響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相萃取沙蔥中總黃酮的工藝條件

呂博威，王翠芳，霍紅雁，郭佳星，張繼星，張智勇，倪娜*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028015)

沙蔥(AlliummongolicumRegel)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物，廣泛分布于我國內(nèi)蒙古、甘肅、陜西等地的草原、荒漠或干旱地帶。沙蔥具有較強(qiáng)的抗病性和適應(yīng)性，易栽培，在荒漠地區(qū)具有重要的生態(tài)價(jià)值[1]。目前，學(xué)術(shù)界關(guān)于沙蔥的研究主要集中于沙蔥的育種與栽培[2-4]、組織培養(yǎng)[5]、營養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值開發(fā)[6-7]、有效成分提取[8]等方面。沙蔥作為一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味鮮爽的地方特色蔬菜，深受北方消費(fèi)者喜愛，在甘肅、內(nèi)蒙地區(qū)已形成了多個(gè)沙蔥種植基地。目前，沙蔥的食用方式主要以鮮食為主，包括清炒、涼拌、拌餡兒、涮食等，因其獨(dú)特的風(fēng)味，還可制成腌沙蔥、沙蔥醬、下飯菜等調(diào)味品。

黃酮類化合物存在于所有維管植物的葉、根、莖、花和果實(shí)中，又稱黃酮體、黃堿素，是植物的次生代謝產(chǎn)物[9]。黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管和殺蟲等多種生理生化活性[10-12]。作為沙蔥的主要活性成分之一，黃酮在制備沙蔥源功能性調(diào)味品方面起重要作用，沙蔥中黃酮類化合物的研究尤為重要。植物中提取總黃酮的方法多采用乙醇浸提法、超聲法和微波法，然而這些方法或浸提時(shí)間長,或提取率低,或生產(chǎn)造價(jià)高，均不適于規(guī)?；a(chǎn)。同時(shí)，超聲提取易造成分子中C-C雙鍵斷裂，導(dǎo)致化合物不穩(wěn)定，而微波法由于設(shè)備的安全性問題可能對健康造成不利影響[13]，因此新型黃酮提取技術(shù)倍受人們關(guān)注[14]。研究表明親水性有機(jī)物的水溶液在一定條件下可形成雙水相，雙水相萃取技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)雙相中物質(zhì)的提取和分離[15]，具有提取率高,易于放大生產(chǎn),對操作環(huán)境要求較低,可連續(xù)性操作,綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在植物活性成分提取上具有較大的應(yīng)用潛力。張麗等[16]采用聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4雙水相體系萃取分離了紅高粱色素，優(yōu)化后的萃取率可達(dá)98.25%。曹小燕等[17]利用超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相法分離了油菜籽粕黃酮，其平均提取量為(5.53±0.03) mg/g。采用雙水相體系提取沙蔥總黃酮的研究尚未見報(bào)道。

本文以乙醇-K2HPO4雙水相體系為基礎(chǔ)探究沙蔥總黃酮的萃取條件，采用響應(yīng)面法優(yōu)化主要工藝參數(shù)以提高黃酮萃取率，為沙蔥的綜合利用和總黃酮的產(chǎn)量提供了理論依據(jù)，為研發(fā)營養(yǎng)型調(diào)味品提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙蔥干粉：實(shí)驗(yàn)室自制；無水乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、K2HPO4、NaOH、Al(NO3)3、NaNO2等：均為分析純試劑。

UV-5500PC紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 雙水相相圖繪制

利用Albertsson[18]的濁點(diǎn)滴定法測定雙水相體系的組成，并繪制雙水相相圖。稱取定量K2HPO4(ms)溶于去離子水(mw)中，利用滴定管緩慢滴加無水乙醇并振蕩，直至溶液出現(xiàn)渾濁，記錄滴加的乙醇質(zhì)量(mei)，記錄此時(shí)體系總質(zhì)量(mi)。加入適量去離子水(mwj)，使溶液澄清，記錄此時(shí)體系總質(zhì)量(mj)。再次向錐形瓶中滴加無水乙醇，直至再次達(dá)到渾濁，如此反復(fù)操作，記錄每次達(dá)到渾濁時(shí)乙醇和K2HPO4在系統(tǒng)中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算公式如下：

以乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，即可得一條雙節(jié)線的相圖。

1.3 黃酮含量測定方法

參考郭磊等[19]、王梅霖等[20]的方法并略作修改。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.4 mg以95%乙醇定容，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.416 mg/mL。精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入5% NaNO2溶液0.3 mL，靜置6 min；加入0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，靜置6 min后加入4 mL NaOH溶液，用蒸餾水補(bǔ)齊至10 mL，充分振蕩后靜置3 min，測定吸光值(A508 nm)。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以A508 nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為C=0.8848A-0.0052，R2=0.9926，表明0.000～0.416 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測液中的黃酮含量。

1.4 沙蔥黃酮粗提液的制備及含量測定

1.4.1 粗提液制備

沙蔥黃酮的粗提方法參考薩茹麗[21]的方法并略作修改。沙蔥干粉中按1∶10(g/mL)的比例加入石油醚進(jìn)行脫脂、脫色處理，待石油醚全部揮發(fā)后，按1∶25(g/mL)的比例加入75%乙醇后超聲處理15 min，真空抽濾去殘?jiān)?，濾液定容后于4 ℃冷藏。

1.4.2 雙水相萃取

上述樣品中按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求加入K2HPO4、無水乙醇和蒸餾水，充分振蕩均勻后放入分液漏斗靜置，達(dá)到相分離。

1.4.3 黃酮萃取率計(jì)算

在1.4.2中的雙水相體系上下相分離并稱量體積，用1.3中所述方法測量上下相液體的黃酮含量并進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

式中：m1為上相液體黃酮含量，mg；m2為下相液體黃酮含量，mg。

1.5 雙水相萃取單因素試驗(yàn)

1.5.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)

雙水相體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為10%、15%、20%、25%、30%、35%，固定沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。

1.5.2 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)

將雙水相體系中K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為10%、15%、20%、25%、30%、35%，固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

1.5.3 沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)

將雙水相體系中沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為10%、14%、18%、22%、26%、30%，固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)方案的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化黃酮提取工藝條件。以黃酮萃取率為響應(yīng)值，以乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素為自變量，各因素設(shè)置3個(gè)水平，水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 2019繪圖，并運(yùn)用Design Expert 11軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、優(yōu)化、模型建立與檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相相圖

乙醇-K2HPO4雙水相相圖見圖1，以曲線為界，下方為單相區(qū)，上方為兩相區(qū)。當(dāng)選取偏離臨界點(diǎn)(即曲線上的點(diǎn))的適宜數(shù)值時(shí)，易于形成雙水相體系[22]。通過調(diào)整乙醇、水和K2HPO4的添加量同時(shí)記錄上下相質(zhì)量的變化發(fā)現(xiàn)：固定乙醇質(zhì)量時(shí)，下相體積隨著K2HPO4添加量的增多而增大，直至飽和；而固定乙醇和鹽的質(zhì)量時(shí)，水必須維持在適宜的范圍內(nèi)，否則將不能形成雙水相或過早進(jìn)入飽和狀態(tài)；當(dāng)K2HPO4溶液質(zhì)量被固定時(shí)，加入過量的乙醇會(huì)造成K2HPO4無法溶解，過少則不能形成雙水相。

圖1 雙水相相圖Fig.1 Aqueous two-phase system diagram

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃酮萃取率的影響見圖2。

圖2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對沙蔥總黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

由圖2可知，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于20%時(shí)，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，沙蔥中總黃酮的萃取率逐漸升高，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%時(shí)，萃取率達(dá)到峰值，而后乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí)萃取率下降。這是因?yàn)辄S酮苷具有親水作用，乙醇作為一種極性溶液，過高或過低濃度的乙醇不利于沙蔥總黃酮的溶解[23]。當(dāng)乙醇濃度較低(低于20%)時(shí)，隨著上相中乙醇質(zhì)量的增加，體系分相能力也逐漸增強(qiáng)，而黃酮在乙醇中的溶解度較在水中時(shí)大，因此其萃取率增加；而當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高(大于20%)時(shí)，溶液的極性降低，而此時(shí)其他有機(jī)物的溶出量增加，從而抑制了黃酮的萃取。因此，乙醇的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇20%。

2.2.2 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖3可知，當(dāng)乙醇濃度和沙蔥粗提液濃度一定時(shí)，黃酮的萃取率隨著K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到25%時(shí)，黃酮萃取率最高，而后萃取率隨之下降。分析其萃取率下降的原因可能是出現(xiàn)了鹽溶液過飽和現(xiàn)象。雙水相體系中無機(jī)鹽類物質(zhì)的添加可以改變兩相中成相物質(zhì)的組成，當(dāng)加入K2HPO4質(zhì)量過多時(shí)，雙水相體系中鹽溶液過飽和導(dǎo)致鹽析現(xiàn)象的出現(xiàn)，沙蔥黃酮隨著鹽從體系中一起沉淀出來，從而導(dǎo)致黃酮萃取率下降。

圖3 K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對沙蔥總黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.2.3 沙蔥溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖4可知，在乙醇和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，黃酮萃取率隨著沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高，當(dāng)沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到18%時(shí)，黃酮萃取率達(dá)到最大值，而后繼續(xù)添加粗提液時(shí)黃酮萃取率基本保持不變。從節(jié)約材料方面考慮，確定最佳沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%。

圖4 沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對沙蔥總黃酮萃取率的影響Fig.4 Effect of the mass fraction of Allium mongolicum Regel crude extracts on the extraction rate of total flavonoids from Allium mongolicum Regel

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化及分析

2.3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，在乙醇-K2HPO4雙水相體系的基礎(chǔ)上，對乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，方案及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The test design and results

續(xù) 表

2.3.2 模型擬合

以總黃酮萃取率(R1)為響應(yīng)值，得到回歸方程R1=97.40+3.65A+2.60B+0.68C-1.96AB +0.97AC-0.33BC-4.63A2-4.93B2-2.85C2，并進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

該模型顯著性良好(P<0.01)，失擬項(xiàng)的P=0.107>0.05，不顯著，說明該模型成立。R2用來代表回歸方程的可靠性，R2值越接近1，方程的可靠性越高，該模型的回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9898，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9766，R2和RAdj2數(shù)值較高且接近，說明模型具有較高的準(zhǔn)確性和通用性，變異系數(shù)值C.V.=0.88%<10.00%，可以用此回歸方程來預(yù)測沙蔥總黃酮的最佳萃取工藝條件。模型的交互項(xiàng)AC、BC差異不顯著(P>0.05)，一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)C2對沙蔥總黃酮萃取量具有顯著影響(P<0.05)，一次項(xiàng)A、B以及二次項(xiàng)A2、B2對沙蔥總黃酮萃取量均有極顯著的影響(P<0.01)。通過F值可以看出各因素對沙蔥總黃酮萃取率的影響程度，其順序依次為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)>K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)>沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)。

2.3.3 響應(yīng)面圖分析

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對沙蔥總黃酮萃取率的交互影響見圖5～圖7。由圖可以直觀地看出沙蔥總黃酮萃取率在試驗(yàn)范圍內(nèi)都有最大值，說明因素水平選擇范圍合理，趨勢明朗，能明顯反映出各因素對沙蔥總黃酮萃取率的影響[24-25]。響應(yīng)面曲線中，等高線為圓形表示因素之間的交互作用不強(qiáng)，為鞍形或橢圓形則表示因素之間的交互作用較強(qiáng)[26]。

由圖5～圖7可知，在交互作用的影響下，沙蔥總黃酮萃取率的變化趨勢相似，即先增加后減少。由圖5可知，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用對沙蔥總黃酮萃取率存在顯著影響。圖6中交互作用對萃取率的影響與圖5相似，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮萃取率呈先增加后減少的趨勢，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其影響更大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面更為陡峭，等高曲線更為密集[27]。由圖7可知，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用對沙蔥總黃酮萃取率的影響不顯著，這與表3中的P值分析一致。

2.3.4 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證

通過軟件對二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析預(yù)測，沙蔥-K2HPO4雙水相萃取沙蔥總黃酮最佳工藝條件為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)23.68%，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.93%，沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.79%。結(jié)合實(shí)際操作情況，將其最佳工藝條件修正為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，K2HPO4溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%，沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，在此條件下對建立的模型開展驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)置3組平行試驗(yàn)，獲得的沙蔥總黃酮實(shí)際萃取率為(98.13±0.20)%，理論預(yù)測值為98.36%，預(yù)測誤差不足1%，證實(shí)了預(yù)測模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

采用乙醇-K2HPO4雙水相體系萃取沙蔥總黃酮，先后利用了單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面分析構(gòu)建了沙蔥總黃酮萃取率與萃取條件的二次多項(xiàng)式模型，得到了沙蔥黃酮的最佳萃取參數(shù)，同時(shí)驗(yàn)證試驗(yàn)表明該模型擬合度較好。雙水相法萃取沙蔥總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%，沙蔥粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，總黃酮萃取率可達(dá)(98.13±0.20)%。雙水相萃取法具有萃取率高、成本低廉、簡單易行、綠色安全等優(yōu)勢，作為高效萃取沙蔥總黃酮的新方法，可為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。