大麗花花粉活力及離體萌發(fā)研究

段 青，蔡晶晶，杜文文，楊 楠，王祥寧，賈文杰，馬璐琳

（1云南省農業(yè)科學院花卉研究所，昆明 650205；2國家觀賞園藝工程技術研究中心，昆明 650205；3云南省花卉育種重點實驗室，昆明 650205；4云南農業(yè)大學園林園藝學院，昆明 650225）

0 引言

大麗花是隸屬于菊科大麗花屬的多年生球根花卉，原產(chǎn)于美洲，墨西哥是其多樣化中心，現(xiàn)世界各地廣為栽培。大麗花品種繁多、花姿優(yōu)美、花色艷麗、花期長，是世界著名的觀賞花卉[1-3]。大麗花最早由墨西哥人從山地引種至庭院種植，后傳至歐洲、美國、日本等地，大約在20世紀初大麗花被引入中國，主要用于庭院觀賞和盆栽[3]。近年來，大麗花切花逐漸在國內流行，大量的國外品種被引入國內，新品種選育也逐漸在國內受到重視。雜交育種是選育大麗花新品種的主要途徑，其中，親本的花粉活力直接影響了雜交授粉的成功率[4]。因此，對大麗花花粉活力進行準確有效的檢測，是保證育種工作順利開展的重要條件，對雜交育種成功與否具有實際指導作用。確定大麗花花粉活力的有效測定方法、優(yōu)化方案以及了解不同品種的花粉活力情況是促進大麗花人工授粉雜交結實、培育新品種的必要研究基礎。目前，國內對大麗花的研究主要集中于引種評價[1-3,5-8]、繁育與栽培[9-12]、生理[13-15]等方面的研究，而對雜交育種中關鍵部分花粉活力萌發(fā)的研究極少，僅有張云仙[16]對大麗花散粉與結實特性進行了初步研究。大麗花品種已超過3萬個，是園藝上龐大而重要的花卉，大量品種尚未被研究。本研究采用TTC染色法、I2-KI染色法、孢粉染色法和離體萌發(fā)法測定大麗花花粉活力，在此基礎上通過單因素和正交設計試驗分別對大麗花花粉的離體萌發(fā)培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，得到最優(yōu)方案后進一步比較不同品種之間花粉活力大小的差異，旨在為大麗花的花粉活力鑒定、雜交育種的親本選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2020年7—9月在云南省農業(yè)科學院花卉研究所花卉遺傳育種重點實驗室完成。以22個大麗花栽培品種為試驗材料（圖1），其中，選取‘紫珠’、‘黃金縷’、‘紫霞’、‘白色飄雪’、‘愛丁堡’5個品種用于不同花粉活力測定方法比較試驗；選取‘紫珠’用于不同培養(yǎng)條件對大麗花花粉萌發(fā)的影響試驗；選取‘白色飄雪’用于不同培養(yǎng)基組分對大麗花花粉萌發(fā)的影響試驗；選取‘波徹兒’等22個品種用于不同大麗花品種花粉萌發(fā)率比較試驗。所有材料均種植于云南省農業(yè)科學院花卉研究所團結基地。

圖1 試驗材料的花部形態(tài)

1.2 方法

1.2.1 大麗花花粉的采集 選擇發(fā)育正常、無病蟲害且開放程度相近、但花藥尚未散粉的花朵，于8:00—10:00連同花枝一起采下，迅速插入盛有清水的三角瓶中帶回實驗室，待花朵散粉當天使用毛筆蘸取花粉直接用于試驗。

1.2.2 花粉活力測定方法

（1）TTC染色法。用蒸餾水將2%TTC染色液（Solarbio，北京）稀釋成0.5%或1%TTC染色液，貯于棕色瓶中于4℃避光保存?zhèn)溆?。用毛筆將花粉輕彈到滴有1～2滴TTC染液的載玻片上，蓋上蓋玻片放入培養(yǎng)皿內，置于35℃恒溫箱內，黑暗條件下染色30 min后進行鏡檢觀察花粉染色情況。根據(jù)花粉的顏色判斷花粉活力的高低，紅色的花粉粒有活力，淡紅色或無色的花粉?；盍Φ突驘o活力[17-18]。

（2）I2-KI染色法。稱取0.25 g KI溶于10 mL蒸餾水中，待其充分溶解后，加入0.125 g I2，用蒸餾水定容至50 mL，完全溶解后貯于棕色瓶中，室溫避光保存?zhèn)溆谩Ｓ妹P將花粉輕彈到滴有1～2滴I2-KI染液的載玻片上，蓋上蓋玻片放入培養(yǎng)皿內，室溫染色10 min后進行鏡檢觀察。根據(jù)染色后花粉粒的顏色來判斷花粉活力，活力強的花粉呈藍色，活力弱或內含物少的花粉呈黃褐色，無活力的花粉不著色[19-20]。

（3）孢粉染色法。用孔雀綠10 mg、酚5 g、水合氯醛5 g、酸性品紅50 mg、桔紅G 5 mg、冰醋酸1～4 mL、95%乙醇10 mL、蒸餾水50 mL、丙三醇25 mL配制孢粉混合染液，置于棕色瓶內4℃避光保存?zhèn)溆?。用毛筆將花粉輕彈到滴有1～2滴孢粉染液的載玻片上，蓋上蓋玻片放入培養(yǎng)皿內，室溫染色30 min后進行鏡檢觀察花粉染色情況。有活力的花粉細胞質被染成紅色，無活力的花粉細胞壁被染成綠色[20-21]。

（4）離體萌發(fā)法。采用BK液體培養(yǎng)基，現(xiàn)配現(xiàn)用。取干凈載玻片置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿內，滴加適量培養(yǎng)基，用毛筆輕彈少量花粉到培養(yǎng)基中，用牙簽輕輕攪動使花粉均勻分散其中，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，置于恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1.0～3.0 h（期間注意觀察，若培養(yǎng)基干了要及時添加），取出蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察并統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，當花粉管萌發(fā)長度超過1/2花粉直徑時即視為具有活力[21-22]。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件的單因素試驗 以BK（0.01% H3BO3+0.03% CaCl2·2H2O+0.02% MgSO4·7H2O+0.01% KNO3+4%蔗糖+2% PEG4000）為基本培養(yǎng)基，設置不同pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間分別進行單因素試驗（表1）。通過萌發(fā)率最高統(tǒng)計結果確定最佳pH和最佳培養(yǎng)溫度，在此基礎上進行不同時間的花粉萌發(fā)培養(yǎng)，通過花粉管長度確定最佳培養(yǎng)時間。由此確定的最佳pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間用于下一步正交試驗。

表1 單因素試驗

1.2.4 不同培養(yǎng)基組分的正交試驗 以BK為基本培養(yǎng)基，設置PEG4000、蔗糖、硼酸3個因素，每個因素設置4個水平進行正交設計試驗（表2），每處理設置3次重復。按不同配方配制，所有培養(yǎng)基均為液體培養(yǎng)基，現(xiàn)配現(xiàn)用，無需滅菌。

表2 正交試驗因素及水平

1.2.5 鏡檢及結果統(tǒng)計 在顯微鏡Leica DM6000 B（目鏡10×，物鏡10倍）下放大100倍觀察花粉粒著色及萌發(fā)情況，并采集相應的視野照片。每個品種（處理）設3次重復，每個重復制備5個玻片，每個玻片取5個視野，每個視野不少于30?；ǚ郏ú欢嘤?50粒）。單個重復內觀察到的染色或萌發(fā)花粉粒及花粉?？倲?shù)采用數(shù)字累計相加后再進行花粉活力或萌發(fā)率計算，最后取3次重復的平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用WPS Office軟件對數(shù)據(jù)進行預處理，正交設計試驗采用正交設計助手ⅡⅤ3.1軟件計算K值和極差R值，SPSSAU進行方差分析。使用R軟件繪制不同品種大麗花花粉萌發(fā)箱圖和聚類圖。

2 結果與分析

2.1 不同花粉活力測定方法比較與分析

采用TTC染色法、I2-KI染色法、孢粉染色法和離體萌發(fā)法4種方法對大麗花品種‘紫珠’、‘黃金縷’、‘紫霞’、‘白色飄雪’、‘愛丁堡’5個品種的花粉活力進行測定，結果（表3和圖2）顯示，經(jīng)0.5%或1%TTC溶液染色后，所有花粉顏色無明顯變化；經(jīng)I2-KI染色后，所有花粉均呈黃褐色，未見藍色、藍黑色花粉粒以及未著色花粉粒；經(jīng)孢粉染液染色后，所有花粉均呈紫紅色，未見綠色及未著色花粉粒；而離體萌發(fā)法效果良好，容易鑒別。TTC染色法、I2-KI染色法、孢粉染色法不適用于大麗花花粉活力的檢測，而離體萌發(fā)法雖耗時較長，但萌發(fā)效果良好，可準確直觀地反映大麗花花粉活力狀況。

表3 不同方法檢測大麗花花粉活力的效果

圖2 不同方法檢測大麗花花粉活力鏡檢效果

2.2 不同培養(yǎng)條件對大麗花花粉萌發(fā)的影響

2.2.1 pH 在培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間2 h的條件下，設置pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共5個梯度進行單因素試驗，‘紫珠’花粉萌發(fā)率統(tǒng)計結果見表4。圖3顯示隨pH的升高，花粉萌發(fā)率呈明顯上升趨勢，pH 6.0時花粉萌發(fā)率最高，達58.37%，然后隨著pH升高，花粉萌發(fā)率下降。進一步方差分析結果表明，pH 6.0處理組與其他處理達到了極顯著性差異(P＜0.01)。

表4 pH對花粉萌發(fā)率的影響及方差分析

圖3 不同培養(yǎng)pH條件下的大麗花花粉萌發(fā)率

2.2.2 培養(yǎng)溫度 在pH 6.0、培養(yǎng)時間2 h的條件下，設置15、20、25、30、35℃ 5個溫度梯度進行單因素試驗。圖4顯示溫度過高或過低都不利于大麗花花粉萌發(fā)，當培養(yǎng)溫度為25℃時，花粉萌發(fā)率最高，為59.77%。進一步方差分析結果（表5）表明，培養(yǎng)溫度對花粉萌發(fā)呈現(xiàn)出極顯著性差異(P＜0.01)。

圖4 不同培養(yǎng)溫度條件下的大麗花花粉萌發(fā)率

表5 培養(yǎng)溫度花粉萌發(fā)率的影響及方差分析

2.2.3 培養(yǎng)時間 在pH 6.0、培養(yǎng)溫度25℃的條件下，設置1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 5個時間梯度進行單因素試驗，花粉萌發(fā)率統(tǒng)計結果見表6。從圖5可知，隨培養(yǎng)時間延長，花粉萌發(fā)率呈上升趨勢。當培養(yǎng)時間達2.5 h時，花粉萌發(fā)率達64.7%，隨后進入緩慢上升趨勢。培養(yǎng)2.5 h時，花粉管長度明顯伸長（圖6），且與培養(yǎng)時間為3.0 h相比無顯著差異。

圖5 不同培養(yǎng)時間的大麗花花粉萌發(fā)率

表6 培養(yǎng)時間對大麗花花粉萌發(fā)率的影響及方差分析

圖6 不同培養(yǎng)時間條件下的大麗花花粉萌發(fā)及花粉管伸長情況

2.3 不同培養(yǎng)基組分對大麗花花粉萌發(fā)的影響

表7結果顯示RA＞RB＞RC，可以判斷3個試驗因素對‘白色飄雪’花粉萌發(fā)率的影響程度由大到小依次為PEG、蔗糖、硼酸；從K1、K2、K3、K4的平均值看，最佳組合為A3B3C2，但該組合并未出現(xiàn)在正交設計表中。A1B1C1處理的‘白色飄雪’平均花粉萌發(fā)率最低，僅為3.0%；A3B4C2處理的平均花粉萌發(fā)率最高，平均可達62.1%，即實際最佳處理組合為A3B4C2。采用SPSSAU進行進一步的方差分析（表8），A、B因素對花粉萌發(fā)率的影響達到極顯著水平(P＜0.01)，而C因素并不會對試驗結果產(chǎn)生差異(P＞0.05)。

表7 L16(43)正交試驗設計表及大麗花花粉萌發(fā)率統(tǒng)計結果

表8 SPSSAU的方差分析表

2.4 不同大麗花品種的花粉萌發(fā)率比較與分析

采用篩選出的實際最佳培養(yǎng)基組合，即0.05% H3BO3+0.03% CaCl2·2H2O+0.02% MgSO4·7H2O+0.01% KNO3+25 g/L PEG4000+6%蔗糖對22個大麗花品種的花粉萌發(fā)率進行檢測。采用SPSSAU進行方差分析。結果（表9和圖7）顯示，不同品種的花粉萌發(fā)率全部呈現(xiàn)出顯著性差異(F=156.003，P=0.000)，花粉萌發(fā)率11.75%～78.72%，平均為54.00%；萌發(fā)率在70%以上的品種有7個，占檢測品種數(shù)的31.82%；萌發(fā)率在60%～70%的品種3個，占13.64%；萌發(fā)率在50%～60%的品種4個，占18.18%；萌發(fā)率在40%～50%的品種有3個，占13.64%；萌發(fā)率在40%以下的品種有5個，占22.72%。其中‘波徹兒’的花粉萌發(fā)率最高(78.72%)，而‘蘭花公主’的花粉萌發(fā)率最低，僅為11.75%。進一步采用事后多重比較，品種兩兩比較結果差異用字母標注(A～J)，從結果可知，除‘波徹兒’和‘回憶’，‘紫珠’和‘綠野仙蹤’，‘琳達夫人’和‘簡.萬.斯卡法拉’，‘芬克里夫的錯覺’、‘白色飄雪’和‘瘋狂的愛’，‘熱情似火’和

‘雪蓮花’，‘瀟灑’、‘可美大地’和‘紫霞’，‘歡樂萬圣節(jié)’、‘黃金縷’、‘琳達’和‘愛丁堡’的花粉萌發(fā)率標注的字母一樣外(P＞0.01)，其他品種的花粉萌發(fā)率兩兩比較，標注字母均不同，存在顯著性差異(P＜0.01)，說明大麗花花粉活力多樣性豐富。

表9 22個大麗花品種的花粉萌發(fā)率測定結果

圖7 不同大麗花品種花粉萌發(fā)情況

采用最短距離法，以花粉萌發(fā)率為變量對大麗花進行聚類分析，供試的22個大麗花品種可以分為5個類群（圖8）。其中，Ⅰ類群包括了‘琳達夫人’等10個品種，花粉萌發(fā)率為63.84%～78.72%，是正常可育品種；Ⅱ類群包括‘雪蓮花’等4個品種，花粉萌發(fā)率為51.20%～57.25%，是正?？捎贩N；Ⅲ類群包括‘紫霞’、‘瀟灑’、‘可美大地’，花粉萌發(fā)率為40.69%～45.02%，為低不育品種；Ⅳ類群包括‘愛丁堡’等4個品種，花粉萌發(fā)率為24.78%～29.35%，為半不育品種；Ⅴ類群僅有‘蘭花公主’1個品種，花粉萌發(fā)率為11.75%，為半不育品種。

圖8 不同大麗花花粉萌發(fā)率聚類圖

3 結論

離體萌發(fā)法能夠準確直觀地反映花粉是否具有活力，是測定大麗花花粉活力有效方法。pH 6.0、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)時間2.5 h是大麗花花粉離體萌發(fā)最適宜的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基組分對大麗花花粉萌發(fā)的影響程度依次為PEG＞蔗糖＞硼酸，實際最佳處理組合為A3B4C2，即PEG4000 25 g/L、蔗糖60 g/L、硼酸50 mg/L的處理組合。本研究中22個大麗花品種的花粉萌發(fā)率為11.75%～78.72%，不同品種的花粉萌發(fā)率差異大，可以分為5個類群，其中有14個品種正?？捎s交時可用作父本；8個品種為半不育或低不育，雜交時更適合作母本。

4 討論

4.1 大麗花花粉活力測定方法

本研究采用TTC染色法、I2-KI染色法、孢粉染色法和離體萌發(fā)法4種方法測定了大麗花花粉活力，結果表明，TTC染液不能使大麗花花粉粒著色，I2-KI和孢粉染液可使所有花粉著色，但是不能區(qū)分有活力花粉和敗育花粉。染色法簡便易行，但該方法是以花粉細胞中的活性物質或者細胞膜的通透性與完整性為基礎，受花粉自身特性，如細胞壁的厚薄、細胞外壁成分、細胞內各種酶活性的強弱等的影響較大，其適用性和準確性在不同物種之間的差異極大[23-24]。本試驗中，TTC、I2-KI和孢粉染液的染色效果不佳，可能是大麗花花粉外壁太厚或花粉內含物中支鏈淀粉含量太少等原因造成的。離體萌發(fā)法耗時長，但該方法是以花粉萌發(fā)并長出花粉管為判斷依據(jù)，能夠準確直觀地反映花粉是否具有活力。Stone等[25]指出花粉離體萌發(fā)法被普遍認為可以提供植物體內花粉生活力的最佳估計值。本試驗的研究結果也表明離體萌發(fā)法是測定大麗花花粉活力的有效方法。了解植物的花粉活力狀況是雜交育種工作的基礎，本研究確定了離體萌發(fā)法是大麗花花粉活力的有效測定方法，為促進大麗花人工授粉雜交結實、培育新品種提供了必要的研究基礎。但測定花粉活力的方法很多，本研究僅采用了4種測定方法，除離體萌發(fā)法，是否還有其他有效測定方法有待于進一步探索。

4.2 不同培養(yǎng)條件對大麗花花粉離體萌發(fā)的影響

花粉萌發(fā)需要在一定的環(huán)境條件下進行。張露等[26]研究發(fā)現(xiàn)當pH 5.5、培養(yǎng)溫度25℃時礬根的花粉萌發(fā)率明顯提高，培養(yǎng)120 min時花粉管明顯伸長，認為采用適宜的培養(yǎng)條件對礬根的花粉萌發(fā)很有必要。詹妮和黃烈健[27]也認為不同培養(yǎng)溫度對厚莢相相思花粉的體外萌發(fā)影響較大，當培養(yǎng)溫度為24℃時，厚莢相相思的花粉萌發(fā)效果最好。本研究采用單因素試驗研究pH、溫度、時間對大麗花花粉離體萌發(fā)的影響，結果表明pH 6.0時，大麗花花粉的萌發(fā)率較其他pH條件的萌發(fā)率高，達到58.37%；在此基礎上，給予不同的培養(yǎng)溫度，溫度過高或過低都不利于大麗花花粉離體萌發(fā)，當培養(yǎng)溫度為25℃時大麗花花粉的離體萌發(fā)率最高，達到59.77%。當培養(yǎng)時間達到2.5 h時大麗花花粉管發(fā)生明顯伸長。本研究中，在篩選到離體萌發(fā)法可以有效測定大麗花花粉萌發(fā)的基礎上，進一步優(yōu)化了培養(yǎng)條件，確定了pH 6.0、培養(yǎng)溫度25℃、培養(yǎng)時間2.5 h是大麗花品種‘紫珠’花粉離體萌發(fā)最適宜的培養(yǎng)條件，但大麗花品種繁多，品種之間具有差異性，該方案是否適用于其他品種還需要進一步研究。

4.3 不同培養(yǎng)基組分對大麗花花粉萌發(fā)的影響

花粉離體萌發(fā)在人工配制的培養(yǎng)基上進行，受到培養(yǎng)基組分的影響。本研究采用3因素4水平的正交試驗來研究蔗糖、PEG、硼酸對大麗花花粉離體萌發(fā)的影響，從試驗結果可知，3個試驗因素對大麗花‘白色飄雪’花粉萌發(fā)率的影響程度依次為PEG＞蔗糖＞硼酸，PEG和蔗糖的影響達到了極顯著水平，而硼酸的影響較??；用于大麗花‘白色飄雪’花粉離體萌發(fā)的實際最佳組合為A3B4C2，即當PEG含量為25 mg/L、蔗糖含量為60 g/L、硼酸含量為50 mg/L時，‘白色飄雪’花粉離體萌發(fā)率達到最高，為62.1%。PEG是一種高分子滲透劑，能夠提高細胞膜的柔軟程度和通透性，從而促進花粉萌發(fā)和花粉管生長[26-28]。前人研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的PEG能促進桔梗[28]、菊花[29-30]、梅花[31]、山茶[32]等植物的花粉萌發(fā)。本研究結果也驗證了在一定范圍內，PEG能顯著促進大麗花花粉萌發(fā)，最適宜大麗花花粉萌發(fā)的PEG濃度為25 g/L，濃度過高反而會抑制花粉的萌發(fā)。

蔗糖為花粉離體萌發(fā)提供碳源并維持一定的滲透壓，它對花粉萌發(fā)和花粉管生長具有重要作用。研究表明，在一定范圍內，礬根[26]、核桃楸[33]、平榛[34]、淫羊藿[35-36]等植物的花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的升高而增加，但蔗糖濃度過高反而會抑制花粉萌發(fā)。在本研究中蔗糖濃度設置了0、20、40、60 g/L 4個水平，從正交試驗的K值看，最佳的蔗糖濃度為40 g/L，也驗證了前人的結論，即蔗糖濃度過低或過高均不利于大麗花花粉的離體萌發(fā)，當糖濃度過低時會造成花粉壁破裂，內溶物析出，導致花粉失去生活力，而蔗糖濃度過高時又會造成花粉的質壁分離從而抑制萌發(fā)[23,37]。

前人研究表明，由于硼酸能夠增加花粉對糖的吸收、轉運和代謝，適量的硼酸有利于花粉萌發(fā)[19,33,38]。然而，本研究結果表明，硼酸對大麗花花粉的萌發(fā)不產(chǎn)生影響或影響極小，這可能是大麗花自身的花柱和柱頭內具有足夠的硼離子來補償或者是由于大麗花對硼離子的需求不高造成的。

4.4 不同大麗花品種的花粉活力

花粉萌發(fā)率的測定是開花植物學特性研究中的一個重要組成部分，萌發(fā)率的高低會影響到植物的授粉、受精和結實。因此，花粉萌發(fā)率對引種栽培工作和雜交育種工作的開展具有重要指導意義。本研究在篩選出離體萌發(fā)法，以及最適宜的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分的基礎上，測定了22個大麗花品種的花粉活力，結果表明不同品種的花粉萌發(fā)率差異明顯，說明大麗花花粉活力多樣性豐富。花粉活力能夠作為反映雄配子發(fā)育狀況的一項指標，對花粉活力進行分級，可以將不同品種劃分為不同等級的育性，并為后續(xù)雜交親本選配提供依據(jù)。一般花粉可育率0%為全不育，小于5%為高不育，6%～30%為半不育，31%～50%為低不育，大于50%為正?？捎齕21]。根據(jù)聚類結果可知，Ⅰ類群和Ⅱ類群的花粉萌發(fā)率均大于50%，為正?？捎贩N，人工雜交授粉時可用作父本；Ⅲ類群的花粉萌發(fā)率低于50%、大于30%，為低不育品種，在親本選配不建議用作父本，更適宜用作母本；Ⅳ類群和Ⅴ類群的花粉萌發(fā)率低于30%，為半不育品種，若在雜交育種工作中選作親本時，需要采取相應的輔助措施才有助于提高雜交結實率。