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    羔羊睪丸細胞酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建及鑒定

    2022-04-14 12:49:12包濤濤鮮思美顧慶林
    關(guān)鍵詞:雙雜交文庫滴度

    楊 倩, 包濤濤,2, 鮮思美,3, 張 友, 梁 倩, 顧慶林

    (1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025;2.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州 黔東南 556000; 3.貴州省動物疫病研究室,貴州 貴陽 550025)

    羔羊睪丸(lamb testicular, LT)細胞適用于多種病毒的增殖,如山羊痘病毒(goatpoxvirus, GTPV)、綿羊痘病毒(sheeppoxvirus, SPPV)以及羊口瘡病毒(orf virus, OrfV)等[1-3].其中,OrfV屬于痘病毒科副痘病毒屬成員,其分布于全球范圍內(nèi),在許多國家流行[4-6].OrfV主要侵害宿主的皮膚和黏膜,造成嚴重的持續(xù)性感染和繼發(fā)性感染,對泌乳母羊和新生羔羊危害極大,會給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[7-8].OrfV在長期進化過程中,形成了一套獨特的免疫調(diào)節(jié)策略,以此庇護種群復(fù)制和免疫逃逸[9].早在1959年,Plowright et al[10]就利用LT細胞成功地對OrfV進行了分離.但是到目前為止,OrfV與宿主互作的具體機制仍未明確.

    cDNA文庫是研究基因組學(xué)的基本工具之一,它是以組織或細胞的mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA(ds cDNA)后,與適當?shù)妮d體連接并轉(zhuǎn)化至受體菌,包含細胞全部mRNA信息的cDNA克隆子群即為該組織或細胞的cDNA文庫[11].目前,常用的載體為噬菌體或質(zhì)粒載體.對于真核細胞來說,cDNA文庫是已經(jīng)去除了內(nèi)含子的cDNA,比基因組DNA文庫小很多,因此,易從中篩選和克隆到所需要的目的基因.cDNA文庫主要包括經(jīng)典cDNA文庫、標準cDNA文庫、酵母雙雜交cDNA文庫、差示cDNA文庫、限制性cDNA文庫等.近年來,隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,構(gòu)建cDNA文庫的方法在逐漸改進,主要有Cap-trapper、Cap-jumping、Oligo-capping及SMART法等[12].其中,SMART法較其他方法便捷,其無需分離、純化mRNA,且得到的cDNA為全長cDNA.

    基于此,本研究采用SMART技術(shù)合成ds cDNA,通過同源重組的方法將cDNA克隆至編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)的pGADT7-Rec載體,以此構(gòu)建LT細胞的酵母雙雜交cDNA文庫,旨在為進一步篩選OrfV與LT細胞的互作蛋白及其互作機制的研究提供生物材料.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    羔羊睪丸組織由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所惠贈;RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號:C11875500BT)、胰酶(貨號:25200056)均購自Gibco公司,胎牛血清(貨號:11011-8611)購自四季青公司,Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System試劑盒(貨號:630490.內(nèi)含cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、CHROMA SPINT TE-400純化柱、pGADT7-Rec載體、Y187菌株、YPDA培養(yǎng)基、SD/-Leu缺陷培養(yǎng)基以及酵母轉(zhuǎn)化試劑盒YeastmakerTMYeast Transformation System 2)、Advantage 2 PCR Kit(貨號:639201)均購自Clontech公司.

    1.2 LT細胞分離培養(yǎng)

    參考文獻[3]進行LT細胞的分離培養(yǎng).將新采集的睪丸用滅菌的PBS反復(fù)洗滌3次后,放入盛有75%(體積分數(shù))酒精的燒杯內(nèi),數(shù)秒后取出并放入無菌平皿中;用滅菌的剪刀剪開睪丸的被膜、白膜,鈍性分離睪丸組織,盡可能地收集睪丸的實質(zhì),滅菌PBS反復(fù)洗滌組織,直到?jīng)]有血絲為止;將組織剪為約5 mm3的碎塊后,加入約4倍體積的胰酶,倒入離心管內(nèi),放入37 ℃水浴鍋中30 min,每隔10 min振蕩一次,4 000 r·min-1離心5 min,使組織和液體分離;棄上清液,把組織倒入50 mL的小燒杯中,取10 mL配好的含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液加入離心管中,用移液管反復(fù)吹打后,倒入小燒杯中,再反復(fù)吹打,使其細胞分散;將反復(fù)吹打的組織和液體經(jīng)滅菌的8層紗布過濾,濾液加入剩余的培養(yǎng)液,充分混勻;分裝,標記,放入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞穩(wěn)定培養(yǎng)2代后用于后續(xù)細胞總RNA的提取.

    1.3 LT細胞總RNA提取

    待第2代LT細胞鋪滿細胞瓶時,棄去培養(yǎng)液,PBS洗滌3次后收集細胞,采用Trizol法[13]提取細胞總RNA并測定其濃度(Thermo Fisher Scientific, NanoDrop One),另取RNA樣本經(jīng)1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測.

    1.4 cDNA第一鏈合成

    按照文庫構(gòu)建試劑盒說明書,取1 μL總RNA進行cDNA第一鏈合成.

    1.5 ds cDNA合成及純化

    利用LD-PCR將cDNA第一鏈合成ds cDNA.反應(yīng)總體積為100 μL:cDNA第一鏈2 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 2 μL,50×dNTP Mix 2 μL,上、下游引物各2 μL,10×Advantage 2 PCR buffer 10 μL,10×Melting Solution 10 μL,dd H2O 70 μL.反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,68 ℃ 6 min(每個循環(huán)增加5 s),總共24個循環(huán);68 ℃ 5 min.反應(yīng)完成后取7 μL產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測.

    根據(jù)試劑盒說明書,利用CHROMA SPINT TE-400純化柱對LD-PCR擴增得到的ds cDNA進行純化,取2 μL純化后的ds cDNA經(jīng)1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測.

    1.6 文庫構(gòu)建

    用PEG/LiAc法[14]制備Y187酵母感受態(tài)細胞.按照文庫構(gòu)建試劑盒說明書,利用同源重組方法,將18 μL ds cDNA、6 μL pGADT7-Rec(0.5 μg·μL-1)、20 μL Yeastmaker Carrier DNA(已變性)共轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母感受態(tài)細胞中,最后用15 mL生理鹽水重懸細胞.將轉(zhuǎn)化后的菌液全部涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基上,30 ℃倒置培養(yǎng)3~5 d至菌落出現(xiàn).當SD/-Leu培養(yǎng)基上鋪滿菌落時,4 ℃冷卻培養(yǎng)板4 h,每個平板中加入5 mL YPDA凍存液(含25%甘油的YPDA液體培養(yǎng)基),用無菌玻璃棒刮下酵母菌落,收集的液體保存于-80 ℃.

    1.7 文庫質(zhì)量評價

    取10 μL文庫構(gòu)建得到的菌液,按102、104、106稀釋,分別取50 μL涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基上,每個稀釋度3個重復(fù),30 ℃倒置培養(yǎng)3~5 d,對生長的菌落進行計數(shù)以計算文庫滴度和文庫容量.文庫滴度/(CFU·mL-1)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布體積;文庫總?cè)萘?CFU=文庫滴度(CFU·mL-1)×cDNA文庫總體積(mL).從SD/-Leu固體培養(yǎng)基上長出的單菌落中隨機挑取34個單菌落,用10 μL無菌去離子水重懸菌落,以該混懸液為模板,利用文庫載體pGADT7-Rec通用引物(上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′,下游引物5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′)對其進行PCR擴增,以檢測文庫重組率及多態(tài)性.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LT細胞的形態(tài)

    圖1 分離的LT細胞(100×)Fig.1 LT cells isolated (100×)

    在倒置顯微鏡(CNOPTEC, BDS400)下可觀察到分離的LT細胞貼壁后呈長梭形(圖1).

    2.2 LT細胞總RNA的提取

    經(jīng)Trizol法提取的總RNA濃度為363.10 ng·μL-1,其D260 nm/D280 nm=1.90,D230 nm/D260 nm=1.88;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見3個條帶,28S rRNA和18S rRNA條帶清晰,亮度比接近2∶1,5S rRNA條帶亮度較弱(圖2).這表明提取的RNA樣本純度較高,具有良好的完整性,可用于后續(xù)cDNA文庫的構(gòu)建.

    2.3 ds cDNA的合成及純化

    經(jīng)LD-PCR擴增后的ds cDNA呈現(xiàn)彌散狀分布(圖3);經(jīng)CHROMA SPINT TE-400純化柱純化后,ds cDNA中小于250 bp的片段被去除,多處于250~2 000 bp(圖4).這表明純化后的ds cDNA豐度較高,符合建庫要求.

    M.DL2 000 DNA marker; 1.總RNA樣品.圖2 LT細胞總RNA電泳分析Fig.2 Electrophoretic analysis of total RNA in LT cells

    M.DL5 000 DNA marker;1.純化后的cDNA.圖4 純化后cDNA樣本電泳分析Fig.4 Electrophoretic analysis of cDNA samples after purification

    2.4 文庫質(zhì)量

    2.4.1 文庫滴度及總?cè)萘?102、104稀釋度平板上單個菌落不可計數(shù),106稀釋度平板上3個重復(fù)的單個菌落數(shù)分別為12、12和11個.由此計算出文庫滴度為2.33×108CFU·mL-1,文庫總?cè)萘繛?.5×109CFU.這表明文庫中克隆子數(shù)量滿足建庫要求,符合其評價標準[15].

    2.4.2 文庫重組率及多態(tài)性 從SD/-Leu固體培養(yǎng)基上隨機選取34個單菌落進行PCR檢測,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,PCR擴增陽性率達100%,文庫插入片段大小為250~2 000 bp,平均大小約為1 000 bp(圖5).34個單菌落均擴增出特異性條帶,由此計算出文庫重組率達100%,且具有較好的多態(tài)性.這表明本研究構(gòu)建的cDNA文庫合格,可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗.

    3 討論

    Fields et al[16]發(fā)明了酵母雙雜交技術(shù),此后該技術(shù)被不斷改進與完善,已成為研究蛋白間相互作用的重要方法之一[17].酵母雙雜交技術(shù)巧妙地把復(fù)雜的蛋白互作研究轉(zhuǎn)換成簡易的核酸研究,并能進行大規(guī)模的蛋白篩選[18-19];同時,該技術(shù)可捕捉到微弱、瞬時的蛋白互作,不需要進行蛋白質(zhì)純化等一系列繁瑣的操作,避免了如蛋白變性等引起的試驗誤差,能更好地呈現(xiàn)細胞內(nèi)蛋白互作的真實情況[20].

    M.DL5 000 DNA marker;1~34.隨機挑取的單菌落.圖5 cDNA文庫菌落PCR檢測Fig.5 PCR detection of cDNA library colonies

    OrfV感染引起的疾病降低了養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟效益,并給世界公共衛(wèi)生安全帶來巨大隱患.已有多位學(xué)者構(gòu)建了酵母雙雜交cDNA文庫,并利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與OrfV互作的宿主細胞蛋白:Chen et al[21]通過構(gòu)建羊鼻甲骨細胞(primary ovine fetal turbinate cells, OFTu)cDNA文庫,利用酵母雙雜交技術(shù)成功篩選出與OrfV 002蛋白互作的宿主蛋白S100A4,并發(fā)現(xiàn)OrfV 002與S100A4相互作用可抑制NF-κB信號通路激活;Long et al[22]也通過構(gòu)建OFTu酵母雙雜交cDNA文庫,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出11個與OrfV 024互作的宿主細胞蛋白;Tian et al[23]通過構(gòu)建綿羊睪丸細胞(sheep testicular cells, STCs)酵母雙雜交cDNA文庫,成功篩選出5個能與OrfV 125蛋白互作的宿主細胞蛋白,其中,BIRC5能抑制細胞凋亡、促進細胞轉(zhuǎn)化、參與有絲分裂.研究表明,OrfV接種于LT細胞并傳至17~36代后,活力仍達97%以上[3].鑒于OrfV在LT細胞上穩(wěn)定的增殖特性,本研究選擇構(gòu)建LT細胞酵母雙雜交cDNA文庫.

    cDNA文庫質(zhì)量的評估通常需要借助3個指標,分別為文庫容量、文庫重組率以及插入片段大小.其中,文庫容量反映了cDNA文庫的覆蓋度,理論上一個覆蓋度完整的cDNA文庫容量至少為1×106CFU[15].本研究構(gòu)建的cDNA文庫滴度為2.33×108CFU·mL-1,文庫總?cè)萘繛?.5×109CFU,符合理論要求.重組率和插入片段大小反映cDNA序列的完整性,SMART法要求重組率大于85%,且插入片段的大小應(yīng)在200 bp以上[12,24].經(jīng)PCR檢測,本研究構(gòu)建的cDNA文庫重組率達100%,且多態(tài)性良好,插入片段大小為250~2 000 bp,符合SMART法的要求.

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