基于β-半乳糖苷酶的低聚半乳糖制備研究進(jìn)展

吳 昊，齊 崴，2，3*，尤生萍，3，蘇榮欣，2，3，何志敏，2

（1 天津大學(xué)化工學(xué)院 天津 300072 2 化學(xué)工程聯(lián)合國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津大學(xué)） 天津 300072 3 天津市膜科學(xué)與海水淡化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300072）

隨著人口老齡化進(jìn)程的逐步加快，亞健康問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重，我國(guó)于2016年制定實(shí)施的《“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要》中明確提出要引導(dǎo)合理膳食，提高婦幼健康水平。低聚半乳糖 （Galactooligosaccharides，GOS） 是一種以碳水化合物為基礎(chǔ)的益生元成分，與人乳中起到益生元作用的人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）在結(jié)構(gòu)和功能上具備一定的相似性，可以被人體內(nèi)的乳酸菌、雙歧桿菌等腸道微生物特異性消化[1]。如圖1所示，GOS 結(jié)構(gòu)在糖單體組成、聚合程度和糖苷鍵的區(qū)域化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，這使得不同的GOS 產(chǎn)物具有不同的益生效應(yīng)[2]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，GOS 在促進(jìn)腸道有益細(xì)菌增殖，預(yù)防病原體黏附，刺激腸道屏障功能，預(yù)防感染和提高免疫力方面表現(xiàn)出與HMOs 相仿的作用[3]，因此在“類母乳”嬰兒配方產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)方面頗有價(jià)值[4]。除此之外，近年來(lái)對(duì)GOS 益生作用的進(jìn)一步研究表明，GOS 與褐藻寡糖聯(lián)用能有效調(diào)節(jié)腸道菌群和膽汁酸代謝，以改善高脂飲食誘導(dǎo)的血脂異常[5]。同時(shí)，可有效改善肥胖成年人的腸道屏障功能[6]，因此對(duì)GOS 的研究在功能性食品開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有重要的意義。

圖1 GOS 結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性[2]Fig.1 Examples of how GOS structure can vary[2]

自然界中GOS 通常在豆類、海藻和其它部分食物中被檢測(cè)到，含量極為稀少[7]，天然牛乳僅含有極少量的低聚糖（0.05 g/L）[8]，而GOS 本身無(wú)色且不帶電荷，分離困難，因此通過(guò)天然物質(zhì)提取GOS 缺乏可行性。化學(xué)法合成的低聚糖類混合物中具有多種α-或β-鍵結(jié)構(gòu)，缺乏特異性，難以滿足市場(chǎng)要求[9]，而且化學(xué)合成法普遍存在過(guò)程繁瑣，產(chǎn)率低，污染高等問(wèn)題[10]，罕有實(shí)際應(yīng)用。目前對(duì)GOS 合成的研究，主要是以酶法合成為主，糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)糖和糖苷配體有高度的特異性，是GOS 合成過(guò)程的高效催化劑，因價(jià)格高昂，故工業(yè)應(yīng)用困難[11]。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，βgal）（EC3.2.1.23）廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物等細(xì)胞中，能夠針對(duì)性地催化乳糖中末端非還原性β-d-半乳糖苷單元和糖苷配基部分之間的糖苷鍵水解，同時(shí)通過(guò)動(dòng)力學(xué)控制的乳糖半乳糖基化反應(yīng)來(lái)催化GOS 化合物的合成。目前工業(yè)上生產(chǎn)GOS 的主要方法就是利用β-gal 催化乳糖或乳清以合成GOS。這種方法反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，效率高，被認(rèn)為有效且適用于規(guī)?；a(chǎn)[12-13]。本文從機(jī)理、酶源、應(yīng)用方式角度討論β-gal 在GOS生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用，不同來(lái)源β-gal 催化合成GOS 的效果，并評(píng)價(jià)β-gal 不同催化形式的優(yōu)、缺點(diǎn)。介紹一套基于全細(xì)胞法生產(chǎn)高純度GOS 的工藝。

1 反應(yīng)機(jī)理簡(jiǎn)述

β-gal 同時(shí)具備水解活性與轉(zhuǎn)糖苷活性，以乳糖為底物，可催化生成GOS、葡萄糖與半乳糖。關(guān)于β-gal 催化反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制，目前普遍認(rèn)可Koshland 等[14]基于不同產(chǎn)物的立體化學(xué)構(gòu)型分析，從而提出的保留型水解機(jī)制，認(rèn)為底物通過(guò)雙重位移機(jī)制，分兩步完成反應(yīng)。第一步是糖苷配基的釋放和半乳糖基-酶復(fù)合物的形成，β-gal 具備高度專一性，在反應(yīng)中特異性攻擊底物的β-半乳糖苷鍵，在實(shí)際反應(yīng)中底物分子可以是乳糖或低聚糖。如圖2a 所示，乳糖作為底物時(shí)，釋放一分子葡萄糖，同時(shí)半乳糖基與β-gal 相結(jié)合形成共價(jià)半乳糖基-酶中間體，過(guò)程涉及到兩個(gè)谷氨酸殘基的參與，第1 個(gè)催化殘基作為親核基團(tuán)，攻擊β-半乳糖苷鍵的異頭中心，生成半乳糖基酶復(fù)合物，而第2 個(gè)殘基充當(dāng)酸，將質(zhì)子傳遞到糖苷鍵中的氧原子上，以活化糖苷配基作為離去基團(tuán)；第二步反應(yīng)中在第2 個(gè)催化殘基的輔助下，含有羥基的親核試劑脫去羥基中的質(zhì)子，充當(dāng)半乳糖殘基的受體，使產(chǎn)物從酶的活性位點(diǎn)中釋放出來(lái)，以產(chǎn)生保留底物的單體構(gòu)型產(chǎn)物[15-16]。在這一步反應(yīng)中，當(dāng)半乳糖基受體為水分子時(shí)，反應(yīng)釋放出半乳糖和葡萄糖，即為水解反應(yīng)。而當(dāng)受體為另一個(gè)多糖時(shí)，則生成了低聚半乳糖，即為轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)[2]，而且由于底物的多樣性，在乳糖催化反應(yīng)體系中將存在大量單糖，GOS 二糖，三糖及以上產(chǎn)物 （如圖2b）[17]。

圖2 β-gal 催化反應(yīng)機(jī)制Fig.2 β-Galactosidase catalytic reaction mechanism

2 酶源篩選

酶種來(lái)源是GOS 合成的重要因素，不同來(lái)源的β-gal，酶學(xué)性質(zhì)差異大，動(dòng)力學(xué)行為[18]也存在區(qū)別。在GOS 合成研究中最重要的操作變量如溫度、pH 值、酶負(fù)荷和底物濃度等均取決于酶種來(lái)源，甚至在研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同的酶，半乳糖和葡萄糖等競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的影響也存在差異[19]。如表1[13，20-24]所示，由于不同來(lái)源的β-gal 對(duì)水和糖類的選擇特異性存在差別，根本上決定了GOS 合成反應(yīng)的產(chǎn)物組成和產(chǎn)率。因此在酶法制備GOS 工藝的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，酶來(lái)源的篩選鑒定是研究的重要環(huán)節(jié)。

2.1 常規(guī)來(lái)源

來(lái)自米曲霉（Aspergillus oryzae）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis） 的β-gal 通常是乳品工業(yè)商業(yè)酶制劑的首選[25]。表2[13，26-40]綜合了不同來(lái)源β-gal 的催化表現(xiàn)。來(lái)自乳酸克魯維酵母β-gal 的最佳pH 值接近6.5，催化溫度在35～40 ℃，GOS產(chǎn)率約為30.0%，且含有大量益生作用不明的二糖[13，28，38，41]。而環(huán)狀芽孢桿菌來(lái)源的β-gal，催化溫度通常在40～60 ℃，pH 值接近6.0，GOS 最大產(chǎn)率約為40.0%[26，31-32，42-43]，該酶在實(shí)際工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)較好，一直是工業(yè)生產(chǎn)的首選。來(lái)自米曲霉的β-gal 具有最高的熱穩(wěn)定性和反式半乳糖基化活性，而且價(jià)格便宜，但是在合成過(guò)程中GOS 產(chǎn)率普遍低于30.0%[28，30，33，37，38，44]。Vera 等[17，45]基于米 曲霉來(lái)源的β-gal，分批合成GOS，終產(chǎn)率維持在28.0 g GOS/100 g 乳糖左右。同樣的，Cinar 等[30]通過(guò)試驗(yàn)與動(dòng)力學(xué)參數(shù)模擬結(jié)合優(yōu)化試驗(yàn)條件，米曲霉來(lái)源的β-gal 的產(chǎn)率也止步26.73%。Fischer等[46]研究了乳酸克魯維酵母和米曲霉來(lái)源的兩種β-gal 在GOS 合成反應(yīng)中的的聯(lián)用效果，結(jié)果表明在米曲霉β-gal 與乳酸克魯維酵母β-gal 順序聯(lián)用的情況下，總GOS 的產(chǎn)率從24.6%提高到33.1%。

如表1所示，不同來(lái)源的β-gal 合成的GOS結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)出較大的差異。Rodriguez-colinas 等[13]發(fā)現(xiàn)由乳酸克魯維酵母來(lái)源的β-gal 催化GOS 生產(chǎn)中，主要產(chǎn)物是在兩個(gè)半乳糖或半乳糖和葡萄糖之間以β-（1→6）鍵連接的二糖。而在對(duì)環(huán)狀芽孢桿菌來(lái)源的β-gal 合成產(chǎn)物研究中，通過(guò)凝膠滲透色譜法，碳色譜法和HPLC 法發(fā)現(xiàn)并鑒定了11 種低聚糖，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了高度的復(fù)雜性，主要的反式半乳糖基化產(chǎn)物是三糖Gal-β （1→4）-Gal-β （1→4）-Glc 和四糖Gal-β （1→4）-Gal-β（1→4）-Gal-Glc[22，32]。米曲霉來(lái)源的β-gal 催化反應(yīng)中，主要產(chǎn)物為三糖，其結(jié)構(gòu)為Gal-β（1→6）-Gal-β（1→4）-Glu[46]。Ferreira-lazarte 等[47]用豬的小腸刷狀邊界膜囊泡檢測(cè)了糖苷鍵和單體組成影響對(duì)腸消化酶的抗性，結(jié)果表明GOS 混合物中β（1→3）最容易水解（50.2%），其次是β（1→4）（34.9%），而β（1→6）鍵表現(xiàn)出了最強(qiáng)的消化抗性（27.1%），對(duì)腸道菌群的特異性吸收更為有利。同時(shí)低聚半乳糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)一定程度上影響著腸道內(nèi)益生菌的發(fā)酵模式，其中β（1→6）鍵能較快的被雙歧桿菌中的β-gal 切割，從而表現(xiàn)出較好的雙歧效應(yīng)[48]。因此乳酸克魯維來(lái)源的β-gal 在生產(chǎn)中產(chǎn)物組成方面存在一定優(yōu)勢(shì)。另一方面，在以不同組成GOS 為目的產(chǎn)品時(shí)，環(huán)狀芽孢桿菌是富集三糖的產(chǎn)品的最佳選擇。若目標(biāo)產(chǎn)物以二糖和三糖為主，乳酸克魯維酵母和米曲霉來(lái)源的β-gal將是更好的選擇[20]。Fischer 等[49]對(duì)葡萄糖氧化酶和過(guò)氧化氫酶與β-gal 的聯(lián)用中發(fā)現(xiàn)，雖然GOS相對(duì)產(chǎn)率有所下降，但是相應(yīng)的GOS 三糖以上的糖的合成均得到增強(qiáng)。此外在米曲霉β-gal 與乳酸克魯維酵母β-糖苷酶聯(lián)用的研究過(guò)程中，除了GOS 產(chǎn)率的提升外，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)上的比例也有所變化，比如三糖的含量從16.6%上升至18.3%[46]。這一系列的研究表明，由于對(duì)不同底物的選擇性差異，多來(lái)源酶的復(fù)合使用在提高GOS 終產(chǎn)率，調(diào)整GOS 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)比例方面的研究頗為令人期待，這也為酶學(xué)性質(zhì)研究較深入的常規(guī)酶源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了一條新思路。

參考文獻(xiàn)[13][21][22][24][20][23]）-D-Glc 4）-D-Glc 4，20-24][13成組構(gòu)結(jié)要主物產(chǎn)β-gal GOS源來(lái)同不1表，20-24][13 Main structural components GOS from different sources of β-galactosidase成組構(gòu)結(jié)物產(chǎn)要主上以及糖四糖三）-D-Glc 4（1→）-β-D-Gal-6（1→β-D-Gal-）-D-Glc 4（1→）-β-D-Gal-4（1→β-D-Gal-（1→）-β-D-Gal-6（1→）-β-D-Gal-6（1→β-D-Gal-）-D-Glc 4（1→）-β-D-Gal-4（1→β-D-Gal-（1→）-β-D-Gal-4（1→）-β-D-Gal-6（1→β-D-Gal-）-D-Glc 4（1→）-β-D-Gal-6（1→β-D-Gal-）-D-Glc 4（l→）-β-D-Gal-4（1→β-D-Gal）-D-Glc 2（l→）-β-D-Gal-6（l→β-D-Gal 4）-D-Glc 6）-β-D-Gal-（1→β-D-Gal（l→3）-D-Glc 4）-β-D-Gal-（l→β-D-Gal（1→-2）-D-Glc 4）-β-D-Gal-（l→β-D-Gal（1→）-D-Glc 2（1→）-β-D-Gal-4（1→β-D-Gal）-D-Glc 6（1→）-β-D-Gal-4（1→β-D-Gal）-D-Glc 3（l→）-β-D-Gal-6（1→β-D-Gal）-Glc 4（1→）-Gal-β 3（1→）-Gal-β 3（1→Gal-β）-Glc 4（1→）-Gal-β 3（1→Gal-β）-Glc 4（1→）-Gal-β 6（1→Gal-β）-Glc 4（1→）-Gal-β 6（1→）-Gal-β 6（1→Gal-β）-Glc 4（1→）-Gal-β 4（1→Gal-β）-Glc 4（1→）-Gal-β 3（1→Gal-β--Table 1 糖二）-D-Gal 6（1→β-D-Gal-）-D-Glc 6（1→β-D-Gal-）-D-Gal 3（1→β-D-Gal-6）-D-Glc β-D-Gal-（1→3）-D-Glc β-D-Gal-（1→3）-D-Glc β-D-Gal-（1→6）-D-GLc β-D-Gal-（1→2）-D-GLc β-D-Gal-（1→）-Glc 6（1→Gal-β）-Glc 3（1→Gal-β）-Gal 3（1→Gal-β）-Gal 6（1→Gal-β）-Glc 6（1→Gal-β）-Gal 3（1→Gal-β）-Gal 4（1→Gal-β）-Glc 3（1→Gal-β）-D-Glc，6（1 β-D-Gal）-D-Gal，6（1 β-D-Gal）-D-Glc，3（1 β-D-Gal）-D-Glc，2（1 β-D-Gal株菌源來(lái)母酵維魯克酸乳菌桿乳酸嗜菌桿孢芽狀環(huán)菌桿歧雙霉曲米菌球鏈酸乳溫高

2.2 特殊益生菌來(lái)源

從細(xì)菌中提取的β-gal 由于其高活性，易發(fā)酵和較高的穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用于乳糖的水解。其中，乳酸菌（包括Lactococci，Streptococci 和Lactobacilli）及雙歧桿菌（Bifidobacterium）被認(rèn)定為“一般認(rèn)為安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物，而且作為益生菌普遍存在于我國(guó)公布的可用于食品、嬰兒食品和保健食品的菌種名單中，本身廣泛存在于人體的腸道內(nèi)，起到幫助消化，調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道菌群的作用，自身具備顯著的健康效益，以其為來(lái)源的食品級(jí)β-gal，在功能性食品領(lǐng)域備受關(guān)注。

Kittibunchakul 等[36]從乳酸桿菌DSM20075 中提取的LacLM 型β-gal 在大腸桿菌（E.coli BL21Lh β-gal）和植物乳桿菌（Lp609Lh β-gal）中進(jìn)行異源表達(dá)，兩種宿主細(xì)胞所表達(dá)的β-gal 在相同催化條件下，GOS 產(chǎn)率分別達(dá)到了33.0%和26.0%。Fureder 等[24]在評(píng)價(jià)了來(lái)源于雙歧桿菌的新型商業(yè)β-gal 的轉(zhuǎn)糖基活性，在40 ℃和pH 值約6.0 下，乳糖濃度增加至400 g/L 能夠達(dá)成GOS的大量生成（107.2 g/L，產(chǎn)率：27%），而且在過(guò)程中先后形成大量β（1→3）和β（1→6）鍵，幾乎沒(méi)有β（1→4）的存在。事實(shí)上，來(lái)自乳酸菌和雙歧桿菌的β-gal 合成的GOS 含有更多的β（1→6）和β（1→3）鍵，相比含有β（1→4）和β（1→6）鍵的GOS 混合物表現(xiàn)出了更好的雙歧效應(yīng)，理論上具有更佳的益生效益。同時(shí)如表2所示，部分益生菌來(lái)源的β-gal 在最佳反應(yīng)條件下，GOS 產(chǎn)率最高可達(dá)43.0%[29]。該種益生菌來(lái)源的β-gal 在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與生產(chǎn)能力方面均表現(xiàn)出較好的潛力，是GOS 生產(chǎn)研究中的重要方向。

表2 最佳反應(yīng)條件及GOS 收率[13， 26-40]Table 2 Optimal reaction conditions and GOS yield[13， 26-40]

2.3 耐熱微生物來(lái)源

耐熱β-gal 主要來(lái)源于一些高溫菌和中溫細(xì)菌，如耐熱嫌氣菌、棲熱菌、嗜熱菌和古細(xì)菌等[50]。從技術(shù)角度來(lái)看，來(lái)自嗜熱微生物的β-gal 非常適用于GOS 生產(chǎn)規(guī)?；に嚨拈_(kāi)發(fā)，乳糖底物在常溫下的溶解度相對(duì)較低，溫度直接影響到反應(yīng)底物乳糖的飽和濃度，降低了水分子作為受體的幾率，而且在高溫情況下酶的初始反應(yīng)速率較高，表現(xiàn)出較強(qiáng)的轉(zhuǎn)糖苷活性，從而顯著促使GOS 產(chǎn)率的升高，還能有效防止微生物污染[40，51-53]。由于大多數(shù)耐熱β-gal 均來(lái)自于嗜熱微生物，因此發(fā)酵產(chǎn)酶效率很低。因此有關(guān)耐熱β-gal 的工業(yè)化研究多是通過(guò)在中溫宿主的異源表達(dá)來(lái)完成，比如Kong 等[54]將源于嗜熱單胞菌Thermotoganaphthophila RUK-10 的β-gal 構(gòu)建在大腸桿菌BL21中，經(jīng)表達(dá)和純化后的酶在70 ℃下表現(xiàn)出穩(wěn)定的乳糖水解活性，且在70～85 ℃下穩(wěn)定性良好，在合成烷基半乳糖苷中也表現(xiàn)出良好的反式糖基化活性，具備良好的生物技術(shù)應(yīng)用潛力。

除此之外，在β-gal 的開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面，對(duì)新來(lái)源β-gal 的表達(dá)鑒定工作一直是持續(xù)性的工作，Xin 等[55]近期從嬰兒糞便中提取了一種新型βgal，在大腸桿菌中表達(dá)后表現(xiàn)出了高水解和反半乳糖基化活性，在20%初始乳糖濃度50 ℃的條件下獲得了33.4%的GOS 收率，遠(yuǎn)高于工業(yè)上常用的米曲霉。Li 等[56]在海洋細(xì)菌交替單胞菌Alteromonas sp.QD 01 中克隆了一個(gè)新的β-gal 基因gal2A 并在大腸桿菌中表達(dá)，在6.0～9.5 的pH值范圍內(nèi)顯示出廣泛的pH 值穩(wěn)定性，且具備高轉(zhuǎn)糖基活性，對(duì)牛奶中的乳糖水解和GOS 的生產(chǎn)可能是潛在的優(yōu)質(zhì)催化劑。在新來(lái)源的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，新來(lái)源的β-gal 由于其不同的最適條件和催化能力，可能是GOS 生產(chǎn)工藝發(fā)展的潛在推動(dòng)力。

3 應(yīng)用形式

3.1 游離酶

由于β-gal 在大多數(shù)菌株內(nèi)通常以胞內(nèi)酶的形式存在，通常需要經(jīng)過(guò)破碎提純，才能作為游離酶參與反應(yīng)。而且游離酶應(yīng)用于催化反應(yīng)中，穩(wěn)定性較差，容易變性失活，且隨著反應(yīng)時(shí)間推移，活性流失快，湯衛(wèi)華等[57]的研究中，游離β-gal 在1周內(nèi)，酶活力下降了40%；游離酶在反應(yīng)結(jié)束后成為雜質(zhì)且難以剔除，給產(chǎn)物的分離純化造成困難，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)污染。在有關(guān)低聚糖分離的研究中發(fā)現(xiàn)，基于超濾膜對(duì)大分子低聚糖與生物酶的優(yōu)異阻隔效果（如圖3a），超濾膜能有效用于酶法水解大分子聚糖所得的小分子低聚糖分離過(guò)程[58]，從而對(duì)酶法合成GOS 研究中低聚半乳糖與β-gal 的分離有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。Ren 等[59]將超濾膜反應(yīng)器（UMR）與納濾分離系統(tǒng)（CPNSS）相結(jié)合，基于K.lactis 商業(yè)游離酶建立連續(xù)反應(yīng)純化體系，在4 h 的連續(xù)反應(yīng)中獲得總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.4%的GOS 產(chǎn)品，終純度為57.2%。雖然目前的超濾膜反應(yīng)器的發(fā)展仍然受限于膜污染和酶的復(fù)用性問(wèn)題（如圖3b），但是一定程度上為游離酶的工業(yè)化利用提供了可行方案。

圖3 游離酶催化的發(fā)展方向與限制[58]Fig.3 Development direction and limitation of free enzyme catalysis [60]

3.2 固定化酶

3.2.1 載體固定化 為改善游離酶β-gal 穩(wěn)定性，提高工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于β-gal 固定化應(yīng)用的研究愈發(fā)深入。如圖4a 所示，酶固定化可以通過(guò)物理或化學(xué)方法如吸附[61]、誘導(dǎo)和包埋[62]，將酶限制在載體內(nèi)，或與載體通過(guò)弱相互作用連接，比如通過(guò)酶與載體之間的共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)[63]。在酶法生產(chǎn)GOS 工藝的研究中，固定化酶的催化性能與固定化的方法和載體材料密切相關(guān)。Gonzalez-Delgado 等[64]的研究表明，具有不同結(jié)構(gòu)和孔徑分布的載體對(duì)β-gal 酶活的影響差異明顯，來(lái)自棘孢曲霉的β-gal 在游離狀態(tài)下產(chǎn)率為11.2%（28 g/L），固定在最優(yōu)載體ULP-SBA-15 對(duì)應(yīng)的產(chǎn)率可達(dá)20.2%（50.5 g/L）。但是也存在部分材料如SBA-15 對(duì)產(chǎn)率有一定抑制，終產(chǎn)率為1.3%（3.2 g/L）遠(yuǎn)低于游離狀態(tài)下的酶。理想的固定化載體材料要求機(jī)械強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好，傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)和高分子材料，比如二氧化硅，氧化鋁等，由于活性損失大，穩(wěn)定性差，逐漸被新型固定化材料取代，比如磁性載體材料。改性后的磁性載體材料是一種良好的生物酶載體材料，磁性材料固定化酶可通過(guò)外加磁場(chǎng)快速回收和調(diào)控位置，增強(qiáng)攪拌效果。Chen 等[65]通過(guò)交聯(lián)劑三羥甲基膦（THP）與載體連接方式將β-gal 固定在殼聚糖包被的磁性Fe3O4納米粒子上，在36%的初始乳糖濃度下獲得GOS 產(chǎn)品的產(chǎn)率為50.5%，而且表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在45 ℃下孵育14 d 后的殘留活性分別為62.0%，相比游離酶顯著提高了酶的穩(wěn)定性，并且該種磁性材料在吸脫附5 次后仍能保持初始酶活的92.0%，表現(xiàn)出了良好的循環(huán)性能。

圖4 載體固定化的主要技術(shù)與發(fā)展Fig.4 Main technology and development of carrier immobilization

為了進(jìn)一步改善固定化酶的特性，通常將多種技術(shù)組合應(yīng)用于固定化材料中，Liu 等[66]在βgal 磁性聚合納米球載體制備的基礎(chǔ)上，通過(guò)縮合反應(yīng)將聚乙烯亞胺 （PEI） 共價(jià)連接到磁性聚（GMA-EDGMA-HEMA）納米球表面，從而使得納米球載體表現(xiàn)出了優(yōu)異的單分散性能，同時(shí)負(fù)載在載體上的酶量最高達(dá)86.7 mg/g，與傳統(tǒng)的酶固定化載體相比，為酶的吸附提供了更大的比表面積（如圖4b），最終生產(chǎn)能力相比游離酶提高約8倍。

3.2.2 無(wú)載體固定化 無(wú)載體固定化脫離了載體限制，制備方法簡(jiǎn)單，主要包括噴霧干燥、交聯(lián)酶、交聯(lián)酶晶體（CLECs）和交聯(lián)酶聚體（CLEAs）[68]。CLEAs 由于酶活高、穩(wěn)定性好，機(jī)械結(jié)構(gòu)強(qiáng)，且免去了復(fù)雜的酶純化步驟等潛在優(yōu)勢(shì)（如圖5a），在β-gal 酶制劑制備中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能[69]。CLEAs的制備通常向酶的水溶液中加入蛋白沉淀劑如硫酸銨，使酶沉淀析出形成非共價(jià)鍵連接的聚集體，保證三維構(gòu)象不被破壞，然后加入交聯(lián)劑使醛基與酶上的游離氨基發(fā)生Schiff 堿反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)[70]。Li 等[71]基于β-galBgal1，以戊二醛作為交聯(lián)劑，制備酶聚體Bgal1-3-CLEAs，結(jié)果表明相比游離酶（57.1%），酶聚體獲得了更高的GOS 產(chǎn)率（59.4%），并且在10 個(gè)批次的重復(fù)后仍保留了82.0%的初始活性，且第10 批GOS 收率依然能維持在52.3%，顯著提高了熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。CLEAs 可由兩種或兩種以上的酶共同固定化以獲得更強(qiáng)的催化能力（如圖5b），單獨(dú)或順序組成催化級(jí)聯(lián)過(guò)程[68]；另一方面，交聯(lián)酶聚體也可與介孔材料或納米材料等結(jié)合，開(kāi)發(fā)具備特殊復(fù)合性能的產(chǎn)品[72]。孫槐勝等[70]通過(guò)將牛血清蛋白修飾的磁性納米顆粒引入到CLEAs 中（如圖5b），制備復(fù)合磁性交聯(lián)酶聚體，解決了傳統(tǒng)CLEAs 由于粒徑通常在微米尺寸，離心或過(guò)濾操作易聚集，難以回收的問(wèn)題，進(jìn)一步擴(kuò)大了CLEAs 的應(yīng)用范圍，而且為低成本合成GOS 提供了可行的催化劑。

圖5 無(wú)載體固定化的研究進(jìn)展Fig.5 Research progress of carrier-free immobilization

3.3 透性化細(xì)胞

多數(shù)β-gal 以胞內(nèi)酶形式存在，透性化細(xì)胞免除復(fù)雜的純化過(guò)程，同時(shí)避免了載體和無(wú)載體固定化酶的活性損失。透性化細(xì)胞主要通過(guò)物理或化學(xué)方法，在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性的情況下改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使得小分子可以自由出入細(xì)胞，從而減少工序，避免酶失活[73]；同時(shí)可以通過(guò)離心或過(guò)濾分離，實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)使用。目前針對(duì)β-gal 的透性化細(xì)胞制備，通常利用乙醇（安全無(wú)毒）處理含有胞內(nèi)酶的細(xì)胞，使細(xì)胞膜上脂質(zhì)溶解，使得乳糖、半乳糖、葡萄糖和GOS 等底物與產(chǎn)物能自由進(jìn)出全細(xì)胞。通過(guò)透射電鏡觀察乳酸克魯維酵母細(xì)胞和透性細(xì)胞的形態(tài)變化（如圖6a）也印證了這一現(xiàn)象：全細(xì)胞顯示均勻致密的細(xì)胞壁和完整的質(zhì)膜，而透性化細(xì)胞并無(wú)明顯的物理斷裂，但是細(xì)胞壁與質(zhì)膜明顯消失，表明化學(xué)處理明顯改變了細(xì)胞外壁的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)成分的釋放[74]。Gobinath 等[75]針對(duì)來(lái)自植物乳桿菌MCC2156 的β-gal，探究了不同透性化處理?xiàng)l件對(duì)活性的影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)透性化細(xì)胞在 （28±2）℃儲(chǔ)存45 d 后，活性仍能保留50%左右，表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。

You 等[76]基于透性化乳酸克魯維酵母細(xì)胞，從發(fā)酵環(huán)節(jié)入手，利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，同時(shí)開(kāi)發(fā)pH 值反饋控制發(fā)酵策略，大幅提高了透性化細(xì)胞的催化活性，優(yōu)化后酶活達(dá)111.61 U/mL，是目前可知天然菌株中最高值[77]。同時(shí)，研究了聯(lián)產(chǎn)透性化細(xì)胞酶制劑和乙醇的發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵蒸餾產(chǎn)乙醇，用于透性處理工藝，以獲得透性細(xì)胞酶制劑和乙醇產(chǎn)品。Sun 等[78]在此基礎(chǔ)上，將催化工藝與發(fā)酵純化法相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了如圖6b 所示，“一種酵母，兩種用途”制備高純GOS 的策略，主要分為兩個(gè)步驟：1）利用透性化細(xì)胞催化乳糖合成GOS；2）使用全細(xì)胞發(fā)酵純化GOS 聯(lián)產(chǎn)乙醇。透性化細(xì)胞重復(fù)使用至少14 批次內(nèi)，GOS 產(chǎn)率依然保持在35.0%左右，全細(xì)胞的純化性能在9批次內(nèi)未出現(xiàn)明顯下降，由此表明該工藝實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)酶乳酸克魯維酵母的綠色循環(huán)利用。該工藝整合了β-gal 酶制劑高效發(fā)酵制備和高純GOS 的高效催化制備的完整工藝，可獲得高純GOS 產(chǎn)品（純度高于95%），透性化酶制劑和乙醇，有望在現(xiàn)有生產(chǎn)企業(yè)通過(guò)簡(jiǎn)單的設(shè)備改造實(shí)現(xiàn)，易于產(chǎn)業(yè)化銜接。因此，該套完整工藝具備工業(yè)化生產(chǎn)高純度GOS 的潛在應(yīng)用價(jià)值，也可為其它功能糖產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供技術(shù)參考。

圖6 透性化細(xì)胞工藝技術(shù)開(kāi)發(fā)Fig.6 Permeabilization cell process technology development

4 結(jié)語(yǔ)

β-gal 在低聚半乳糖合成生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用是一個(gè)持續(xù)性的研究熱點(diǎn)，本文從酶源和應(yīng)用形式角度出發(fā)，綜述了不同來(lái)源β-gal 的應(yīng)用表現(xiàn)，同時(shí)比較了游離酶、固定化酶制劑與透性化細(xì)胞3 種典型的應(yīng)用方式，也是目前的研究現(xiàn)狀與發(fā)展方向。在β-gal 未來(lái)的應(yīng)用開(kāi)發(fā)方面，對(duì)新來(lái)源β-gal 酶學(xué)性質(zhì)的開(kāi)發(fā)與鑒定將成為推進(jìn)其應(yīng)用轉(zhuǎn)化的有力手段；另一方面，通過(guò)不同酶源與不同工藝相結(jié)合，以適應(yīng)生產(chǎn)條件的要求，生產(chǎn)所需結(jié)構(gòu)組成的低聚半乳糖產(chǎn)品也是工業(yè)上值得開(kāi)發(fā)的方向。同時(shí)本文也結(jié)合自身工作，總結(jié)了“一種酵母，兩種用途”工藝成果，在小試工藝規(guī)模上用于生產(chǎn)高純度（＞95%）GOS 產(chǎn)品，具備高穩(wěn)定性，高活性和高循環(huán)性，具備進(jìn)一步推進(jìn)到工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)秀潛力。