適合離體微景觀月季品種的篩選及應用

趙麗達，馬 譽，王 圣，韓貝貝，趙 亮，張曉渤，杜 麗

(南陽師范學院 水資源與環(huán)境工程學院,河南省月季種質(zhì)創(chuàng)新與栽培技術(shù)工程研究中心，河南 南陽 473061)

月季(RosachinensisJacq.)是薔薇科薔薇屬植物，原產(chǎn)于中國，其栽培歷史悠久，自漢武帝時期就有月季種植的記錄[1].其花色瑰麗，花香馥郁，花型優(yōu)美，可四時開花，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，廣泛應用于園林造景和環(huán)境綠化之中[2-4].河南省南陽市的石橋鎮(zhèn)，被國家林業(yè)和草原局、中國花卉協(xié)會命名為“中國月季之鄉(xiāng)”[5].截至2019年，南陽月季企業(yè)已有200多家，種植面積近萬畝，月季供應量占全國市場的80%以上，出口量占全國市場的60 %以上[6].但是南陽月季以供應綠化苗木為主，產(chǎn)品單一，缺乏高端園藝產(chǎn)品，更缺乏具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)意產(chǎn)品.多數(shù)月季苗木或盆栽有不耐病蟲害、有刺易傷人、不易打理等缺陷.在此背景下，試管月季微景觀應運而生.試管月季微景觀是指以月季為主要造景材料的離體植物微景觀.離體植物微景觀(Terrarium in vitro)是通過離體培養(yǎng)技術(shù)，將具有觀賞價值的植物微型化后，在無菌容器中進行造景，配以顏色各異的培養(yǎng)基，構(gòu)成具有獨特觀賞價值的微型藝術(shù)景觀.較之傳統(tǒng)微景觀，其具有無需澆水施肥、輕便易攜、觀賞期長等優(yōu)點[7-8].

試管開花(In vitro flowering)是利用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控和環(huán)境調(diào)控使植物在組培容器內(nèi)開花的現(xiàn)象[9].試管花的優(yōu)點有：花期不受季節(jié)限制，任何季節(jié)都可欣賞特定植物的開花過程[10]；從生長到開花整個過程無需澆水施肥，便于打理；縮短了植物在自然狀態(tài)下的成花時間[11]等.

本研究選擇適宜的地被月季和微型月季品種為研究對象，以具腋芽莖段為外植體，設(shè)計不同的消毒時間，篩選出最佳消毒方法，以期獲得無菌母株.利用無菌母株，進行快繁體系和微型化的相關(guān)探索，并將其與其他無菌植物搭配造景，旨在篩選出適合試管月季微景觀的月季品種并建立試管月季微景觀的制作流程.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

培養(yǎng)材料于2019年5月取自南陽市農(nóng)業(yè)科學院田間栽種5年的健康、無病蟲害，具有典型品種特性月季的一年生枝條.一共有8個月季品種用于離體培養(yǎng)，其中，微型月季4種：‘紫色時代’‘草裙舞女’‘小丁香’‘紅柯斯特’，地被月季4種：‘寒地玫瑰’‘自由黃金’‘紅從容’‘皇家巴西諾’.

1.2 試驗方法

1.2.1 月季品種的田間篩選

對8個月季品種的田間性狀，特別是開花性狀進行初步篩選，以月季‘紫色時代’為對照品種，對各個月季品種的株形、葉片大小、皮刺多寡、花朵直徑、花色、花量等方面進行對比分析，以篩選適合試管月季微景觀的月季品種.

1.2.2 八個月季品種無菌苗的獲得、增殖及微型化

因月季‘紫色時代’株型較小、枝葉纖細、花色鮮艷，故選擇該品種為主要試材，探究其適宜的消毒方法、增殖配方以及微型化配方，進而推及其他月季品種.其中消毒方法主要探究消毒液處理時長對消毒效果的影響；增殖配方主要探究在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，不同濃度的6-BA和IBA組合對月季無菌芽的增殖誘導效果；微型化配方主要探討MS培養(yǎng)基中大量元素及蔗糖用量的減少對月季無菌苗生長的控制效果.

1.2.3 月季試管開花的觀測

在對8個月季品種進行增殖的過程中，對出現(xiàn)試管開花現(xiàn)象的月季進行連續(xù)性觀測，并根據(jù)萼片形態(tài)、花瓣形態(tài)及顯色狀況對其進行初步的開花階段劃分及最佳觀賞期判定.

1.2.4 試管月季微景觀的制作

在獲得月季無菌苗增殖配方的基礎(chǔ)上，對上述8個月季品種進行有效增殖，篩選大小適宜的月季無菌苗；以微型化配方為基礎(chǔ)，通過調(diào)控食用色素(其顏色包括：寶石藍、青綠、青檸、辣椒紅、絲絨紅、深紫)的添加量，創(chuàng)制多彩培養(yǎng)基；在微型化培養(yǎng)基上，探究月季植株大小、株形、葉色和培養(yǎng)基顏色組合搭配的造景效果.

1.3 項目測定

污染率=(污染數(shù)/接種總數(shù))×100%；褐化率=(褐化外植體數(shù)/接種總數(shù))×100%；萌發(fā)率=(萌發(fā)的莖段總數(shù)/接種總數(shù))×100%；增殖系數(shù)=增殖的不定芽數(shù)/長出不定芽的外植體數(shù).

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，SPSS 26.0 軟件進行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 月季品種的田間篩選

對8個月季品種田間性狀進行比較，其開花性狀如圖1所示.以月季‘紫色時代’為對照品種，對月季的形態(tài)特征進行了整理，結(jié)果如表1所示.經(jīng)田間性狀觀察，微型月季‘紫色時代’(圖1-A)、‘草裙舞女’(圖1-B)、‘小丁香’(圖1-E)株型緊湊、枝葉纖細、花朵微小，具有植株微型化的天然優(yōu)勢；為豐富造景植物的花色，地被月季‘自由黃金’(圖1-C)也被選為微景觀造景植物的主要研究對象.但究竟這些微型月季和地被月季品種是否能夠應用于試管月季微景觀中，還需經(jīng)離體培養(yǎng)后再做探究.

圖1 八個月季品種的田間開花性狀注:A. ‘紫色時代’; B. ‘草裙舞女’; C. ‘自由黃金’; D. ‘紅柯斯特’; E. ‘小丁香’; F. ‘紅從容’; G. ‘寒地玫瑰’; H. ‘皇家巴西諾’

2.2 八個月季品種無菌苗的獲得、增殖及微型化

以月季‘紫色時代’為主要試材，探究外植體的消毒時間，確定最佳消毒方法；比較‘紫色時代’在不同的增殖配方中，無菌苗生長狀態(tài)的差異，確定最適增殖配方；通過減少MS培養(yǎng)基中大量元素及蔗糖的用量來達到微型化的目的，最終建立起月季‘紫色時代’適宜的無菌苗獲得、增殖以及微型化方法(圖2)，并推及應用到其他月季品種之中.

表1 八個月季品種的田間性狀分析(以月季‘紫色時代’為對照品種)

圖2 月季‘紫色時代’無菌苗的獲得、增殖及微型化注: A. ‘紫色時代’莖段萌發(fā)無菌芽; B. 無菌芽的生長; C. 無菌芽的增殖; D. 無菌苗的微型化; E. 無菌苗微型化失敗配方; F. 無菌苗試管開花現(xiàn)象; G. 無菌苗花蕾的細節(jié); H. 無菌苗的生根現(xiàn)象

由表2可知，流水沖洗2 h，75%乙醇浸泡40 s，0.1%氯化汞浸泡5 min，無菌水沖洗3次，使‘紫色時代’達到較好的消毒效果，其莖段腋芽亦可及時萌發(fā)(圖2-A)，萌發(fā)率達86.87%.當延長消毒時間，雖外植體污染率可降低為0%，但在一定程度上抑制了莖段腋芽的萌發(fā)，并使其褐化率升高.

表2 不同消毒方法對月季‘紫色時代’外植體消毒效果的影響

由表3可知，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉，為‘紫色時代’無菌芽的最適增殖配方，此配方可使其迅速增殖(圖2-C).相較于對照組(MS培養(yǎng)基)中6.67%的增殖率和1.00的增殖系數(shù)，在該配方中，無菌芽增殖率為100%，增殖系數(shù)為2.29，且植株平均高度較其他組的高.

由表4可見，月季‘紫色時代’適宜的微型化配方為：MS/4(大量元素含量為MS的1/4)+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉，較之空白對照組(MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉)中植株月平均生長量0.68 cm，在此配方中植株月平均生長量為0.17 cm，此時植株生長狀況良好、莖段細軟、葉片淺綠(圖2-D)，此配方可在不影響植株觀賞價值的前提下，有效控制月季無菌苗的旺盛生長.當培養(yǎng)基中蔗糖含量減少為7.5 g·L-1時，植株的月平均生長量僅為0.13 cm，但此時植株葉片發(fā)黃、死亡較多(圖2-E)，由此可見，減少蔗糖用量可控制月季無菌苗的旺盛生長，但過度減少蔗糖用量會導致月季無菌苗的黃化死亡.

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對月季‘紫色時代’增殖效果的影響

表4 不同微型化配方對月季‘紫色時代’無菌苗生長的影響

通過‘紫色時代’建立的消毒方法，在其他7個品種中應用后，均順利獲得無菌苗.月季‘紫色時代’的最適增殖配方，能使其他5個月季品種(‘草裙舞女’‘自由黃金’‘小丁香’‘紅從容’‘皇家巴西諾’)的無菌苗獲得有效增殖.由于月季‘紅科斯特’和‘寒地玫瑰’的外植體對植物生長調(diào)節(jié)劑較為敏感，在‘紫色時代’的最適增殖配方上容易形成冗余的愈傷組織，在調(diào)控植物生長調(diào)節(jié)劑用量后(MS+0.30 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA)，也獲得了較好的增殖誘導效果.最終，8個月季品種全部獲得了相應的無菌苗以及較好的增殖效果(圖3).

圖3 八個月季品種無菌苗的獲得及增殖注:A. ‘紫色時代’; B. ‘草裙舞女’; C. ‘自由黃金’; D. ‘紅柯斯特’; E. ‘小丁香’; F. ‘紅從容’; G. ‘寒地玫瑰’; H. ‘皇家巴西諾’

對8個月季品種無菌苗的植株性狀進行比對分析(表5)，結(jié)果顯示，微型月季‘紫色時代’‘小丁香’離體培養(yǎng)所得的無菌苗與田間性狀篩查結(jié)果相符，同樣呈現(xiàn)植株小巧、枝葉纖細的特點(圖3-A，3-E)，具有觀賞價值，被列入可用于離體植物造景的品種選擇中.同時，在‘紫色時代’無菌苗的培養(yǎng)中觀察到了試管開花現(xiàn)象(圖2-F，2-G).

2.3 月季試管開花的觀測

在對8個月季品種進行增殖的過程中，發(fā)現(xiàn)有3個月季品種(‘紫色時代’‘小丁香’和‘寒地玫瑰’)出現(xiàn)了試管開花現(xiàn)象.其中，月季‘小丁香’在其增殖配方上培養(yǎng)2個月左右穩(wěn)定開花，可以作為試管開花微景觀的主要試材.對試管開花的‘小丁香’進行連續(xù)性觀測(圖4).根據(jù)萼片形態(tài)、花瓣形態(tài)及顯色狀況，對其試管開花過程進行了初步的開花階段劃分(表6)及最佳觀賞期的判定.

表5 8個月季品種無菌苗性狀分析表(以月季‘紫色時代’為對照品種)

圖4 月季‘小丁香’試管開花的階段劃分 注: A. 幼蕾期-小蕾; B. 幼蕾期-大蕾; C. 現(xiàn)蕾期; D. 初花期; E. 盛花期; F. 衰老期

經(jīng)對月季‘小丁香’試管開花現(xiàn)象的連續(xù)觀測，將其現(xiàn)蕾期(圖4-C)、初花期(圖4-D)及盛花期(圖4-E)確定為最佳觀賞期，最佳觀賞期持續(xù)時長約為2周(表6).在觀察過程中，發(fā)現(xiàn)月季‘小丁香’在試管內(nèi)的花色有別于其田間花色(圖1-E)，花色較淺，初步推測此現(xiàn)象是由于光照強度太弱所致.

表6 月季‘小丁香’試管開花的開花階段劃分依據(jù)

2.4 試管月季微景觀的制作

經(jīng)過月季品種的篩選，無菌苗的獲得、增殖以及微型化配方的篩選，利用已獲得的月季無菌苗在多彩培養(yǎng)基上進行植物造景，根據(jù)離體月季植株大小、株形、葉色以及培養(yǎng)基的顏色，搭配出不同的試管月季微景觀效果，部分產(chǎn)品如圖5-A所示.

按照以下流程來制作試管月季微景觀：(1)根據(jù)產(chǎn)品立意，設(shè)計平面圖及立面圖，平面圖包含植物的位置、種類以及數(shù)量信息(圖5-B)，立面圖包含植物的高度和株形信息(圖5-C)，確定設(shè)計圖紙后，1∶1打印出來，備用.(2)按照圖紙要求，選取適宜的造景材料，備用.(3)將配好的多彩微型化培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌20 min；將滅菌后的培養(yǎng)基置于超凈工作臺內(nèi)，分裝到直徑3～4 cm，高約7～8 cm的無菌試管中，分裝體積為試管體積的1/4～1/3；在超凈臺上吹風30 min，吹去多余的水汽，待培養(yǎng)基完全冷卻凝固后加蓋/木塞，備用.(4)在超凈工作臺內(nèi)，將平面圖放置在培養(yǎng)基的下方；依據(jù)平面示意圖，用無菌鑷子將造景植物接種于設(shè)定的位置，并依據(jù)立面圖顯示效果，調(diào)整其高度與姿態(tài).(5)試管加蓋/木塞并封口，以確保產(chǎn)品無菌，形成試管月季微景觀(圖5-D，5-E).試管月季微景觀流程初步建立(圖6).

圖5 試管月季微景觀產(chǎn)品展示圖注: A. 試管月季微景觀部分產(chǎn)品展示; B. 產(chǎn)品‘寧靜之泊’立面圖; C. 產(chǎn)品平面圖; D. 產(chǎn)品遠景圖; E. 產(chǎn)品細節(jié)圖; F. 擬開發(fā)試管開花月季微景觀意向圖

圖6 試管月季微景觀的制作流程圖注: 消毒處理: 流水沖洗2 h，75%乙醇浸泡40 s，0.1%氯化汞浸泡5 min，無菌水沖洗3次; 配方1：MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉; 配方2：MS+1.0 g·L-1 6-BA+0.5 g·L-1 IBA+30 g·L-1蔗糖+ 8 g·L-1瓊脂粉; 配方3: MS/4+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉+40～600 mg·L-1食用色素

在實際生產(chǎn)應用中，由于有統(tǒng)一的圖紙，因而按照上述流程，不同的生產(chǎn)者亦可生產(chǎn)出效果一致的某一主題的試管月季微景觀產(chǎn)品.為進一步提高試管月季微景觀的觀賞價值與經(jīng)濟價值，未來主要的研發(fā)方向是培育穩(wěn)定的試管開花月季新產(chǎn)品(圖5-F).

3 討論與結(jié)論

本研究篩選出了適于進行試管月季微景觀制作的月季品種，通過適宜的消毒方法獲得了8個月季品種的無菌苗，篩選獲得了較為合適的增殖配方，初步探索了植株微型化的配方.最后，選擇適宜的植株進行了試管月季微景觀的制作，至此，試管月季微景觀的制作流程初步形成.通過植物離體培養(yǎng)技術(shù)，將具有觀賞價值的月季微型植株及配景植物，栽植到無菌容器中形成的試管月季微景觀，即無須澆水施肥，又可長時間正常生長，具有廣闊的市場前景，此流程圖可在企業(yè)的批量生產(chǎn)過程中發(fā)揮指導性作用.

植物組織培養(yǎng)是指利用植物細胞的全能性，在無菌條件下，將植物體的任何一部分培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，并給予合適的培養(yǎng)條件，使之發(fā)育形成完整植株的實驗技術(shù)[12].其在花卉領(lǐng)域的應用有離體快繁、脫毒培養(yǎng)、離體保存種質(zhì)資源、研發(fā)植物人工種子、培育花卉新品種、植物發(fā)育過程的觀察、基因功能的研究[13-14]等.組織培養(yǎng)技術(shù)在觀賞植物領(lǐng)域應用廣泛，目前已有2000多種木本觀賞植物運用了快繁技術(shù)[15]，但是鮮有將其與微景觀結(jié)合，形成可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的潛在組培產(chǎn)品.本研究的試管月季微景觀，屬于新型組培觀賞品，拓寬了組織培養(yǎng)技術(shù)在觀賞園藝造景范疇中的應用.

現(xiàn)有的關(guān)于月季試管開花的報道多著重于探究試管開花的影響因素，未對試管花的開花過程進行開花階段劃分[16-19]，本研究對月季‘小丁香’進行了初步的試管開花階段劃分，可為后續(xù)研究者提供參考依據(jù).相較于苔蘚微景觀生態(tài)瓶[20]以及離體植物微景觀專用瓶，本研究中使用的微景觀試管直徑為3～4 cm，高約7～8 cm，具有更加小巧便攜的優(yōu)點.