持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦生長、消化酶活性與免疫指標(biāo)的影響

何乃娟 阮國良 劉玉林 方 劉 王 乾 付運(yùn)銀 李生瑄 李青松

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心, 荊州 434025)

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)俗稱小龍蝦,具有適應(yīng)性廣、食性雜、繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)和營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)[1], 是我國當(dāng)前養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)淡水甲殼類動物[2]。但是, 在長江中下游等地的蝦-稻共作與池塘精養(yǎng)中, 克氏原螯蝦在夏季養(yǎng)殖過程中極易受到持續(xù)性的高溫脅迫, 如在江漢地區(qū)的蝦-稻共作系統(tǒng)中其7月份的平均水溫和瞬時水溫分別高達(dá)31.4℃和39.7℃[3]?？耸显r生長的最佳水溫為21—27℃[4—6], 高溫脅迫可引起該蝦代謝失衡和免疫紊亂從而最終影響其正常生長甚至存活[7,8]。不僅如此, 一些研究表明高溫脅迫對螯蝦類動物的生存、攝食、生長、繁殖及抗逆性等均可造成廣泛的負(fù)面影響[9—12]。然而, 在目前有關(guān)蝦類及魚類高溫脅迫研究中, 多是采用急性試驗的方法[7,8,13—15], 較長周期的高溫脅迫試驗不僅更能反映機(jī)體對環(huán)境壓力的真實(shí)響應(yīng), 而且更符合養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)際[9]。為此, 本試驗以克氏原螯蝦為對象, 通過1℃/d的緩慢升溫后研究不同高水溫的長期脅迫對該蝦生長、消化及免疫功能的影響, 旨在探明該蝦對持續(xù)高溫脅迫的適應(yīng)性及響應(yīng)機(jī)制從而為其健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與養(yǎng)殖管理

克氏原螯蝦幼蝦[均重(7.19±0.29) g, 均長(5.94±0.19) cm]由荊州市萬金小龍蝦養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供, 試驗蝦在室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)的養(yǎng)殖缸(60 cm×40 cm×35 cm)中暫養(yǎng)7d后進(jìn)行正式試驗。暫養(yǎng)期間, 水溫保持在(24.0±1.5)℃, 溶解氧>5 mg/L, pH為7.0—8.5,光周期為光照12h﹕暗12h。每天(8:30和17:30)投喂商品配合飼料2次, 日投喂量為該蝦體重的3%。飼喂2h后, 用虹吸管吸出殘餌和糞便, 以曝氣自來水作為補(bǔ)充水源, 日換水量為1/3—2/3。

1.2 試驗分組及動物處理

在暫養(yǎng)結(jié)束后, 將活力好、大小相近的克氏原螯蝦平均分為4組, 根據(jù)克氏原螯蝦生長的適宜和熱脅迫溫度范圍, 設(shè)置高溫梯度水平為29℃、32℃和35℃, 每組3個重復(fù), 每個重復(fù)養(yǎng)殖22尾蝦, 試驗開始時測量其體長、體重。第1組(對照組)繼續(xù)保持暫養(yǎng)水溫24℃, 其他3個高溫脅迫組養(yǎng)殖缸的水溫以1℃/d的速度從24℃開始分別緩升至目標(biāo)溫度。各高溫脅迫組的溫度采用加熱棒進(jìn)行持續(xù)的恒溫控制。試驗期間, 所有處理組的其他養(yǎng)殖條件保持一致, 各脅迫組在換水前將所換水充分曝氣并升至相應(yīng)的目標(biāo)溫度。持續(xù)高溫脅迫養(yǎng)殖試驗周期為30d, 試驗結(jié)束后從各組取所需組織。

1.3 樣本收集

在試驗結(jié)束后禁食24h, 對每組蝦進(jìn)行計數(shù)和體重、體長測定, 并計算增重及特定生長率。每個處理隨機(jī)取6尾蝦, 用1 mL無菌注射器從蝦圍心腔處抽取0.5 mL全血放入無菌EP管中, 4℃靜置過夜,于4℃、12000 r/min離心15min, 取上清置于–80℃保存?zhèn)溆? 然后, 迅速冰上解剖并取出肝胰腺、胃和鰓等組織放入無菌EP管和無酶EP管中–80℃保存, 分別用于酶活性及基因表達(dá)測定。

1.4 指標(biāo)測定

存活與生長 每天觀察蝦的存活、攝食與生長情況, 30d的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后統(tǒng)計其存活率與生長率。存活率(SR, %)=(Nt/N0)×100; 增重率(WGR,%)=(Wt–W0)/W0×100; 特定生長率(SGR, %/d)=(lnWt–lnW0)/t×100; 餌料系數(shù)(FCR)=F/(Wt–W0)。式中,N0和Nt分別為試驗開始時和結(jié)束后的活蝦數(shù)量(尾),W0和Wt分別為試驗開始時和結(jié)束后的蝦體重(g),t為試驗天數(shù)(d),F為投餌量。

血淋巴免疫指標(biāo)凍存血淋巴置于4℃冰箱解凍, 血藍(lán)蛋白(HC)含量用稀釋至1%的血淋巴采用紫外分光光度計測定[16], 酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒進(jìn)行測定。

消化酶活性及肝胰腺免疫指標(biāo)凍存組織于冰上解凍, 取其肝胰腺和胃各0.1 g, 加入0.9 mL預(yù)冷生理鹽水在冰水浴中用組織研磨機(jī)制成10%勻漿, 于4℃、3000 r/min離心10min, 取上清立即進(jìn)行3種消化酶、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)的測定, 所有指標(biāo)均采用南京建成生物工程有限公司試劑盒進(jìn)行測定。

基因表達(dá)取肝胰腺、鰓組織的總RNA并電泳檢測RNA質(zhì)量, 使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行mRNA的純化和cDNA的合成, cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。肝胰腺和鰓中熱應(yīng)激蛋白基因(HSP70)的表達(dá)水平由熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測, 內(nèi)參基因為18S RNA。擴(kuò)增引物參照Guo等[8]HSP70F: 5′-GTTG ACCAAGATGAAGGAGAC-3′、HSP70R: 5′-CTGA CGCTGAGAGTCGTTG-3′和18S F: 5′-CTGTGATGC CCTTAGATGTT-3′、18S R: 5′-GCGAGGGGTA GAACATCCAA-3′, 引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。使用SYBR?Premix DimerEraser?Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒在StepOnePlus Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行分析, 其反應(yīng)體系如下: SYBR?Premix DimerEraser(2×) 10 μL, cDNA模板10 ng, ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL, 10 μmol/L正反向引物各0.6 μL, 使用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊到20 μL; 反應(yīng)條件: 95℃ 30s, 95℃5s、56℃ 30s、72℃ 30s, 40個循環(huán)。HSP70基因的相對表達(dá)采用2–??Ct法進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)及多重比較(Duncan’s法), 分別以P<0.05和P<0.01表示差異顯著或極顯著。

2 結(jié)果

2.1 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦存活與生長的影響

在試驗結(jié)束后, 4個處理組的平均成活率分別為100%、95.45%、79.55%和63.63%, 因而隨著持續(xù)脅迫溫度的升高克氏原螯蝦的存活率顯著下降(P<0.05)。如表 1所示, 克氏原螯蝦在為期30d的實(shí)驗養(yǎng)殖條件下, 隨著脅迫溫度的升高其終末體重(FBW)、終末體長(FBL)、WGR和SGR等均呈先升后降的趨勢且在29℃時均顯著高于其他3個溫度組(P<0.05); 32℃組與24℃對照組的各項生長性能指標(biāo)無顯著差異(P>0.05), 而35℃組的各項生長性能指標(biāo)與24℃對照組相比均顯著降低(P<0.05)。

表1 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦生長性能的影響Tab. 1 Effects of sustained high-temperature stress on growth performance of P. clarkii

2.2 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦消化酶活性的影響

如圖 1所示, 3種消化酶活性隨溫度的升高出現(xiàn)先升后降的變化趨勢。29℃高溫組的胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均達(dá)到峰值并顯著高于其他3個溫度組(P<0.05); 與24℃對照組相比, 32℃高溫組淀粉酶、脂肪酶的活性顯著升高(P<0.05)而胃蛋白酶活性無顯著變化(P>0.05), 35℃高溫組淀粉酶、脂肪酶的活性無顯著變化(P>0.05)而胃蛋白酶活性顯著下降(P<0.05)。

圖1 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦消化酶活性的影響Fig. 1 Effects of sustained high-temperature stress on digestive enzyme activities of P. clarkii不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05); 下同Different small letters indicate significant difference (P<0.05); the same applies below

2.3 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦免疫指標(biāo)的影響

如圖 2所示, 各高溫組(29℃、32℃和35℃)HC含量(32℃除外)、ACP活性及AKP活性較24℃對照組均顯著降低(P<0.05); 在4個處理中, 隨著溫度的上升AST活性和ALT活性逐步顯著上升, 且在35℃時達(dá)到最高(P<0.05)。

圖2 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦血淋巴非特異性免疫指標(biāo)的影響Fig. 2 Effects of sustained high temperature stress on nonspecific immune indices in hemolymph of P. clarkii

如圖 3所示, 29℃組的T-AOC活性顯著低于24℃對照組和32℃組(P<0.05)而其他三組的TAOC活性差異不顯著(P>0.05); 29℃組的T-SOD活性均顯著低于其他三組(P<0.05), 32℃組的T-SOD活性顯著高于24℃對照組而35℃組的T-SOD活性與24℃對照組相比無顯著差異(P>0.05); 丙二醛(MDA)含量隨溫度上升而逐步顯著升高(P<0.05)。

圖3 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響Fig. 3 Effects of sustained high-temperature stress on antioxidant indices in hepatopancreas of P. clarkii

如圖 4所示,HSP70基因在35℃時表達(dá)量最高且與其他三組的差異極顯著(P<0.01); 與對照組相比, 29℃時兩組織中HSP70基因表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)而32℃時該基因的表達(dá)無顯著上升(P>0.05)。

圖4 持續(xù)高溫脅迫后克氏原螯蝦不同組織HSP70基因的相對表達(dá)Fig. 4 The relative expression of of HSP70 gene in different tissues of P. clarkii after sustained high-temperature stress

3 討論

3.1 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦生長與消化的影響

在水生環(huán)境中, 溫度是影響蝦蟹等甲殼動物生存、代謝、免疫和細(xì)胞生理反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)境因素之一[7,17], 而克氏原螯蝦作為一種變溫動物, 對環(huán)境溫度變化的響應(yīng)尤為明顯[18]。本研究的數(shù)據(jù)顯示,脅迫溫度越高, 克氏原螯蝦的成活率越低; 當(dāng)克氏原螯蝦長期處于29℃的溫度時, 其生長性能顯著高于其他組; 而32℃以上的持續(xù)高溫則對其生長、消化均顯著不利。一些研究表明, 克氏原螯蝦幼體生長發(fā)育的適宜溫度為25℃左右, 但最高不能超過30℃[5,19]; 謝偉[6]的養(yǎng)殖試驗表明30℃高溫可一定程度的促進(jìn)該蝦幼蝦(初始均重5.42 g以上)的生長;Huner等[20]發(fā)現(xiàn)水溫高于30℃時克氏原螯蝦停止攝食, 高于32.2℃時則停止生長。此外, 對紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)的70d養(yǎng)殖試驗表明, 在16—32℃范圍內(nèi)該蝦的存活率均在90%以上, 且水溫28℃是其最適生長溫度[21]。本研究中的最適生長溫度與上述其他研究相一致, 但在此溫度下長期生活的克氏原螯蝦存在較大的健康風(fēng)險。

本研究顯示, 3種消化酶在29℃時表現(xiàn)出最大活性且顯著高于其他3個溫度組(P<0.05), 這表明該蝦的生長與消化功能存在明顯的一致性。消化酶活性的高低代表機(jī)體對營養(yǎng)素的消化能力[22—24]且與攝食之間存在相互促進(jìn)的交互作用[23]。Croll和Watts[25]的研究顯示, 在8—32℃內(nèi)克氏原螯蝦的攝食率和排便率隨溫度上升而提高, 且在高溫下該蝦的攝食和排便比另一種原螯蝦屬的Procambarus zonangulus更加旺盛。因而, 在較高溫度條件下, 克氏原螯蝦可大量攝食并通過較高的消化酶活性分解主要營養(yǎng)素而獲得較高生長性能。另外在本研究中, 32—35℃引起3種消化酶活性的顯著下降, 這可能是由于過高的養(yǎng)殖水溫超出了機(jī)體的耐受范圍并引起代謝紊亂, 從而抑制了消化酶分泌及其活性[26]。

3.2 持續(xù)高溫脅迫對克氏原螯蝦免疫指標(biāo)的影響

非特異性免疫系統(tǒng)是無脊椎動物抵御脅迫的唯一防線[17]。甲殼類動物的血藍(lán)蛋白兼具攜氧與免疫功能, 水溫升高不利于血藍(lán)蛋白與氧結(jié)合[27],外來脅迫可誘導(dǎo)血藍(lán)蛋白的酚氧化酶免疫活性和抗菌肽活性[27,28]。在本研究中, 當(dāng)克氏原螯蝦處于29℃及以上的高水溫時其血淋巴血藍(lán)蛋白含量顯著下降, 這表明持續(xù)高溫脅迫可能使該蝦血氧親和力與免疫功能同時受損。AKP和ACP是兩種重要的代謝調(diào)節(jié)酶[8], 其在甲殼動物的非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[29,30]。一些研究顯示, 溫度升高會顯著降低克氏原螯蝦ACP和AKP活性, 從而損害蝦的免疫功能[31,32], 本研究結(jié)果表明隨著溫度上升血淋巴中的ACP和AKP活性顯著降低, 這與上述其他研究一致; 此外, 脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)[33]和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[34]中也有類似結(jié)果。

血淋巴中ALT和AST的活性可反映肝胰腺組織損傷程度[35], 在正常情況下肝胰腺中的ALT和AST僅少量釋放于血淋巴中, 但肝胰腺的組織病變可導(dǎo)致大量轉(zhuǎn)氨酶被釋放[36]。在本研究中, 克氏原螯蝦持續(xù)高溫組的血淋巴中ALT和AST活性較常溫組均顯著上升, 且其活性與水溫高低呈顯著正相關(guān)。這表明, 持續(xù)高溫脅迫可能使該蝦的肝細(xì)胞在受損后其膜的通透性增加, 從而導(dǎo)致這兩種轉(zhuǎn)氨酶大量逸出肝胰腺。

水生生物在長期進(jìn)化過程中形成了抵御氧化損傷的抗氧化系統(tǒng)[14,37], 過量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的產(chǎn)生會激活機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)從而導(dǎo)致抗氧化酶類成分發(fā)生改變[38,39]。脂質(zhì)過氧化物(Lipid peroxide, LPO)被認(rèn)為是ROS氧化脂質(zhì)的產(chǎn)物之一[40], MDA是脂質(zhì)過氧化代謝終產(chǎn)物, 其含量高低作為氧化損傷的指標(biāo), 可反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞的受自由基攻擊程度及受損的嚴(yán)重程度[41];SOD是一種重要的抗氧化酶, 通過專一性催化超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為分子氧(O2)和過氧化氫(H2O2), H2O2再經(jīng)過氧化氫酶(Catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)等的催化生成水和O2從而使活性氧自由基得以清除;T-AOC是衡量所有酶促抗氧化劑(如SOD、CAT和GPx)累計作用的一個總體表現(xiàn)指標(biāo)[42,43]。一些關(guān)于螯蝦的其他脅迫研究表明, 窄爪螯蝦(Astacus leptodactylus)在長期饑餓過程中其SOD活性與MDA水平分別顯著下降和顯著上升[38], 而克氏原螯蝦在環(huán)境毒物有機(jī)硅處理后其肌肉中的SOD活性與MDA水平呈不同程度的上升[44,45]。本研究結(jié)果顯示, 肝胰腺的總抗氧化能力(T-AOC)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性在29℃時最低且在35℃時也略低于常溫組; 持續(xù)脅迫溫度越高其MDA水平也顯著越高。因此, 遭受環(huán)境脅迫的螯蝦類會啟動氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致MDA水平上升。但是, SOD活性的升降可能與脅迫的類型、條件和程度等有關(guān),Guo等[8]的急性高溫脅迫試驗結(jié)果顯示, 克氏原螯蝦在6—48h內(nèi)其SOD活性顯著升高, 但在72h時恢復(fù)正常水平。然而, 從本研究的總體結(jié)果可初步推斷, 持續(xù)高溫應(yīng)激導(dǎo)致了克氏原螯蝦抗氧化應(yīng)激能力下降與MDA有害物在體內(nèi)的積累。

HSP70通過促進(jìn)內(nèi)源性過氧化物酶活性來應(yīng)對氧化應(yīng)激[46], 從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷[47]。已有研究表明, 該基因的表達(dá)主要由熱處理誘導(dǎo)所致[48]。高溫脅迫可導(dǎo)致蝦體內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)含量增加, 從而引發(fā)HSP70基因的過表達(dá), 而被溫度誘導(dǎo)的熱應(yīng)激蛋白最終用以修復(fù)因高溫脅迫損傷的蛋白質(zhì)[49]。在適宜溫度條件下螯蝦HSP70基因的表達(dá)量較低, 但高溫環(huán)境下會使其表達(dá)量顯著升高[8,50]; Mohamad等[47]在對羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)進(jìn)行30d的高溫脅迫處理后,發(fā)現(xiàn)其肝胰腺中HSP70基因的表達(dá)量在35℃時較28℃顯著上升。在本研究中, 肝胰腺和鰓組織中HSP70基因在29℃時顯著上升, 且在35℃時其表達(dá)量顯著高于其他處理組, 這與上述其他的研究結(jié)果類似。因此可以推斷,HSP70表達(dá)升高可能是克氏原螯蝦響應(yīng)水溫升高的一種應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。

綜上所述, 相比于24℃的適宜生活溫度, 29℃的持續(xù)高溫雖可顯著促進(jìn)克氏原螯蝦的生長與消化, 但對其免疫及抗氧化功能顯著不利, 而32℃以上的持續(xù)高溫脅迫則對其存活、生長與消化、免疫及抗氧化功能均造成顯著的負(fù)面影響。為此, 在夏季的養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 有必要對持續(xù)高溫的養(yǎng)殖水環(huán)境進(jìn)行有效的綜合調(diào)控, 如采取加深水位、監(jiān)測和調(diào)節(jié)水質(zhì)、維護(hù)良好的水草生態(tài)空間等生態(tài)措施以降低克氏原螯蝦的棲息水溫; 同時, 通過營養(yǎng)免疫和精準(zhǔn)投喂等營養(yǎng)調(diào)控方式來提高該蝦對持續(xù)高溫脅迫的免疫抵御能力。