例析稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的易錯(cuò)點(diǎn)

楊長(zhǎng)奎　冉玲

2017年高考考試大綱新增了“微生物數(shù)量的測(cè)定”的內(nèi)容。高中生物教材中有兩處涉及微生物數(shù)量需要測(cè)定，一處是必修3中“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化”，運(yùn)用抽樣檢測(cè)法，在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)血球計(jì)數(shù)板上酵母菌數(shù)量并推算出培養(yǎng)液中酵母菌的個(gè)體數(shù)；另一處是選修1中“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)”，運(yùn)用稀釋涂布平板法，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)推測(cè)出樣品中活菌的大致個(gè)數(shù)。其中，稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物是考試的熱點(diǎn)，也是學(xué)生的易錯(cuò)點(diǎn)。

1 易錯(cuò)點(diǎn)一：用實(shí)驗(yàn)組的平均菌落數(shù)與對(duì)照組菌落數(shù)的差值推算樣品中活菌個(gè)數(shù)

【例1】 空氣中的微生物在重力等作用下，可以一定程度的沉降。某研究小組欲用平板收集教室空氣中的微生物，以了解教室內(nèi)不同高度空氣中微生物的分布情況。實(shí)驗(yàn)步驟：① 配制培養(yǎng)基；② 制作無(wú)菌平板；③ 設(shè)置空白對(duì)照組和若干實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行相關(guān)操作；④ 將各組平板置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各組平板上菌落的平均數(shù)。回答下列問(wèn)題：

（1） 步驟③中，實(shí)驗(yàn)組的操作是 。

（2） 若在某次調(diào)查中，某一實(shí)驗(yàn)組平板上菌落平均數(shù)為36個(gè)/平板，而空白對(duì)照組的一個(gè)平板上出現(xiàn)了6個(gè)菌落，這種結(jié)果說(shuō)明在此次調(diào)查中出現(xiàn)了

現(xiàn)象。若將30（即36-6）個(gè)/平板作為本組菌落數(shù)的平均值，該做法 （填“正確”或“不正確”）。

解析：本實(shí)驗(yàn)的目的是了解教室內(nèi)不同高度空氣中微生物的分布情況，應(yīng)選擇不同的高度放置平板，實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)皿蓋應(yīng)揭開(kāi)，使之暴露在空氣中一段時(shí)間，以利于空氣中微生物沉降到平板培養(yǎng)基表面上?？瞻讓?duì)照組的培養(yǎng)皿蓋不能打開(kāi)，使之不接觸空氣，不應(yīng)該出現(xiàn)菌落。若空白對(duì)照組平板出現(xiàn)了菌落，則說(shuō)明空白對(duì)照組的平板被污染。對(duì)照組平板出現(xiàn)污染，實(shí)驗(yàn)組平板不一定有污染或污染程度可能不一定與空白對(duì)照組的相同。所以，用實(shí)驗(yàn)組獲取的菌落數(shù)的平均值減去污染產(chǎn)生的菌落數(shù)作為實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是不正確的。正確的做法是：在防止污染的情況下重新實(shí)驗(yàn)，以獲得較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

參考答案：（1） 將各實(shí)驗(yàn)組平板分別放置在教室不同高度的位置上，開(kāi)蓋暴露一段時(shí)間 （2） 污染 不正確

解題指南：用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物，應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)（跟實(shí)驗(yàn)組唯一不同的是不接種或接種等量的無(wú)菌水），其目的是確定培養(yǎng)基制作是否合格。空白對(duì)照組如果出現(xiàn)了菌落，實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)不能用于計(jì)算樣品中的活菌數(shù)，也不能用實(shí)驗(yàn)組的平均菌落數(shù)與空白對(duì)照組菌落數(shù)的差值來(lái)推算樣品中活菌個(gè)數(shù)。正確的做法是重新實(shí)驗(yàn)，直到空白對(duì)照組沒(méi)有菌落出現(xiàn)為止。

2 易錯(cuò)點(diǎn)二：用所有重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的平均菌落數(shù)來(lái)推算樣品中活菌個(gè)數(shù)

【例2】 圖1是從土壤中篩選產(chǎn)脲酶細(xì)菌的過(guò)程。

（1） 圖中選擇培養(yǎng)基應(yīng)以 為唯一氮源；鑒別培養(yǎng)基還需添加 作指示劑，產(chǎn)脲酶細(xì)菌在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，其菌落周?chē)闹甘緞⒆兂?色。

（2） 在5個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1 mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為13、156、462、178和191。每克土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為 個(gè)；與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板相比，此計(jì)數(shù)方法測(cè)得的細(xì)菌數(shù)目較 。

解析：脲酶能夠催化尿素分解為氨，要從土壤中篩選出產(chǎn)脲酶的細(xì)菌，需用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。尿素被分解成氨，會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，使酚紅指示劑變紅色。將稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液接種在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，用于計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落數(shù)的方法是稀釋涂布平板法。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)應(yīng)介于30～300，所以，選擇細(xì)菌菌落數(shù)為156、178和191的平板計(jì)算出平均菌落數(shù)，即（156+178+191）÷3=175，每克土壤樣品中細(xì)菌數(shù)量為175÷0.1×105=1.75×108個(gè)。由于兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連接在一起時(shí)，在平板上往往形成一個(gè)菌落，因此，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)要少于樣品中活菌的實(shí)際值。

答案：（1） 尿素 酚紅 紅 （2） 1.75×108 少

解題指南：（1） 用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)細(xì)菌的原理是——當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。（2） 為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力和保證準(zhǔn)確的結(jié)果，要設(shè)置對(duì)照和重復(fù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白對(duì)照，能排除培養(yǎng)基污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)（同一稀釋度涂布至少3個(gè)平板，一般設(shè)置3～5個(gè)平板），并且選擇菌落數(shù)在30～300的平板計(jì)算平均菌落數(shù)，再用平均菌落數(shù)推算樣品中活菌數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)可排除偶然因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)中某個(gè)平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠(yuǎn)，說(shuō)明該平板操作過(guò)程有誤，應(yīng)舍棄。若舍棄之后不足三個(gè)平板，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的平板菌落數(shù)為240、250、33，則不能用這三個(gè)平板的平均值來(lái)推算樣品中的活菌數(shù)，也不能用菌落數(shù)為240、250這兩個(gè)平板的平均值來(lái)推算樣品中的活菌數(shù)，而應(yīng)找出原因并重新實(shí)驗(yàn)。（3） 稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)微生物的計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積，M代表稀釋倍數(shù)。樣品的稀釋流程是將10 g土樣加入到90 mL無(wú)菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1 mL加入到9 mL無(wú)菌水中得到稀釋100倍的樣液，如此進(jìn)行梯度稀釋。