35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑氣相色譜分析方法研究

王 進(jìn), 劉雪芬，潘光飛，廖文斌，林怡汝，張俊杰

(浙江禾本科技股份有限公司，浙江 溫州 325008)

精甲霜靈(metalaxyl-M)是甲霜靈的R手性異構(gòu)體，其活性要比S異構(gòu)體高20倍以上。精甲霜靈的作用機(jī)理與甲霜靈相似，都是通過滲透細(xì)胞膜抑制病原菌核糖體RNA聚合酶I的活性來抑制病核酸的生物合成[1-2]。精甲霜靈是一種廣譜殺菌劑，內(nèi)吸性強(qiáng)。當(dāng)藥劑噴施到作物上后，能被作物各個(gè)器官吸收并傳導(dǎo)，可起到保護(hù)和治療的作用。精甲霜靈對(duì)霜霉病菌、疫霉病菌和腐霉病菌引起的作物病害的治理效果突出[3]。單一藥劑的使用容易誘發(fā)病菌的抗藥性[4]，因此復(fù)配試劑經(jīng)常作為藥劑研發(fā)的重點(diǎn)。霜霉威鹽酸鹽(propamocarb hydrochloride)也是一種廣譜殺菌劑，可由霜霉威原藥經(jīng)鹽酸酸化制備得到，能夠抑制病菌細(xì)胞膜成分的卵磷脂和脂肪酸的生化合成，以及抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子囊的形成和孢子萌發(fā)，兼有保護(hù)和治療作用。霜霉威鹽酸鹽可有效防治霜霉病、疫病、猝倒病等，多使用于黃瓜、番茄、甜椒、馬鈴薯、煙草等[5]。精甲霜·霜霉鹽是一種新型復(fù)配制劑，有田間試驗(yàn)對(duì)比研究表明，其對(duì)辣椒疫病有顯著的防治效果[6]。已有的關(guān)于精甲霜靈復(fù)配制劑的定量大多是采用液相色譜法[7-9]。霜霉威鹽酸鹽不易氣化，可溶于水并以離子形式存在，多采用液相色譜法檢測(cè)，但是峰型不好，目前對(duì)其的氣相色譜定量分析的報(bào)道也較少[5,10]。

本研究建立了35%精甲霜·霜霉鹽可溶劑有效含量測(cè)定的方法，利用甲霜靈和霜霉威作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過一定的前處理方法和計(jì)算方式，采用氣相色譜對(duì)試樣中精甲霜靈和霜霉威鹽酸鹽進(jìn)行定量分析。該方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好等特點(diǎn)，適用于產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 精甲霜靈(R)-異構(gòu)體比值K值的測(cè)定

1.1.1 試劑和溶液

正己烷，色譜純(樂清億邦儀器設(shè)備有限公司)；異丙醇，色譜純(樂清億邦儀器設(shè)備有限公司)；甲霜靈標(biāo)樣，純度98.7%(上海農(nóng)藥研究所有限公司)；35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑，浙江禾本科技股份有限公司提供。

1.1.2 儀器

分析天平，賽多利斯CPA225D(德國(guó)Sartorius)，精度為0.00001 g；高效液相色譜儀，Waters Acquity H-Class/PDA檢測(cè)器(美國(guó)沃特世(waters))；超聲波清洗器(PMI-300TD，PRIMA technology Group)；有機(jī)微孔濾膜，孔徑0.45 μm(MILEDT Technology Co.Ltd)。

1.1.3 色譜工作條件

色譜柱，CHIRALCEL OD-H 4.6 mm×150 mm×5 μm(美國(guó)Agilent公司)；流動(dòng)相，正己烷+異丙醇=85+15(體積)；流量，1.0 mL/min；柱溫，35 ℃；測(cè)定波長(zhǎng)，210 nm；進(jìn)樣量，5 μL；采樣時(shí)間，30 min；

保留時(shí)間：(S)-異構(gòu)體約6 min，(R)-異構(gòu)體約22.5 min。

典型的甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品及35%精甲霜·霜霉鹽試樣的手性高效液相色譜圖見圖1和圖2。

圖1 甲霜靈標(biāo)樣正相高效液相色譜圖

圖2 甲霜靈標(biāo)樣正相高效液相色譜圖

1.1.4 測(cè)定步驟

1)甲霜靈標(biāo)樣溶液配制。稱取含有效成分約0.03 g(精確至0.01 mg)的甲霜靈標(biāo)樣于50 mL容量瓶中，用25 mL異丙醇超聲溶解，并用正己烷定容，搖勻。

2)試樣溶液配制。稱取約0.3g(精確至0.01 mg)的35%精甲霜靈·霜霉威可溶液劑試樣于50 mL容量瓶中，用25 mL異丙醇超聲溶解，并用正己烷定容，搖勻，于測(cè)定前過濾。

3)測(cè)定。在1.1.3色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰兩針甲霜靈(S)-異構(gòu)體和(R)-異構(gòu)體的峰面積相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液的順序進(jìn)樣分析。

4)計(jì)算。將測(cè)得兩針試樣溶液中精甲霜靈(S)-異構(gòu)體和(R)-異構(gòu)體的峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中精甲霜靈(R)-異構(gòu)體的比值K按公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

式中：AS為試樣溶液中精甲霜靈(S)-異構(gòu)體的峰面積平均值；AR為試樣溶液中精甲霜靈(R)-異構(gòu)體的峰面積平均值。

1.2 精甲霜靈、霜霉威鹽酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1.2.1 試劑和溶液

丙酮，分析純(浙江中星化工試劑有限公司)；氨水，w(NH3)≥25%(西隴科學(xué)股份有限公司)；內(nèi)標(biāo)物,鄰苯二甲酸二乙酯，無(wú)干擾分析的雜質(zhì)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲霜靈標(biāo)樣,純度98.7%(上海農(nóng)藥研究所有限公司)；霜霉威標(biāo)樣,純度99.4%(上海農(nóng)藥研究所有限公司)；內(nèi)標(biāo)溶液配制：準(zhǔn)確稱取鄰苯二甲酸二乙酯1.5g于100mL容量瓶中，用丙酮溶解稀釋至刻度，搖勻備用。

1.2.2 儀器

氣相色譜儀，Agilent GC 8890/具FID檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司); 分析天平，賽多利斯CPA225D(德國(guó)Sartorius)，精度為0.00001 g；超聲波清洗器(PMI-300TD，PRIMA technology Group)；有機(jī)微孔濾膜，孔徑0.45 μm(MILEDT Technology Co.Ltd)。

1.2.3 氣相色譜操作條件

色譜柱，HP-5 30 m×0.32 mm×0.25 μm毛細(xì)管色譜柱(美國(guó)Agilent公司)；載氣，N2；檢測(cè)溫度，250℃；控制方式，線速率；柱流量，1.5 mL/min；進(jìn)樣方式，分流進(jìn)樣；吹掃流量，3 mL/min；分流比，50∶1；空氣流量，300 mL/min；進(jìn)樣量，1.0 μL；氫氣，30 mL/min;氣化溫度，250℃；尾吹流量，30 mL/min；柱溫：150℃保持5 min，以20 ℃/min升溫至250℃，保持20 min。保留時(shí)間：霜霉威約4 min， 鄰苯二甲酸二乙酯約7 min，甲霜靈約10 min(見圖3和圖4)。

1.2.4 測(cè)定步驟

1) 標(biāo)樣溶液的配制。準(zhǔn)確稱取甲霜靈標(biāo)樣0.05 g(準(zhǔn)確至0.01 mg)、霜霉威標(biāo)樣0.1g(準(zhǔn)確至0.01 mg)標(biāo)樣于10 mL容量瓶中，用移液管移入5.00 mL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲溶解，搖勻。

2) 試樣溶液的配制。準(zhǔn)確稱取含甲霜靈0.05 g(準(zhǔn)確至0.01 mg)的試樣于10 mL容量瓶中，用移液管移入5.00 mL內(nèi)標(biāo)溶液超聲溶解，再加入4滴濃氨水將霜霉威鹽酸鹽轉(zhuǎn)化為霜霉威，充分搖勻，于測(cè)定前過濾。

3)測(cè)定。在2.2.3色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至兩針有效成分和內(nèi)標(biāo)物峰面積比相對(duì)變化小于1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)樣分析。

1.霜霉威標(biāo)樣；2.鄰苯二甲酸二己酯；3.甲霜靈標(biāo)樣。

圖3 甲霜靈·霜霉威的標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖

1.霜霉威；2.鄰苯二甲酸二己酯；3.甲霜靈。

4)計(jì)算。將測(cè)得的兩針試樣溶液，以及試樣前后兩針標(biāo)樣溶液中的甲霜靈(霜霉威)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值分別進(jìn)行平均。其中，精甲霜靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)x1按公式(2)計(jì)算，霜霉威鹽酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)x2按公式(3)計(jì)算。

(2)

(3)

式中：P1為甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的純度，以%表示；r1為標(biāo)樣溶液中甲霜靈和內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；r2為試樣溶液中甲霜靈與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；m1為標(biāo)樣溶液中甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣質(zhì)量(g)；m2為試樣質(zhì)量(g)；K為試樣中精甲霜靈(R)-異構(gòu)體的比值。P2為霜霉威標(biāo)準(zhǔn)品的純度，以%表示；r3為標(biāo)樣溶液中霜霉威和內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；r4為試樣溶液中霜霉威與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；m3為標(biāo)樣溶液中霜霉威標(biāo)準(zhǔn)品的稱樣質(zhì)量(g)；m2為試樣質(zhì)量(g)；224.7為霜霉威鹽酸鹽的相對(duì)分子質(zhì)量；188.3為霜霉威的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇

經(jīng)過優(yōu)化后的甲霜靈、霜霉威與鄰苯二甲酸二乙酯在試驗(yàn)條件下，出峰時(shí)間相近，分離度好，且相互之間無(wú)干擾，符合內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)，可以滿足對(duì)精甲霜·霜霉鹽可溶液劑進(jìn)行定量分析的要求。

2.2 分析方法的線性相關(guān)性的測(cè)定

分別稱取不同質(zhì)量的甲霜靈和霜霉威標(biāo)樣于10 mL容量瓶中，用5.00 mL內(nèi)標(biāo)溶液超聲溶解，搖勻，配制成不同質(zhì)量濃度的甲霜靈(或霜霉威)系列標(biāo)樣溶液。以甲霜靈(或霜霉威)質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甲霜靈和霜霉威的線性相關(guān)曲線。甲霜靈的線性方程為y=0.0139x-0.0154，相關(guān)系數(shù)r=1.0>0.99。霜霉威的線性方程為y=0.0119x-0.0416，相關(guān)系數(shù)r=0.9999>0.99，因此均在線性范圍內(nèi)(見圖5和圖6)。

圖5 甲霜靈的線性關(guān)系圖

圖6 霜霉威的線性關(guān)系圖

2.3 分析方法的精密度試驗(yàn)

按照1.2.3色譜條件，對(duì)同一試樣平行測(cè)定6次。甲霜靈測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.37%，重復(fù)性測(cè)定結(jié)果小于0.67×2(1-0.5×lgC)(修訂后的Horwits公式)1.88%；霜霉威測(cè)定結(jié)果的的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.40%，重復(fù)性測(cè)定結(jié)果小于0.67×2(1-0.5×lgC)(修訂后的Horwits公式)1.69%。結(jié)果表明(表1)，同一批次產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果可以接受，能夠滿足日常檢測(cè)工作的需要。

2.4 分析方法的準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn)

根據(jù)1.2.4溶液制備方法，分別稱取試樣溶液一半的試樣稱樣量和標(biāo)樣溶液一半的稱樣量，用移液管移取5 mL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入4滴濃氨水，超聲溶解過濾。按照上述(1.2.3)分析方法分別測(cè)定其中的甲霜靈和霜霉威的總的質(zhì)量，并計(jì)算其回收率，甲霜靈和霜霉威的平均回收率分別為100.26%和99.53%，符合回收率標(biāo)準(zhǔn)范圍98%～102%。結(jié)果見表2。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 分析方法準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑中有效成分的氣相色譜分析方法。結(jié)果表明：35%精甲霜·霜霉鹽可溶液劑在測(cè)試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法準(zhǔn)確度和精密度高。該方法采用常用的甲霜靈和霜霉威為標(biāo)準(zhǔn)品，并且在同一試驗(yàn)條件下能夠分離試樣中有效成分，具有操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，是產(chǎn)品質(zhì)量控制較為理想的分析方法。