miR-139555及其靶基因PtNBC在三疣梭子蟹適應(yīng)鹽度脅迫中的表達(dá)調(diào)控

趙笑顏 呂建建, 張 文 吳 捷 金 玲 劉 萍,

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266235)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus), 屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda), 甲殼綱(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹屬(Portunus), 分布于我國(guó)黃渤海、東海, 日本、朝鮮、馬來(lái)西亞群島等諸多海域, 是重要的海水經(jīng)濟(jì)蟹類之一[1,2]。三疣梭子蟹作為海水“弱”高滲調(diào)節(jié)型種類[3],養(yǎng)殖水體鹽度驟變?nèi)菀子绊懫潴w內(nèi)離子及滲透平衡, 進(jìn)而影響其蛻皮、攝食及生存[4—6]; 鹽度變化也會(huì)引起其機(jī)體免疫能力下降, 增加疾病發(fā)生的幾率[7]。探討三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)機(jī)制, 對(duì)其健康養(yǎng)殖及耐鹽良種培育有十分重要的意義。

通過(guò)鰓上皮細(xì)胞的離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)維持機(jī)體內(nèi)的滲透壓和離子平衡是甲殼動(dòng)物進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)的主要方式[8]。microRNA(miRNA)是一類具有重要功能的非編碼小分子RNA, 能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá), 在生物發(fā)育、分化及抗逆過(guò)程中發(fā)揮巨大作用[9,10]。已有研究表明, miRNA在水生動(dòng)物的滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11], 如在斑馬魚(yú)(Danio rerio)中miR-200a和miR-200b直接調(diào)控Na+/H+exchanger基因的表達(dá), 影響離子細(xì)胞中Na+的跨膜運(yùn)輸[12]; 抑制羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)體內(nèi)miR-206的表達(dá), 可顯著提高IGF-1mRNA水平, 從而間接調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因Na+/K+-ATPase和NKCC的表達(dá)[13,14]; 在刺參(Apostichopus japonicas)中, miR-10通過(guò)調(diào)控TBC1D5(胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬之間的一個(gè)關(guān)鍵的分子開(kāi)關(guān))基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)鹽度脅迫[15,16]。目前, 甲殼類中有關(guān)miRNA的研究較少, 且研究?jī)?nèi)容主要為性別和免疫等領(lǐng)域[17—20], 少有研究關(guān)注 miRNA 在甲殼動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)中的功能。

在前期工作中, 通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)方法篩選到了在低鹽脅迫下三疣梭子蟹鰓組織中差異表達(dá)的miR-139555, 預(yù)測(cè)其靶基因?yàn)殡x子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的PtNBC基因(碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)基因, 英文名稱: Sodium bicarbonate cotransporter, 縮寫(xiě)NBC)。本研究克隆了PtNBC基因并進(jìn)行了序列特征分析,開(kāi)展了該基因和miR-139555在三疣梭子蟹主要組織中的表達(dá)分布規(guī)律及在低鹽脅迫后鰓中的表達(dá)模式分析。研究結(jié)果將明確miR-139555與其潛在靶基因PtNBC的調(diào)控關(guān)系, 有助于系統(tǒng)解析三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 miRNA的篩選及靶基因預(yù)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)低鹽脅迫處理的三疣梭子蟹鰓組織進(jìn)行高通量測(cè)序, 獲得了轉(zhuǎn)錄組及miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)。首先, 從miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到了差異表達(dá)的miR-139555。使用RNAhybrid軟件進(jìn)行miRNA-139555的靶基因預(yù)測(cè)。根據(jù)miRNA與靶基因的序列匹配、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性, 篩選出最小自由能低于?30 kCal/mol 的候選目標(biāo), 最終獲得miR-139555的靶基因?yàn)镻tNBC。miRNA-139555與PtNBC的結(jié)合位點(diǎn)在該基因mRNA 5′UTR的427—433 bp, 兩者結(jié)合的最小自由能(mfe)為–36.1 kCal/mol。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均取自山東省昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司黃海水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地。隨機(jī)選取80日齡活力良好的健康三疣梭子蟹, 平均體重(25±3) g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在室內(nèi)養(yǎng)殖車間的水泥池暫養(yǎng)7d, 暫養(yǎng)期間, 鹽度34, 溫度(26±2)℃, 持續(xù)充氧, 每天更換 1/3 體積的海水且定時(shí)投喂新鮮餌料。隨機(jī)選取9只暫養(yǎng)后的三疣梭子蟹, 設(shè)置3個(gè)平行, 每個(gè)平行3只, 分別取肌肉、心臟、胃、腦、眼柄、血細(xì)胞、肝胰腺和鰓共8個(gè)組織, 液氮儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

隨機(jī)選取暫養(yǎng)的三疣梭子蟹進(jìn)行低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2組: 對(duì)照組(海水鹽度34)和低鹽11脅迫組(72h-LC50為11[21]), 每組設(shè)置3個(gè)平行, 每個(gè)平行30只。在3個(gè)水泥池中注入正常海水, 另選3個(gè)水泥池將海水鹽度調(diào)節(jié)至11(用淡水勾兌), 鹽度穩(wěn)定后將各組三疣梭子蟹分別放置于池中。分別在脅迫0、12h、24h、48h和72h各時(shí)間點(diǎn)取鰓組織, 每個(gè)平行取3只, 于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PtNBC基因cDNA全長(zhǎng)克隆

用TRIzol法提取未經(jīng)低鹽脅迫處理的三疣梭子蟹鰓、肝胰腺和肌肉等組織的RNA, 核酸定量?jī)x(NanoDrop 2000 Thermo Scientific)檢測(cè)RNA的濃度及質(zhì)量、1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。將各組織中的總RNA均勻混合, 使用TaKaRa公司的SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit試劑盒合成3′和5′ RACE cDNA模板。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得了PtNBC序列, 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異的3′和5′RACE引物, 引物由上海生工生物公司合成(表 1)。使用南京諾唯贊生物公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase進(jìn)行3′和 5′的巢式擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒(購(gòu)自TaKaRa公司)進(jìn)行目的片段回收, 連接(全式金pEASY-T1 Cloning), 轉(zhuǎn)化(全式金Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell), 挑取陽(yáng)性單克隆, 進(jìn)行菌落 PCR 鑒定(M13引物), 將目的單克隆菌液測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)。

表1 本研究中所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.4 序列生物信息學(xué)分析

使用Contig Express軟件將測(cè)序獲得的3′序列、5′序列與驗(yàn)證的基因序列進(jìn)行拼接, 得到PtNBC基因cDNA全長(zhǎng)。利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)該基因的開(kāi)放閱讀框。使用 Signal4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域。目的基因與其他物種的一致性及同源性分析采用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。氨基酸序列多重序列比對(duì)使用DNAMAN 5.2.9軟件。進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建使用MEGA 6.0軟件(鄰接法Neighbor-joining)。

1.5 PtNBC基因和miRNA-139555的組織表達(dá)及各處理組的表達(dá)特征分析

運(yùn)用TRIzol法提取三疣梭子蟹全組織及各實(shí)驗(yàn)組的總RNA, 并檢測(cè)質(zhì)量(核酸定量?jī)xNanoDrop 2000 Thermo Scientific)和完整性(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)。

利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA模板, 用于PtNBC基因定量分析。利用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行miRNA cDNA第一鏈合成, 用于miRNA-139555定量分析。

依據(jù)克隆獲得的三疣梭子蟹PtNBC序列及miRNA-139555成熟序列, 使用Primer Premer 5.0及miRNA Design V1.01軟件設(shè)計(jì)特異性RT-PCR引物,分別以β-actin和U6作為內(nèi)參(表 1), 使用ABI 7500 Real Time PCR儀和SYBR GreenProTaqHS qPCR Kit(艾科瑞公司)試劑對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。PCR反應(yīng)體系為: 2× SYBR?Green ProTaqHS Premix II 5 μL, Primer F 0.4 μL, Primer R 0.4 μL, Template cDNA 1 μL, ddH2O 3 μL。用2–??Ct法分析PtNBC基因及miRNA-139555的相對(duì)表達(dá)量, 利用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 使用OriginPro和EXCEL對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,P<0.05 表明具有顯著性差異。

1.6 體外雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

PtNBC基因的5′-UTR野生型(wt)和突變型(mut)目的片段由上海生工生物公司合成。miRNA-139555與PtNBC-5′-UTR結(jié)合位點(diǎn)如圖 1所示。本實(shí)驗(yàn)所用雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體為psiCHECK-2。目的片段插入位點(diǎn)為XhoⅠ和NotⅠ,將載體酶切后膠回收備用。用T4連接酶(Fermentas公司)進(jìn)行目的基因片段與載體的連接, 利用DH5a感受態(tài)細(xì)胞(上海生工)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(抗性:Amp),37℃, 過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后平板挑菌, 37℃ 250轉(zhuǎn)/分鐘搖菌14h, 用菌液進(jìn)行PCR鑒定, 并將陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證, 最終成功構(gòu)建了PtNBC-5′-UTR-wt/mut載體。

圖1 miRNA-139555與PtNBC-5′UTR靶位點(diǎn)結(jié)合示意圖Fig. 1 Schematic diagram of miRNA-139555 binding to PtNBC-5′UTR target site

將293T細(xì)胞接種到96孔板中, 待細(xì)胞密度達(dá)到50%—70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。0.16 μg的5′UTR-wt、5′UTR-mut目的質(zhì)粒分別與5 pmol的miR-139555、NC mimics(miRNA對(duì)照)兩兩混合, 再各加入10 μL DMEM充分混勻后室溫放置(溶液A)。將10 μL DMEM與0.3 μL的轉(zhuǎn)染試劑(濃度為0.8 mg/mL)充分混勻(溶液B), 室溫放置5min。將溶液A與B充分混勻, 室溫放置20min。轉(zhuǎn)染前為細(xì)胞換取新鮮培養(yǎng)基, 之后將轉(zhuǎn)染混合物加入混勻。37℃, 5%CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后換取新鮮培養(yǎng)基, 轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞檢測(cè), 使用Promega Dual-Luciferase system試劑盒進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)并記錄Renilla luciferase值。

2 結(jié)果

2.1 三疣梭子蟹PtNBC基因cDNA序列特征分析

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆獲得了三疣梭子蟹碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)基因cDNA全長(zhǎng), 命名為PtNBC, Gen-Bank登錄號(hào)為MW323548。cDNA全長(zhǎng)5308 bp, 包含570 bp的5′-UTR、3570 bp的ORF和1168 bp的3′-UTR, 編碼1189個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)到該基因的分子量為133.66 kD, 理論等電點(diǎn)(pI)為6.07。利用Signal4.1及SMART在線軟件預(yù)測(cè)分析氨基酸的結(jié)構(gòu)特征。Signal4.1未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽, SMART預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,PtNBC包含10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(Pfam: Band_3_cyto和HCO3_cotransp)。

2.2 PtNBC基因氨基酸序列同源性分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

三疣梭子蟹PtNBC氨基酸序列與其他物種的NBC(碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn))基因編碼的氨基酸進(jìn)行同源性比對(duì), 結(jié)果顯示, 該氨基酸序列與麥龍螯蝦(Cherax cainii)C. cainii_NBC1的同源性最高(85.37%); 其次是天空藍(lán)魔蝦(Cherax destructor)C.destructor_NBC1(84.63%)和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)Lv_NBC(81.30%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示, 三疣梭子蟹與凡納濱對(duì)蝦首先聚為一支,然后與麥龍螯蝦和天空藍(lán)魔蝦相聚, 與魚(yú)類、昆蟲(chóng)類較遠(yuǎn)(圖 2)。

圖2 NBC氨基酸序列NJ進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 NJ evolutionary tree of NBC amino acid sequence各物種名稱及GenBank登錄號(hào)(Name and GenBank accession number of each species): 三疣梭子蟹P. trituberculatus(MW323548); 凡納濱對(duì)蝦L. vannamei(AQX43455.1); 麥龍螯蝦C. caini(AJO70192.1); 天空藍(lán)魔蝦C .destructor(AJO70010.1); 小鼠M. musculus SLC4A4(AAI48293.2); 斑馬魚(yú)D. rerio SLC4A4a(NP_001030156.1); 短腳雙眼鉤蝦H. gigas NBC(LAC22142.1); 尼羅羅非魚(yú)O. niloticus SLC4A4(XP_005451600.1); 莫桑比克羅非魚(yú)O. mossambicus SLC4A4(BAJ49842.1); 虹鱒O. mykiss NBC(NP_001117797.1); 紫色球海膽S. purpuratus NBC(NP_001073019.1); 豚鼠C. porcellus SLC4A4(NP_001166501.1); 方鼻卷甲蟲(chóng)A. nasatum SLC4A8(KAB7498207.1);H. sapiens SLC4A7(XP_016863016.1); 苜蓿切葉蜂M. rotundata SLC4A4(XP_012151659.1); H. sapiens SLC4A4(AAF21718.1); H.sapiens SLC4A5(AAI09222.1); H. sapiens SLC4A8(AAH25994.1)

2.3 miR-139555及PtNBC基因組織表達(dá)分布分析

利用RT-PCR分析miR-139555及PtNBC基因在三疣梭子蟹不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況。如圖 3所示, miRNA-139555及PtNBC基因在肌肉、心臟、胃、腦、血細(xì)胞、眼柄、肝胰腺和鰓8個(gè)組織中均有表達(dá), miRNA-139555在鰓組織中表達(dá)量最高, 之后是在肌肉、胃和肝胰腺中表達(dá)較高, 與其他組織相比表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)。與miRNA-139555相同,PtNBC基因也在鰓組織中有最高表達(dá),在肌肉、胃和腦中的表達(dá)次于腦, 與其他組織相比表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 低鹽脅迫下鰓組織中miR-139555及PtNBC基因的表達(dá)

如圖 4所示, 在低鹽脅迫72h內(nèi), 與對(duì)照組相比, miR-139555整體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì), 在脅迫48h達(dá)到最高峰, 為對(duì)照組的4.9倍(P<0.05); miR-139555在脅迫24h及48h有下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì), 但與對(duì)照組相比, 均為顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)。而PtNBC基因在脅迫72h內(nèi)顯著下調(diào)表達(dá), 且各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均低于對(duì)照組, 在12h表達(dá)量最低, 為對(duì)照組的0.06倍(P<0.05); 在脅迫12—72h,PtNBC基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì), 但與對(duì)照組相比均顯著下調(diào)表達(dá)。綜上, 在低鹽脅迫下miR-139555與PtNBC基因在三疣梭子蟹鰓組織中的表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)。

2.5 miR-139555作用于PtNBC基因的mRNA的體外驗(yàn)證結(jié)果

利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-139555與PtNBC基因是否具有直接的作用關(guān)系。如圖 5所示, 與其他對(duì)照組相比, 僅在miRNA-139555與PtNBC-5′-UTR-wt共同轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的情況下, 熒光素酶的表達(dá)量顯著下降(P＜0.001), 表明PtNBC基因的表達(dá)被抑制。目的基因的突變型載體作為對(duì)照組, 排除了miRNA-139555與載體其他位點(diǎn)結(jié)合而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能。

3 討論

3.1 低鹽脅迫下miR-139555的表達(dá)分析

microRNA(miRNA)是一類具有重要功能的非編碼小分子RNA, 能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá), 在生物抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22—24]。為了探索miRNA在三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)中的作用, 基于前期對(duì)三疣梭子蟹低鹽脅迫前后鰓組織樣品的高通量miRNA測(cè)序分析, 我們篩選到一個(gè)在低鹽脅迫下顯著差異表達(dá)的、新預(yù)測(cè)的miRNA, 命名為miRNA-139555。本研究分析了miRNA-139555的組織表達(dá)分布及低鹽脅迫下在鰓組織中的表達(dá)規(guī)律。我們發(fā)現(xiàn)miRNA-139555在鰓組織中的表達(dá)明顯高于其他組織, 且低鹽脅迫后鰓組織中的miR-139555呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì), 在48h表達(dá)量最高, 相較于對(duì)照組上調(diào)4.9倍(圖 4)。鰓被認(rèn)為是甲殼類離子交換和滲透調(diào)節(jié)的主要器官[25]。miR-139555在鰓中高表達(dá)且受低鹽脅迫誘導(dǎo), 表明其可能在三疣梭子蟹滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

圖4 低鹽脅迫下miR-139555及PtNBC在三疣梭子蟹鰓組織中的表達(dá)Fig. 4 Expression of miR-139555 and PtNBC in the gills of P. trituberculatus under low salt stress

3.2 miR-139555可調(diào)控靶基因PtNBC的表達(dá)

已有研究表明, 鹽度變化可誘導(dǎo)水生動(dòng)物體內(nèi)某些miRNA差異表達(dá), 而這些miRNA的靶基因?yàn)闈B透調(diào)節(jié)相關(guān)基因[26,27]。本研究預(yù)測(cè)到miR-139555的潛在靶基因?yàn)殡x子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的PtNBC基因。該基因cDNA全長(zhǎng)5308 bp, 編碼1189個(gè)氨基酸。Signal4.1未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽, 表明PtNBC不是分泌蛋白。SMART預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,PtNBC基因含有10個(gè)TM結(jié)構(gòu)域, 和以往報(bào)道的SLC4家族成員普遍含有10－14個(gè)TM結(jié)構(gòu)域一致[28]。并且與多數(shù)NBC1基因相同, 包含2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(Pfam: Band_3_cyto和HCO3_cotransp)。進(jìn)化樹(shù)分析顯示,C. destructor_NBC1與PtNBC進(jìn)化關(guān)系最接近,該基因含有12個(gè)TM區(qū)域, 其中10個(gè)TM區(qū)域與PtNBC完全相同[29]。

王萍等[30]對(duì)青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)的研究表明, slc4a4(NBC)基因在主要組織中泛表達(dá)。在本研究中,PtNBC基因也顯示泛組織表達(dá)的模式(圖 3)。然而, 值得注意的是, 與miR-139555相同,PtNBC基因也在鰓組織中具有最高的表達(dá)。并且在PtNBC基因相對(duì)高表達(dá)的組織中(如肌肉、胃等), miR-139555也有較高表達(dá), 顯示了該基因和miR-139555具有組織共定位的趨勢(shì), 該現(xiàn)象與我們預(yù)測(cè)的miR-139555的靶基因?yàn)镻tNBC基因相符。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, miR-139555作用于PtNBC基因mRNA的5′UTR區(qū)。以往的多數(shù)研究關(guān)注miRNA與靶基因3′UTR結(jié)合發(fā)揮調(diào)控功能, 但隨著對(duì)miRNA調(diào)控機(jī)制研究的不斷深入, 也有不少關(guān)于miRNA靶定基因5′UTR[31]和ORF[32]區(qū)域參與調(diào)控基因表達(dá)的報(bào)道。例如: Wigar等[33—35]研究發(fā)現(xiàn),let-7能夠靶定lin-41 mRNA 5′UTR區(qū), 影響斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育[36]。另外, 多個(gè)研究證實(shí)miRNA可通過(guò)靶定相關(guān)基因的5′UTR或ORF, 抑制或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)?；谝陨舷嚓P(guān)報(bào)道, 為進(jìn)一步證明miR-139555與其潛在靶基因PtNBC間的調(diào)控關(guān)系, 我們?cè)诩?xì)胞水平開(kāi)展了體外雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明, 在體外細(xì)胞水平, miR-139555能夠直接抑制PtNBC基因的表達(dá), 與低鹽脅迫下兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)一致(圖 5)。

圖3 miR-139555及PtNBC在三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)Fig. 3 Expression of miR-139555 and PtNBC in different tissues of P. trituberculatusM. 肌肉muscle; H. 心臟heart; S. 胃stomach; Br. 腦brain; E. 眼柄optic stalk; B. 血細(xì)胞blood cell; He. 肝胰腺hepatopancreas; G. 鰓gill; 不同小寫(xiě)字母代表表達(dá)量的差異顯著性Different lowercase letters indicated significant differences (P<0.05); 下同The same spplues below

圖5 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)miR-139555與PtNBC-5′UTR的相互作用Fig. 5 Dual luciferase report to detect the interaction between miR-139555 and PtNBC-5′UTR

3.3 miR-139555及其靶基因PtNBC在滲透壓調(diào)節(jié)中的作用

多數(shù)研究表明, miRNA通過(guò)與靶基因的完全或不完全互補(bǔ)性結(jié)合降解或沉默靶基因, 從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá), 兩者為負(fù)調(diào)控關(guān)系[37]。比如尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)通過(guò)下調(diào)鰓組織中miR-429的表達(dá)使?jié)B透脅迫轉(zhuǎn)錄因子(OSTF1)相應(yīng)的上調(diào)表達(dá), 來(lái)適應(yīng)高鹽脅迫[38]; 在低鹽脅迫下, 刺參(Apostichopus japonicas)Aja-miR-22上調(diào)表達(dá), 其靶基因(棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白EMAP)下調(diào)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果, 在低鹽脅迫12h,三疣梭子蟹鰓組織中miR-139555上調(diào)表達(dá), 之后與對(duì)照組相比, 處于持續(xù)上調(diào)表達(dá)的狀態(tài); 而PtNBC在低鹽脅迫12h下調(diào)表達(dá), 之后持續(xù)處于下調(diào)表達(dá)的狀態(tài), 兩者表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)典型的負(fù)相關(guān)(圖 4)。該結(jié)果同樣也支持miR-139555的靶基因?yàn)镻tNBC基因。

Deigweiher等[39]的研究表明, 在海水硬骨魚(yú)類中,NBC1基因定位在鰓上皮細(xì)胞基底質(zhì)膜上, 主要作用是協(xié)調(diào)向體內(nèi)轉(zhuǎn)入Na+和HCO3–, 與水生生物的滲透壓調(diào)節(jié)或鹽度適應(yīng)密切相關(guān)。Ali等[29]對(duì)C.cainii和C. destructor兩種淡水龍蝦的研究表明,NBC基因在兩個(gè)物種中均有5個(gè)亞型且均具有參與調(diào)節(jié)鹽度的功能。目前, 除PtNBC基因外, 在三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組中我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他與鹽度適應(yīng)相關(guān)NBC基因亞型。梁從飛等[40]在尼羅羅非魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn), NBC基因在高鹽脅迫下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì), 而我們的結(jié)果顯示PtNBC基因在低鹽脅迫后顯著下調(diào)表達(dá), 兩個(gè)研究的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。我們推測(cè), 低鹽水體中Na+的濃度較低, 為了維持體內(nèi)滲透壓平衡, 三疣梭子蟹通過(guò)microRNA途徑主動(dòng)降低PtNBC基因的表達(dá)而以減少Na+的吸收, 從而維持體內(nèi)外的滲透壓平衡。

總而言之, 我們初步證實(shí)了PtNBC基因是miR-139555的靶基因, miR-139555可能通過(guò)調(diào)控鰓上皮細(xì)胞PtNBC基因的表達(dá)而發(fā)揮重要的滲透壓調(diào)節(jié)功能。本研究嘗試從轉(zhuǎn)錄后水平探究三疣梭子蟹的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制, 有助于系統(tǒng)解析該物種鹽度適應(yīng)機(jī)制, 同時(shí)為三疣梭子蟹耐鹽良種的鑒定和培育提供新的思路。