種子發(fā)育過(guò)程中不同階段的磷脂酶家族基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的處理，采用Heml軟件得到磷脂酶家族基因的組織表達(dá)譜熱圖[20].

2 結(jié)果和分析

2.1 OsPLX家族基因全基因組篩選與理化性質(zhì)分析

從RiceData網(wǎng)站搜索并下載磷脂酶家族的基因登錄號(hào)、基因名稱(chēng)以及CDS序列，并根據(jù)水稻已知的OsPLX蛋白序列，在RGAP水稻數(shù)據(jù)庫(kù)檢索所有水稻中的直系同源基因，共計(jì)獲得了64個(gè)OsPLX基因家族成員(表1).理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)OsPLX家族基因長(zhǎng)度為402～3 801 bp，編碼氨基酸序列為133～1 266個(gè)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大約在14.09～134.36 kDa之間，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在4.977～12.12之間(表1).

表1 64個(gè)磷脂酶家族基因的理化信息

將上述初步篩選出的 64個(gè)蛋白序列進(jìn)一步用 ProtComp v9.0 軟件進(jìn)行分析，共預(yù)測(cè)到37個(gè)信號(hào)肽分泌至胞外，3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡膜，2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)到了葉綠體膜，1個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體膜，12個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，9個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜.通過(guò)TMHMM在線(xiàn)網(wǎng)站對(duì)磷脂酶家族蛋白的跨膜序列區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，水稻中已經(jīng)鑒定出的64個(gè)磷脂酶基因中只有8個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū). LOC_Os08g01310、LOC_Os06g49860、LOC_Os04g36710、LOC_Os03g50030、LOC_Os04g35100和LOC_Os04g59310等6個(gè)基因編碼的蛋白中各含有1個(gè)跨膜區(qū)；基因LOC_Os03g50030所編碼蛋白中的跨膜區(qū)較大；基因LOC_Os06g18930 編碼的蛋白中含有18個(gè)較小的跨膜區(qū)；基因LOC_Os01g67310所編碼蛋白含有3個(gè)跨膜區(qū).

利用MEME在線(xiàn)網(wǎng)站分析磷脂酶家族蛋白序列的基序種類(lèi)與特征，發(fā)現(xiàn)所有的蛋白質(zhì)都含有相同的3個(gè)保守基序：基序1為氨基酸序列IYIENQYF;基序2為氨基酸序列IYIENQYF;基序3為氨基酸序列AAWDVLYNFEQRWRKQ.且親緣關(guān)系越近的磷脂酶家族基因，其編碼的蛋白基序結(jié)構(gòu)相似度越高.

2.2 水稻磷脂酶家族基因染色體定位分析

利用MapChart 2.32對(duì)已鑒定的OsPLX家族基因進(jìn)行染色體定位，分析發(fā)現(xiàn)家族基因在染色體的分析呈現(xiàn)出明顯的不均勻分布，不同染色體上的該家族基因的數(shù)目差別很大，如10號(hào)染色體含有一個(gè)磷脂酶基因；2號(hào)染色體上有3個(gè)磷脂酶基因；4號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和12號(hào)染色體上有4個(gè)磷脂酶基因；9號(hào)和11號(hào)染色體上有5個(gè)磷脂酶基因；1號(hào)染色體上有6個(gè)磷脂酶基因； 3號(hào)染色體上有15個(gè)磷脂酶基因，各染色體上的磷脂酶家族基因表現(xiàn)出了明顯的不均衡性.

2.3 水稻磷脂酶家族基因OsPLX進(jìn)化分析

根據(jù)磷脂酶家族基因OsPLX編碼的蛋白質(zhì)序列，采用Mega X進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1).從圖1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，家族基因編碼蛋白質(zhì)被分為3個(gè)亞組(group),即亞組I(group1)、亞組II(group2)和亞組III(group3)，其中亞組I包含9個(gè)磷脂酶基因，包含了2個(gè)已經(jīng)鑒定功能的磷脂酶OsPLA2類(lèi)基因；亞組II包含25個(gè)磷脂酶基因，主要是OsPLA家族；亞組III包含29個(gè)磷脂酶基因，主要是OsPLC和OsPLD亞家族基因.

2.4 水稻磷脂酶家族組織特異性表達(dá)分析

對(duì)水稻中磷脂酶家族基因OsPLX在穗和種子發(fā)育過(guò)程中的全基因組分析、分類(lèi)、時(shí)空基因表達(dá)及光和非生物脅迫的調(diào)控等相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用Heml軟件繪制磷脂酶家族的組織表達(dá)譜熱圖.結(jié)果表明(圖2)，磷脂酶家族基因并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的組織特異性，然而從整體來(lái)看，大多數(shù)的磷脂酶家族基因在各個(gè)組織的表達(dá)量都比較低，其中LOC_Os01g07760(OsPLDα),LOC_Os03g59620(OspPLAIVβ),LOC_Os03g61130(OsNPC1),LOC_Os07g49330,LOC_Os12g37560在水稻的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都維持相對(duì)較高的表達(dá)量；還有部分基因表現(xiàn)出了比較強(qiáng)的組織偏好性，比如LOC_Os06g40180(OsPLDα5)在根以及葉子花序中表達(dá)量較高；LOC_Os09g28770(OspPLAIIη)則在種子中的表達(dá)量非常的高；LOC_Os12g36610(OspPLAIIγ)和LOC_Os03g43880(OspPLAIIIβ)都只在幼根中高表達(dá)；LOC_Os12g36530(OspPLAIIk)則在花序中集中高表達(dá).這些結(jié)果表明，磷脂酶家族基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中扮演了重要角色.

3 討 論

相對(duì)于NAC,WRKY,ARF,GH3等家族基因[21-23]，磷脂酶基因家族研究相對(duì)較少，越來(lái)越多的證據(jù)表明，植物細(xì)胞含有多種基于磷脂的信號(hào)通路，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育與脅迫響應(yīng)[24-25].在水稻磷脂酶A亞家族的研究中，SINGH等[2]通過(guò)對(duì)水稻全基因組鑒定，分析了磷脂酶A家族基因，發(fā)現(xiàn)水稻PLA家族基因在非生物脅迫信號(hào)傳遞和發(fā)育中可能具有重要作用.磷脂酶C亞家族的多個(gè)基因在干旱或者鹽脅迫條件下會(huì)得到誘導(dǎo)性表達(dá)[26]，研究表明在干旱條件下，植物會(huì)通過(guò)表達(dá)PLC基因來(lái)控制氣孔的開(kāi)閉[27].在擬南芥研究中磷脂酶D被認(rèn)為是抗性響應(yīng)基因，在水稻中通過(guò)對(duì)2個(gè)定位于葉綠體的基因OsPLDa4和OsPLDa5研究發(fā)現(xiàn)，在受到二化螟的攝食、機(jī)械傷害以及茉莉酸(JA)處理時(shí)會(huì)誘導(dǎo)基因上調(diào)表達(dá)[28].YAO等[7]發(fā)現(xiàn)在水稻中OspPLAIIβ(OsMTL)基因編碼的花粉特異性磷脂酶能誘導(dǎo)水稻形成單倍體 ，關(guān)于該家族基因生物學(xué)功能的研究相對(duì)較少，綜合當(dāng)前研究認(rèn)為磷脂酶家族基因在參與逆境脅迫、抗病方面扮演了重要角色，這一點(diǎn)基本達(dá)成共識(shí).但是家族基因是否會(huì)像OspPLAIIβ具有新的功能，是今后值得研究的問(wèn)題.

本研究中的不同磷脂酶亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，不同磷脂酶基因定位有所區(qū)別，說(shuō)明磷脂酶基因在進(jìn)化中出現(xiàn)了功能性分化.比如OspPLAIIβ基因能夠編碼花粉特異性磷脂酶，與玉米的ZmMATL基因同源，能誘導(dǎo)水稻形成單倍體[7].OsPLDβ1基因在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，抑制OsPLDβ1表達(dá)提高植株對(duì)水稻主要病原菌的抗性[12]，OsPLDα基因在植物響應(yīng)脅迫中發(fā)揮正調(diào)控作用[11].磷脂酶家族基因間呈現(xiàn)出比較明顯的功能分化，OsPLD和OsPLC家族基因表現(xiàn)出了抗逆功能，而OsPLA基因的克隆數(shù)量偏少，A亞家族基因是否如OspPLAIIβ一般具有單倍體誘導(dǎo)功能還有待進(jìn)一步的研究.本研究也發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)磷脂酶家族基因組織特異性非常弱，基因在根、葉、花序、種子中屬于低表達(dá)，僅少部分基因在特定組織或者發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)量，這些磷脂酶家族基因或許具備組織特異性功能.其中少數(shù)幾個(gè)在生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段高表達(dá)的基因，如LOC_Os01g07760(OsPLDα),LOC_Os03g59620(OspPLAIVβ),LOC_Os03g61130(OsNPC1),LOC_Os07g49330,LOC_Os12g37560在維持水稻生長(zhǎng)過(guò)程中可能具有重要作用.

綜合本研究結(jié)果，可對(duì)部分已經(jīng)克隆基因的同源基因功能以及組織特異性高表達(dá)基因的功能做出初步的推測(cè)，為進(jìn)一步分析研究水稻磷脂酶家族基因在水稻發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能提供參考.