• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    超聲波處理對綠原酸與牛血清白蛋白結合作用的影響

    2022-04-12 03:29:14范金波呂長鑫勵建榮
    中國食品學報 2022年3期
    關鍵詞:殘基位點光譜

    范金波,麻 奧,閔 爽,邢 莉,呂長鑫,勵建榮

    (渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013)

    綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid)反應生成的縮酚酸,是植物體在有氧呼吸過程中產生的一種苯丙素類化合物。CGA 屬于酚酸類物質,是一種有效的抗氧化劑,它在天然植物中廣泛存在,其中杜仲、金銀花、咖啡中含量相對較高[1]。CGA 還具有抗病毒、保肝利膽、降血壓和降血脂等生物活性[2-3]。除了多種生物活性外,有研究表明它在食品保鮮方面也有效,如桃貯藏[4]和生雞冷藏[5]。目前,CGA作為天然活性成分,成為食品領域研究的熱點。

    小分子活性成分與血清白蛋白的結合,不僅影響血清白蛋白的活性,還對其本身活性有一定影響。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)具有良好的物理特性及穩(wěn)定性,且與人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)具有76%的結構同源性,近年來許多研究將其作為HSA 的模型蛋白[6]。BSA 作為重要轉運蛋白,能與外源性和內源性小分子物質特異性結合。BSA 由3 個同源結構域(I,II,III)組成,每個結構域都由亞結構域A和B 組成[7]。每個位點都包含疏水性空腔,使BSA能夠容納和運輸各種分子[8]。其中,亞結構域IIA和IIIA 是配體結合的兩個主要位點[9]。此外,BSA因具有成本低、現(xiàn)成可用的優(yōu)點而被廣泛研究。Yao 等[10]通過多光譜和對接模擬得出CGA 可能通過與Cd2+形成氫鍵來減少Cd2+與BSA 的相互作用的結論。

    食品中所含蛋白質不僅能夠提供人體所需多種營養(yǎng)元素,而且決定食品的色澤、氣味、口感、狀態(tài)等感官品質。目前各種加工處理技術對蛋白質功能性質的影響是國內外研究的熱點領域。近年來,超聲波處理具有穿透力強、方向性好、能量大,且低成本、無害、環(huán)保等特點而作為一種新型的冷處理改性技術快速發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)提高超聲頻率對食品中蛋白質的疏水性有影響[11]。也有研究表明軟超聲處理可以導致紅酒中酚類物質增加[12]。然而,對于超聲波處理對食品中蛋白質與多酚的結合作用的影響尚缺乏研究。本研究旨在通過多光譜法分析超聲波處理對CGA 與BSA 結合作用的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    BSA(99%),北京百靈威科技有限公司;CGA(98%)、布洛芬 (Ibuprofen,IBU 98%)、華法林(Warfarin,WARF 98%),生工生物工程(上海)有限公司;無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸等為分析純試劑。試驗用水為去離子水。

    1.2 儀器與設備

    F-7000 熒光分光光度計,日本日立高新技術公司;FE20K 實驗室pH 計、ML104 電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司;UV-2700 紫外-可見光分光光度計,日本SHIMADZU 公司;Milli-Q Reference 型超純水機,德國默克密理博有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 溶液的配制 BSA 用水配制成濃度為1.2×10-6mol/L 的儲備液,CGA 先用無水乙醇溶解再加水配制成3.6×10-5mol/L 的儲備液(醇量不可超過儲備液的20%),6.0×10-6mol/L 的WARF 和IBU儲備液同樣以水為溶劑,0.2 mol/L 的磷酸緩沖液(pH 4.0):由磷酸氫二鈉與檸檬酸溶液在pH 計上調節(jié)得到。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存。

    1.3.2 CGA 與BSA 結合的熒光光譜 準確移取2 970,2 945,2 920,2 895,2 870,2 845,2 820,2 795 μL PBS 緩沖溶液到1~8 編號的離心管中,再分別加入30 μL 1.2×10-6mol/L 的BSA 標準溶液,最后在每個離心管中加入3.6×10-5mol/L CGA標準溶液至3 mL,振蕩混勻備用。上述樣品配制6 組,均分為兩份,分別置于25 ℃和37 ℃下反應30 min。接著再從每份中取兩組樣品,分別經(jīng)超聲頻率40 kHz 和53 kHz 處理30 min,剩余樣品繼續(xù)在原溫度下反應30 min。每次測樣前先取300 μL樣品潤洗標準石英比色皿3 次,接著取2 mL 樣品于比色皿中進行掃描(下同)。設定激發(fā)波長280 nm,激發(fā)光柵為2.5 nm,發(fā)射光柵為5 nm,測定290~450 nm 的熒光光譜并記錄。

    1.3.3 CGA 與BSA 結合的同步熒光光譜 樣品配制及處理同1.3.2 節(jié)。設定發(fā)射波長215 nm,200~350 nm 為激發(fā)波長掃描范圍,測定每組樣品的同步熒光光譜并記錄;發(fā)射波長260 nm,200~350 nm 為激發(fā)波長掃描范圍,測定每組樣品的同步熒光光譜并記錄。

    1.3.4 CGA 與BSA 結合位點研究 準確移取2 945,2 920,2 895,2 870,2 845,2 820,2 795,2 770 μL PBS 緩沖溶液和30 μL 1.2×10-6mol/L 的BSA標準溶液到1~8 編號的離心管中,再分別加入25 μL 7.2×10-4mol/L WARF 儲備液,充分振蕩混勻并反應15 min 后,均加入3.6×10-5mol/LCGA 標準溶液至3 mL,混均后置于25 ℃反應30 min。上述樣品配制兩組,其中一組在超聲頻率40 kHz 下反應30 min,另一組繼續(xù)在原溫度下反應30 min。設定激發(fā)波長280 nm,激發(fā)光柵為2.5 nm,發(fā)射光柵為5 nm,測定290~450 nm 的熒光光譜并記錄。數(shù)據(jù)處理時以未加入WARF 的樣品的熒光光譜數(shù)據(jù)為對照繪制猝滅率隨CGA 濃度變化的圖像。將標記物換為IBU 后重復上述步驟。

    1.3.5 CGA 與BSA 結合的紫外-可見吸收光譜樣品配制同1.3.2 節(jié) 上述樣品配制3 組,一組置于25 ℃反應30 min,另外兩組分別在超聲頻率為40,53 kHz 下處理30 min。設定狹縫寬度5 nm,狹縫間隔0.5 nm,測定250~500 nm 的紫外光譜并進行記錄。

    2 結果與分析

    2.1 超聲處理對CGA 與BSA 熒光發(fā)射光譜的影響

    熒光光譜法廣泛用于研究蛋白質熒光團對猝滅劑的可及性。BSA 含有的氨基酸殘基可以吸收電磁輻射而受到激發(fā),當激發(fā)光源停止時,殘基因吸收能量產生熒光。其中Trp 熒光的量子產率和發(fā)射最大波長對環(huán)境的極性和其生物大分子的結構變化非常敏感[13]。熒光猝滅是指分子間相互作用(如能量轉移、激發(fā)態(tài)反應、碰撞猝滅和基態(tài)絡合物形成)導致熒光團熒光的減少[14]。

    由圖1可知,溫度及超聲頻率不同,CGA 對BSA 的猝滅效果也不同。CGA 在340 nm 左右誘導BSA 發(fā)射信號的濃度依賴性降低[15]。不同條件下的熒光圖譜峰形均無明顯變化,隨CGA 濃度的升高,BSA 的熒光強度降低,峰形均出現(xiàn)紅移,說明CGA 的加入使熒光物質的極性增強,CGA-BSA復合物影響了BSA 的三級結構[16]。25 ℃、40 kHz時,峰值較未超聲組有輕微降低;但53 kHz 時,峰值顯著下降 (P<0.05)。37 ℃、40 kHz 時,CGA 與BSA 作用后的熒光強度有所下降,但53 kHz 時變化不大。在25 ℃、53 kHz 時,CGA 對于BSA 的熒光強度影響最大。

    圖1 不同溫度下超聲頻率對CGA 與BSA 作用的熒光光譜的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on fluorescence spectra of CGA and BSA at different temperature

    2.2 超聲處理對CGA 與BSA 同步熒光光譜的影響

    同步熒光光譜通常用來研究蛋白質與配體相互作用的相關構象變化,主要是測定酪氨酸(Tyrosine,Tyr)殘基與色氨酸(Tryptophan,Trp)殘基的熒光強度[17]。當激發(fā)和發(fā)射波長的差值Δλ 設置為15 nm 和60 nm 時,同步熒光可分別提供Tyr 和Trp 殘基的特征信息[18]。

    由圖2、圖3可知,隨CGA 濃度的升高,Trp與Tyr 的熒光強度均降低,峰形基本無變化,但峰值均發(fā)生藍移,表明BSA 的Trp 與Tyr 殘基附近的微環(huán)境疏水性增強。CGA 可能通過與Trp 和Tyr結合來誘導BSA 的構象變化,即CGA 與BSA 的結合位置可能在Trp 和Tyr 殘基附近。25 ℃、40 kHz 時,Tyr 與Trp 峰值無明顯變化 (P>0.05),而53 kHz 時,Tyr 與Trp 峰值均顯著降低 (P<0.05);37 ℃、40 kHz 時,峰值無明顯變化(P>0.05),而53 kHz 時,Tyr 與Trp 峰值均升高,說明猝滅效果有所下降。在25 ℃、53 kHz 時,CGA 對BSA 的同步熒光強度影響最大。

    圖2 25 ℃時超聲頻率對CGA 與BSA 作用的同步熒光光譜的影響Fig.2 Effect of ultrasonic frequency on synchronous fluorescence spectra of CGA and BSA at 25 ℃

    圖3 37 ℃時超聲頻率對CGA 與BSA 作用的同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on synchronous fluorescence spectra of CGA and BSA at 37 ℃

    2.3 熒光猝滅機理

    本文中熒光猝滅機理由Stern-Volmer 方程(1)和Acharya 方程(2)來進行描述[19]。

    式中:F0——未加入CGA 時BSA 的熒光峰值;F——加入CGA 后BSA 的熒光峰值;[Q]——CGA 的濃度,mol/L;τ0——熒光分子平均壽命,s,BSA 的τ0約為10-8s;Kq——生物分子的猝滅速率 常 數(shù),L/(mol·s);Ksv——Stern-Volmer 猝滅常數(shù),L/mol;Ka——Acharya 結合常數(shù),L/mol。

    由表1可知,CGA 與BSA 作用的猝滅速率常數(shù)Kq大于1012L/(mol·s),遠大于最大動態(tài)猝滅的Kq值,說明CGA 與BSA 形成了復合物且為靜態(tài)猝滅[20-21],許多以往的研究也證明了如茶多酚等多酚類物質與血清白蛋白發(fā)生靜態(tài)猝滅作用[22],因此結果可靠;溫度一定時,隨超聲頻率的升高,CGA 對于BSA 的猝滅常數(shù)Ksv增大;25 ℃時,經(jīng)超聲處理后的結合常數(shù)Ka明顯升高(P<0.05),說明超聲處理促進CGA 與BSA 的結合。37 ℃、40 kHz時,結合常數(shù)Ka相較未超聲處理有所增大,但53 kHz 時卻又降低,說明超聲處理超過一定頻率,反而會對CGA 與BSA 的結合產生抑制作用。

    表1 CGA 與BSA 相互作用的熒光猝滅常數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants of BSA by CGA

    2.4 熱力學性質

    蛋白質與小分子間的主要作用力類型為:范德華力、氫鍵、靜電相互作用以及疏水相互作用等[23]。根據(jù)Van's Hoff 方程(3)和熱力學方程(4)分別計算反應的焓變ΔH、吉布斯自由能ΔG 和熵變ΔS,并比較在頻率40,53 kHz 處理后數(shù)值的變化情況。

    式中:K1、K2為T1、T2時的結合常數(shù);ΔG——吉布斯自由能,kJ/mol;ΔH——焓變,kJ/mol;ΔS——熵變,J/(mol·K)。當ΔS 和ΔH 均大于0時,分子間作用力為疏水相互作用;當ΔH≈0,ΔS>0 時,為靜電相互作用;當ΔS 和ΔH 均小于0時則為氫鍵和范德華力[24-25]。

    由表2可知,25 ℃時,反應的ΔH<0,ΔG<0,ΔS<0,說明CGA 與BSA 的作用過程是一個熵減少,分子結合后自由能升高的自發(fā)放熱反應,結合前人的研究推斷此時分子間作用力為氫鍵。隨超聲頻率的升高,ΔH、ΔG 和ΔS 均減小,由此可知隨超聲頻率的升高,其自發(fā)反應越發(fā)強烈,放出的熱能也更高。37 ℃時,反應的ΔH>0,ΔG<0,ΔS>0,說明該過程是一個熵增加的自發(fā)吸熱反應,同時自由能降低,作用力為疏水相互作用。超聲頻率變化,反應所吸收的熱量也隨之改變。

    表2 CGA 與BSA 相互作用的熱力學常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of the interactions between CGA and BSA

    2.5 結合位點的研究

    WARF 和IBU 能與BSA 的子域ⅡA(Sudlow's site I)和子域ⅢA(Sudlow's site II)特異結合[26]。通過比較猝滅率推斷CGA 與BSA 的結合位點。

    由圖4內插圖可知,標記物的加入導致猝滅率降低,因此判斷在未超聲處理時CGA 與BSA相互作用的結合位點在子域ⅡA 和子域ⅢA 之間。由圖5內插圖可知,40 kHz 時,加入標記物后,猝滅率在低CGA 濃度下無明顯變化,而隨CGA濃度升高猝滅率又明顯降低,說明超聲可改變CGA 在低濃度下的結合位點,而對高濃度CGA 與BSA 的結合位點無影響。

    圖4 WARF 與IBU 對于CGA 與BSA 作用的熒光光譜的影響Fig.4 Effects of WARF and IBU on fluorescence spectra of CGA and BSA

    圖5 40 kHz 超聲下WARF 與IBU 對于CGA 與BSA 作用的熒光光譜的影響Fig.5 Effects of WARF and IBU on fluorescence spectra of CGA and BSA under 40 kHz ultrasonic treatment

    2.6 超聲處理對CGA 與BSA 紫外光譜的影響

    紫外-可見吸收光譜法廣泛用于探索蛋白質的結構變化和研究蛋白質配體復合物的形成,是通過分析蛋白質Trp 和Tyr 殘基周圍的變化來研究蛋白質與配體相互作用的有效工具[26]。CGA 與BSA 的反應產物對于紫外光的吸收具有專一性,即一定結構的分子只可以吸收一定的能量,這樣就可以通過紫外光譜來研究其產物的結構特點及其特性。

    由圖6可知,25 ℃時,紫外光譜峰形無變化,隨CGA 濃度的升高,吸光度值增大。在靜態(tài)猝滅中,猝滅劑和蛋白質之間形成復合物。而在動態(tài)猝滅中,猝滅劑與蛋白質發(fā)生碰撞擴散。動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài),而不影響熒光物質的紫外吸收光譜的變化[27]。結果再次證實了CGA 與BSA 的相互作用是通過靜態(tài)猝滅機制實現(xiàn)的。未超聲的吸光度峰值比超聲后的大,紫外吸收光譜發(fā)生15 nm 的藍移,說明超聲處理后CGA 與BSA反應的產物發(fā)生部分解離,生成了新的物質;同時超聲處理導致BSA 的結構骨架變得舒展,二級構象發(fā)生改變,微環(huán)境疏水性減小。同時,也有研究表明超聲處理同樣會迫使β-乳球蛋白的二、三級結構發(fā)生改變[28]。

    圖6 25 ℃時超聲頻率對CGA 與BSA 作用的紫外-可見吸收光譜的影響Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on UV-vis absorption spectra of CGA and BSA at 25 ℃

    3 結論

    CGA 可與BSA 發(fā)生結合作用且自發(fā)進行,猝滅類型為靜態(tài)猝滅。CGA 與BSA 作用的結合位點在亞結構域ⅡA 和亞結構域ⅢA 之間,且CGA 在濃度低時與BSA 的結合位點受超聲處理影響。25℃時,CGA 與BSA 的反應是一個熵減少的自發(fā)放熱反應,作用力為氫鍵和范德華力;37 ℃時是一個熵增加的自發(fā)吸熱反應,作用力為疏水相互作用,因此溫度可能改變CGA 與BSA 結合的作用力。超聲處理可使CGA-BSA 復合物的構象發(fā)生一定改變,并且對CGA 與BSA 的結合起增強作用。超聲處理不會影響CGA 與BSA 結合的作用力類型,只影響反應的強度,但可能對CGA 在BSA 上的結合位點造成一定影響。經(jīng)超聲處理后,CGABSA 復合物發(fā)生部分分解,BSA 的二級構象發(fā)生變化,使BSA 的氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變,即極性增強,疏水性變小。研究結果表明CGA 與BSA 的相互作用受超聲處理的影響,且不同超聲頻率影響不同。在生產加工中選擇合適的處理條件及處理方式可以達到一定的目的。本研究結果將為超聲處理對蛋白質與配體結合的影響提供有益的參考。

    猜你喜歡
    殘基位點光譜
    基于三維Saab變換的高光譜圖像壓縮方法
    基于各向異性網(wǎng)絡模型研究δ阿片受體的動力學與關鍵殘基*
    鎳基單晶高溫合金多組元置換的第一性原理研究
    上海金屬(2021年6期)2021-12-02 10:47:20
    CLOCK基因rs4580704多態(tài)性位點與2型糖尿病和睡眠質量的相關性
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構體中的應用
    二項式通項公式在遺傳學計算中的運用*
    生物學通報(2019年3期)2019-02-17 18:03:58
    蛋白質二級結構序列與殘基種類間關聯(lián)的分析
    星載近紅外高光譜CO2遙感進展
    中國光學(2015年5期)2015-12-09 09:00:28
    基于支持向量機的蛋白質相互作用界面熱點殘基預測
    苦味酸與牛血清蛋白相互作用的光譜研究
    精品少妇黑人巨大在线播放 | 一夜夜www| 国产乱人视频| 99视频精品全部免费 在线| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 免费观看人在逋| 97热精品久久久久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 色吧在线观看| 免费观看a级毛片全部| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 中国国产av一级| 狠狠狠狠99中文字幕| 在现免费观看毛片| 国产视频内射| 高清毛片免费看| 午夜精品一区二区三区免费看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲色图av天堂| 91久久精品电影网| 国产 一区精品| 网址你懂的国产日韩在线| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久久久大av| 美女内射精品一级片tv| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 日日撸夜夜添| 97热精品久久久久久| 高清毛片免费看| 国产精品99久久久久久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 青春草亚洲视频在线观看| 51国产日韩欧美| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日本-黄色视频高清免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 青春草亚洲视频在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产淫语在线视频| 永久免费av网站大全| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日韩中字成人| 好男人视频免费观看在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 九草在线视频观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久午夜福利片| 亚洲国产精品国产精品| 永久网站在线| 久久精品综合一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 伦精品一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 免费观看人在逋| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 一个人免费在线观看电影| 亚洲精品456在线播放app| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲av.av天堂| 一本久久精品| 赤兔流量卡办理| 亚洲av中文av极速乱| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品野战在线观看| 久久精品人妻少妇| 亚洲最大成人av| 日本黄色片子视频| 天天一区二区日本电影三级| 99久久中文字幕三级久久日本| 美女cb高潮喷水在线观看| 天堂影院成人在线观看| 欧美三级亚洲精品| 床上黄色一级片| 国产美女午夜福利| 看免费成人av毛片| 日韩大片免费观看网站 | www.av在线官网国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 免费观看性生交大片5| 中文字幕免费在线视频6| 少妇高潮的动态图| 亚洲伊人久久精品综合 | 天天一区二区日本电影三级| 黄片wwwwww| 69人妻影院| 国产人妻一区二区三区在| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 1000部很黄的大片| 午夜亚洲福利在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲欧洲国产日韩| 国产在视频线精品| 国产午夜精品一二区理论片| eeuss影院久久| 天天躁日日操中文字幕| 99热精品在线国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 中文字幕久久专区| 亚洲乱码一区二区免费版| 两个人视频免费观看高清| 欧美成人午夜免费资源| 国产午夜福利久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费观看的影片在线观看| 免费观看精品视频网站| 精品人妻视频免费看| 丝袜美腿在线中文| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜免费激情av| 国产免费又黄又爽又色| 2021天堂中文幕一二区在线观| 两个人视频免费观看高清| 亚洲精品一区蜜桃| 成人毛片a级毛片在线播放| 我要看日韩黄色一级片| av黄色大香蕉| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美97在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 美女内射精品一级片tv| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品,欧美精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费人成在线观看视频色| 波多野结衣高清无吗| 嫩草影院新地址| 九九爱精品视频在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产乱人视频| 两个人视频免费观看高清| 老女人水多毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 天美传媒精品一区二区| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩欧美 国产精品| 亚洲自偷自拍三级| av国产久精品久网站免费入址| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久精品国产亚洲av天美| 成人综合一区亚洲| 大香蕉久久网| 亚洲人成网站在线播| 欧美潮喷喷水| 小说图片视频综合网站| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 丝袜美腿在线中文| 韩国av在线不卡| 成人美女网站在线观看视频| 黄色日韩在线| av国产免费在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 日本一二三区视频观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 色综合色国产| 国产成人福利小说| 国产91av在线免费观看| 91久久精品电影网| 成人漫画全彩无遮挡| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久久电影| 国产视频首页在线观看| av线在线观看网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品久久久久久久末码| 赤兔流量卡办理| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲五月天丁香| 一级爰片在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| av在线亚洲专区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品456在线播放app| 免费观看在线日韩| 色播亚洲综合网| 中文字幕久久专区| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜爱爱视频在线播放| 人体艺术视频欧美日本| 日本爱情动作片www.在线观看| av在线老鸭窝| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久久九九精品影院| 黄色一级大片看看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 高清毛片免费看| 在线观看av片永久免费下载| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成人av在线播放网站| 亚洲国产精品合色在线| 中国国产av一级| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品福利在线免费观看| 在线免费十八禁| 国产精品国产高清国产av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 永久免费av网站大全| 日日干狠狠操夜夜爽| 联通29元200g的流量卡| 国产成人91sexporn| 日韩一区二区三区影片| 日韩欧美 国产精品| 日韩av在线大香蕉| 看片在线看免费视频| 草草在线视频免费看| 简卡轻食公司| 精品熟女少妇av免费看| 精品久久久久久久末码| 看免费成人av毛片| 国产视频首页在线观看| 免费观看精品视频网站| 美女黄网站色视频| av线在线观看网站| 91av网一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲中文字幕日韩| 欧美激情在线99| 赤兔流量卡办理| av免费在线看不卡| 日本三级黄在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 简卡轻食公司| 永久网站在线| 性色avwww在线观看| 麻豆成人av视频| 国产男人的电影天堂91| 中文在线观看免费www的网站| 免费看a级黄色片| 老司机影院成人| 国产黄片美女视频| 一级毛片久久久久久久久女| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 免费av毛片视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久午夜欧美精品| 一本久久精品| 国产高清不卡午夜福利| 69av精品久久久久久| 欧美高清成人免费视频www| 丰满人妻一区二区三区视频av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲最大成人手机在线| 国产熟女欧美一区二区| 日本爱情动作片www.在线观看| 高清在线视频一区二区三区 | 一级黄片播放器| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久精品人妻少妇| 亚洲欧洲日产国产| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品1区2区在线观看.| 精品久久久久久久久av| 秋霞在线观看毛片| 亚洲欧美日韩东京热| ponron亚洲| 亚洲伊人久久精品综合 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩在线高清观看一区二区三区| 插逼视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 少妇的逼好多水| 久久午夜福利片| 美女高潮的动态| 国产精品电影一区二区三区| 黄色日韩在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 男女视频在线观看网站免费| a级毛色黄片| 99热精品在线国产| 成人亚洲欧美一区二区av| 91aial.com中文字幕在线观看| 高清av免费在线| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久这里有精品视频免费| 全区人妻精品视频| 久久精品国产自在天天线| 我要看日韩黄色一级片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 嫩草影院新地址| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线观看av片永久免费下载| 日韩欧美精品免费久久| 久久久欧美国产精品| 五月伊人婷婷丁香| 国产淫片久久久久久久久| 天天一区二区日本电影三级| 国产成人福利小说| 精品久久久久久成人av| 国产精品熟女久久久久浪| 精品久久久久久成人av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产精品三级大全| 亚洲人成网站在线播| av在线蜜桃| 好男人视频免费观看在线| 欧美97在线视频| 婷婷六月久久综合丁香| 能在线免费观看的黄片| 国语自产精品视频在线第100页| 色哟哟·www| 精品久久久久久久久久久久久| 在线a可以看的网站| 一边亲一边摸免费视频| 免费看日本二区| 永久免费av网站大全| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 在现免费观看毛片| .国产精品久久| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩视频在线欧美| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产成人freesex在线| 国产黄a三级三级三级人| 极品教师在线视频| 久久久久久久久久久免费av| 一边亲一边摸免费视频| 久热久热在线精品观看| 身体一侧抽搐| 亚洲国产精品成人综合色| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲av男天堂| 国产精品一二三区在线看| 高清午夜精品一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲精品456在线播放app| 欧美精品一区二区大全| 卡戴珊不雅视频在线播放| 18+在线观看网站| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜激情福利司机影院| 波野结衣二区三区在线| 亚洲av福利一区| 亚洲精品456在线播放app| 我的老师免费观看完整版| 日韩强制内射视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 1000部很黄的大片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产免费视频播放在线视频 | 欧美区成人在线视频| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲丝袜综合中文字幕| 爱豆传媒免费全集在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产极品精品免费视频能看的| 99九九线精品视频在线观看视频| 99久久人妻综合| 午夜福利高清视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产探花在线观看一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 内地一区二区视频在线| 我的女老师完整版在线观看| 成人综合一区亚洲| 变态另类丝袜制服| kizo精华| 国产黄片视频在线免费观看| 国语自产精品视频在线第100页| 天天躁日日操中文字幕| 日本免费在线观看一区| 一本一本综合久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 午夜激情福利司机影院| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产一级毛片在线| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲美女搞黄在线观看| 97超视频在线观看视频| 成人综合一区亚洲| 亚洲最大成人av| 久久亚洲国产成人精品v| 偷拍熟女少妇极品色| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久精品人妻少妇| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| av线在线观看网站| 国产高清视频在线观看网站| 国产在线男女| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲最大成人中文| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 1024手机看黄色片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品伦人一区二区| 精品一区二区免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久久久国产a免费观看| 在线播放无遮挡| 国产黄色小视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲va在线va天堂va国产| 大话2 男鬼变身卡| 久久人人爽人人片av| 国产精品无大码| 亚洲av电影不卡..在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品野战在线观看| 天美传媒精品一区二区| 一级黄色大片毛片| 国产真实乱freesex| 男人舔奶头视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产高清三级在线| 淫秽高清视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产乱人视频| 久久草成人影院| 99久久精品热视频| 免费人成在线观看视频色| 我要看日韩黄色一级片| 免费无遮挡裸体视频| 精品久久久久久久末码| 国产高潮美女av| 久久99热6这里只有精品| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜久久久久精精品| 床上黄色一级片| 中文资源天堂在线| 六月丁香七月| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品国产三级国产专区5o | 亚洲三级黄色毛片| 超碰av人人做人人爽久久| h日本视频在线播放| 免费观看的影片在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 如何舔出高潮| 亚洲av免费在线观看| 麻豆一二三区av精品| 一区二区三区高清视频在线| 国产淫片久久久久久久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美极品一区二区三区四区| 国产一区亚洲一区在线观看| 在线播放无遮挡| 亚洲av熟女| 在线天堂最新版资源| 日韩 亚洲 欧美在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 99热全是精品| 黄片wwwwww| 国产高清三级在线| 听说在线观看完整版免费高清| 99久久九九国产精品国产免费| 禁无遮挡网站| 久久99精品国语久久久| 亚洲国产精品国产精品| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜精品在线福利| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产在线一区二区三区精 | 午夜久久久久精精品| 成年女人永久免费观看视频| 岛国毛片在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 久久99精品国语久久久| 国产乱人偷精品视频| 麻豆国产97在线/欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱| av国产久精品久网站免费入址| 一区二区三区高清视频在线| 特大巨黑吊av在线直播| 精品午夜福利在线看| av在线亚洲专区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲内射少妇av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜精品在线福利| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品一区二区在线观看99 | 老司机福利观看| 黑人高潮一二区| 色5月婷婷丁香| 成人无遮挡网站| 在线观看av片永久免费下载| 免费黄网站久久成人精品| 少妇的逼好多水| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲最大成人av| 在线观看66精品国产| 免费黄色在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合 | 国产高清视频在线观看网站| 特级一级黄色大片| 在现免费观看毛片| 婷婷色综合大香蕉| 成人欧美大片| 欧美成人a在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲欧美精品专区久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美bdsm另类| 国产乱人偷精品视频| 99热网站在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 久久久久久久久大av| 真实男女啪啪啪动态图| 国产成人91sexporn| 精品久久久久久久久久久久久| 免费av毛片视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 高清日韩中文字幕在线| 欧美极品一区二区三区四区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品伦人一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 免费看日本二区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产美女午夜福利| 午夜福利在线在线| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品无大码| 国产一级毛片在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 99久久精品热视频| 天堂影院成人在线观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲久久久久久中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 麻豆一二三区av精品| 午夜亚洲福利在线播放| 免费无遮挡裸体视频| 99在线视频只有这里精品首页| 色噜噜av男人的天堂激情| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩高清综合在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 日本-黄色视频高清免费观看| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲中文字幕日韩| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产日韩欧美在线精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 日本av手机在线免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 级片在线观看| 免费观看性生交大片5| 日韩一本色道免费dvd| 老女人水多毛片| 久久6这里有精品| 婷婷色麻豆天堂久久 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲不卡免费看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品一区二区性色av| 色尼玛亚洲综合影院| 视频中文字幕在线观看| 久久热精品热| 丝袜喷水一区| 久久6这里有精品| 国产av在哪里看| 免费人成在线观看视频色| 性色avwww在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777|