雷帕霉素靶蛋白/自噬信號通路在結(jié)核性氣管支氣管狹窄中的作用機制研究

周磊 羅莉 盧志斌 丁衍 肖陽寶

氣管支氣管結(jié)核(tracheobronchial tuberculosis,TBTB)是國內(nèi)良性氣管支氣管狹窄的首要病因，管腔疤痕組織形成也是TBTB介入治療后狹窄回縮的主要原因[1]。TBTB氣道內(nèi)病灶處的成纖維細胞過度增殖、肉芽組織增生、炎癥反應(yīng)增強、膠原纖維合成增多導(dǎo)致管腔反復(fù)瘢痕狹窄，甚至瘢痕閉塞，影響患者療效及預(yù)后[2-5]。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是細胞生長和增殖的重要調(diào)節(jié)因子[6]，在被激活的情況下，可促進細胞生長分裂及細胞外基質(zhì)(如膠原蛋白)的分泌。自噬是細胞自我保護的一種機制，在氧化應(yīng)激、DNA受損、各種理化因素的影響下自噬活性增強[7]，mTOR可通過抑制自噬的活性發(fā)揮調(diào)控作用[8]。有研究顯示，mTOR/自噬信號通路在結(jié)核分枝桿菌感染、纖維化病理生理過程中發(fā)揮作用，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染后，mTOR活性增強，自噬活性被抑制；當(dāng)mTOR表達抑制，自噬活力恢復(fù)，可增強巨噬細胞的殺菌能力[9]。抑制mTOR/自噬信號通路可減少炎癥及生長因子如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等表達[10-11]，減輕炎癥反應(yīng)及瘢痕增生。本研究旨在探討mTOR/自噬信號通路在結(jié)核性氣管支氣管狹窄中的表達趨勢及致纖維化作用，以便深入了解結(jié)核性氣管支氣管狹窄的發(fā)病機制，為預(yù)防和治療該疾病提供新思路。

對象和方法

一、 研究對象

收集湖南省胸科醫(yī)院2020年6月至2021年6月經(jīng)外科評估需要手術(shù)切除病灶的肺曲菌患者，共10例，作為正常對照組，包括男6例，女4例；年齡20～58歲，平均(39.7±11.1)歲。收集同期結(jié)核性氣管支氣管狹窄患者27例；男10例，女17例；年齡23～70歲，平均(45.5±12.0)歲；包括13例結(jié)核性增生患者(結(jié)核性增生組)，14例結(jié)核性瘢痕患者(結(jié)核性瘢痕組)。本研究通過湖南省胸科醫(yī)院倫理委員會批準 (編號：LS2021051805)。

二、納入和排除標準

1.結(jié)核性增生組及結(jié)核性瘢痕組的入選標準：根據(jù)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷標準》確診活動性肺結(jié)核患者；經(jīng)支氣管鏡檢查和(或)病理學(xué)、細菌學(xué)檢查確診為氣管支氣管結(jié)核初治患者。結(jié)核性增生組在抗結(jié)核藥物治療1周后行支氣管鏡介入治療，活檢鉗取病變部位肉芽組織；結(jié)核性瘢痕組在抗結(jié)核藥物治療過程中患者有氣促癥狀，需要介入治療的瘢痕狹窄型氣管支氣管結(jié)核，在介入治療過程中活檢鉗取瘢痕組織[4]。

2.正常對照組排除標準：排除合并結(jié)核病及腫瘤、糖尿病、風(fēng)濕免疫等其他疾病。

3.結(jié)核性增生組及結(jié)核性瘢痕組排除標準：排除合并耐藥結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒感染及糖尿病的患者。

三、研究方法

1. 免疫組化：各組氣道肉芽、瘢痕組織等予以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后，通過免疫組化檢測mTOR、自噬相關(guān)蛋白3(LC-3)、TGF-β1、膠原蛋白1(COL-1)表達情況，使用光學(xué)顯微鏡拍片后，使用 ImagePro Plus 6.0圖像處理軟件對免疫組化圖片進行分析。

2. 蛋白質(zhì)印跡法檢測mTOR、LC3蛋白表達水平：提取組織蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)定量BCA法蛋白定量后上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，分別切膠mTOR(250-289kD)，LC3(14-18kD)轉(zhuǎn)膜并封閉，將聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)分別與mTOR(1∶5000)、LC3(1∶1000)、β-肌動蛋白(β-actin)(1∶5000)一抗4 ℃孵育過夜，使用1%吐溫(TBST)緩沖液洗滌3次后，將膜放入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠或山羊抗兔的二抗中，室溫孵育1 h，使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色曝光，并使用Image J 1.5圖像處理軟件分析目的蛋白和β-actin的平均灰度值，以相關(guān)目的蛋白與β-actin灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達量。

3. 運用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測TGF-β1、COL-1 mRNA相對表達量[1]：Trizol試劑提取組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，實時熒光定量PCR檢測TGF-β1、COL-1 mRNA的表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

4. 主要材料：PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗mTOR、兔抗LC3均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗COL-1、兔抗TGF-β1均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；HRP標記的山羊抗鼠、山羊抗兔的二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用“均數(shù)±標準差”表示，對研究數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布時，多組比較采用完全隨機設(shè)計方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組mTOR、LC3、TGF-β1、COL-1免疫組化檢測蛋白表達情況

mTOR、TGF-β1、COL-1蛋白陽性表達量在結(jié)核性增生組中均高于結(jié)核性瘢痕組，在結(jié)核性瘢痕組中均高于正常對照組；LC3表達正好相反，正常對照組高于結(jié)核性瘢痕組，結(jié)核性瘢痕組高于結(jié)核性增生組。見表2。

表2 各組氣管支氣管組織免疫組化結(jié)果

二、各組mTOR、LC3蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達水平

mTOR蛋白表達量在結(jié)核性增生組高于結(jié)核性瘢痕組，結(jié)核性瘢痕組高于正常對照組；LC3蛋白表達量正好相反，正常對照組高于結(jié)核性瘢痕組，結(jié)核性瘢痕組高于結(jié)核性增生組。見圖1、表3。

圖1 各組mTOR、LC3在蛋白質(zhì)印跡法中的蛋白相對表達量

表3 各組氣管支氣管組織中相關(guān)蛋白相對表達量

三、各組TGF-β1、COL-1 的RT-qPCR檢測mRNA的表達水平

TGF-β1、COL-1的mRNA表達量在結(jié)核性增生組中均高于結(jié)核性瘢痕組，結(jié)核性瘢痕組均高于正常對照組(P值均<0.05)。見表4。

表4 各組氣管支氣管組織中TGF-β1、COL-1 mRNA

討 論

結(jié)核性氣管支氣管狹窄是良性氣道狹窄發(fā)病最常見的病因[1-2，12]，除此之外，氣管插管、氣管切開等也可引發(fā)。不同于氣管插管、氣管切開等主要以機械損傷因素所致，結(jié)核性氣管支氣管狹窄發(fā)病是MTB對氣管支氣管壁持續(xù)破壞與機體組織修復(fù)導(dǎo)致的病理過程[13-15]，發(fā)病機制較為復(fù)雜，與炎癥及纖維化相關(guān)[4-5,16]， MTB侵蝕氣道黏膜、黏膜下層等，破壞氣道正常的組織結(jié)構(gòu)，引起炎癥反應(yīng)可以促進傷口分泌生長因子及炎癥介質(zhì)引起病變部位肉芽增殖及瘢痕增生，導(dǎo)致結(jié)核性瘢痕氣道狹窄。

機體感染MTB后，MTB可通過促進機體巨噬細胞mTOR高表達，抑制自噬活性，進而減弱巨噬細胞滅菌能力[15-16]。而自噬增強可以促進巨噬細胞的滅菌作用。Kim等[17]研究顯示，異煙肼(INH)或者吡嗪酰胺(PZA)可激活被MTB感染巨噬細胞的自噬。如在肺纖維化、腎纖維化疾病發(fā)病過程中[18-19]，成纖維細胞mTOR高表達，自噬活性降低，進而促進成纖維細胞的增殖分化與細胞外基質(zhì)的形成，導(dǎo)致疾病進展，而mTOR受體抑制劑雷帕霉素可以抑制成纖維細胞mTOR蛋白的高表達，恢復(fù)自噬的活性，減緩相關(guān)臟器的纖維化[20]。

本研究顯示，mTOR的表達在結(jié)核性增生組中表達最高，在結(jié)核性瘢痕組中次之，在正常對照組中表達最低，而自噬相關(guān)指標LC3的表達正好相反，在正常對照組中表達高于結(jié)核性瘢痕組，在結(jié)核性瘢痕組中表達高于結(jié)核性增生組，這與Rubinsztein等[21]和Singh和Subbian[9]研究結(jié)果類似?？梢?，不管是肺結(jié)核還是氣管支氣管結(jié)核的發(fā)病，可能都涉及mTOR/自噬信號通路的調(diào)控，在發(fā)病初期MTB毒力強，細菌負荷量大，mTOR高表達，自噬活性被抑制，導(dǎo)致機體抗MTB的能力減弱，因而感染發(fā)病。

當(dāng)患者經(jīng)過積極地抗結(jié)核治療或者通過自身的免疫功能，MTB毒力和數(shù)量已較前明顯下降，氣管支氣管結(jié)核的病變部位在愈合過程中可能出現(xiàn)肉芽增殖及瘢痕狹窄，因此，mTOR的表達在結(jié)核性增生組中高于結(jié)核性瘢痕組及正常對照組，結(jié)核性瘢痕組高于正常對照組，自噬相關(guān)指標LC3的表達正好相反。mTOR/自噬信號通路可刺激生長因子及膠原蛋白的分泌，促進病變部位纖維化，導(dǎo)致瘢痕增殖，各組TGF-β1、COL-1的表達與mTOR的表達趨勢一致，結(jié)核性增生組中表達高于結(jié)核性瘢痕組及正常對照組，結(jié)核性瘢痕組高于正常對照組，與自噬相關(guān)指標LC3的表達相反，表明mTOR/自噬信號通路作為上游信號通路在被激活的情況下，可促進下游TGF-β1、COL-1的表達，進而促進肉芽增殖及瘢痕形成，導(dǎo)致氣管支氣管管腔狹窄。

綜上所述，mTOR/自噬信號通路可能參與結(jié)核性氣管支氣管狹窄的發(fā)病，其發(fā)病可能與MTB感染所致mTOR的表達上調(diào)抑制自噬活性相關(guān)，在自噬活性被抑制的基礎(chǔ)上，調(diào)控生長因子TGF-β1的表達及膠原蛋白COL-1的分泌，促進瘢痕增生，最后導(dǎo)致氣管支氣管病變部位的瘢痕狹窄。

本研究是基于組織標本進行的研究分析，缺乏細胞機制及動物模型的深入研究，有待未來更進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突