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    超聲波處理對綠原酸與牛血清白蛋白結合作用的影響

    2022-04-12 03:29:14范金波呂長鑫勵建榮
    中國食品學報 2022年3期
    關鍵詞:殘基位點光譜

    范金波,麻 奧,閔 爽,邢 莉,呂長鑫,勵建榮

    (渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013)

    綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid)反應生成的縮酚酸,是植物體在有氧呼吸過程中產生的一種苯丙素類化合物。CGA 屬于酚酸類物質,是一種有效的抗氧化劑,它在天然植物中廣泛存在,其中杜仲、金銀花、咖啡中含量相對較高[1]。CGA 還具有抗病毒、保肝利膽、降血壓和降血脂等生物活性[2-3]。除了多種生物活性外,有研究表明它在食品保鮮方面也有效,如桃貯藏[4]和生雞冷藏[5]。目前,CGA作為天然活性成分,成為食品領域研究的熱點。

    小分子活性成分與血清白蛋白的結合,不僅影響血清白蛋白的活性,還對其本身活性有一定影響。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)具有良好的物理特性及穩(wěn)定性,且與人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)具有76%的結構同源性,近年來許多研究將其作為HSA 的模型蛋白[6]。BSA 作為重要轉運蛋白,能與外源性和內源性小分子物質特異性結合。BSA 由3 個同源結構域(I,II,III)組成,每個結構域都由亞結構域A和B 組成[7]。每個位點都包含疏水性空腔,使BSA能夠容納和運輸各種分子[8]。其中,亞結構域IIA和IIIA 是配體結合的兩個主要位點[9]。此外,BSA因具有成本低、現(xiàn)成可用的優(yōu)點而被廣泛研究。Yao 等[10]通過多光譜和對接模擬得出CGA 可能通過與Cd2+形成氫鍵來減少Cd2+與BSA 的相互作用的結論。

    食品中所含蛋白質不僅能夠提供人體所需多種營養(yǎng)元素,而且決定食品的色澤、氣味、口感、狀態(tài)等感官品質。目前各種加工處理技術對蛋白質功能性質的影響是國內外研究的熱點領域。近年來,超聲波處理具有穿透力強、方向性好、能量大,且低成本、無害、環(huán)保等特點而作為一種新型的冷處理改性技術快速發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)提高超聲頻率對食品中蛋白質的疏水性有影響[11]。也有研究表明軟超聲處理可以導致紅酒中酚類物質增加[12]。然而,對于超聲波處理對食品中蛋白質與多酚的結合作用的影響尚缺乏研究。本研究旨在通過多光譜法分析超聲波處理對CGA 與BSA 結合作用的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    BSA(99%),北京百靈威科技有限公司;CGA(98%)、布洛芬 (Ibuprofen,IBU 98%)、華法林(Warfarin,WARF 98%),生工生物工程(上海)有限公司;無水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸等為分析純試劑。試驗用水為去離子水。

    1.2 儀器與設備

    F-7000 熒光分光光度計,日本日立高新技術公司;FE20K 實驗室pH 計、ML104 電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司;UV-2700 紫外-可見光分光光度計,日本SHIMADZU 公司;Milli-Q Reference 型超純水機,德國默克密理博有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 溶液的配制 BSA 用水配制成濃度為1.2×10-6mol/L 的儲備液,CGA 先用無水乙醇溶解再加水配制成3.6×10-5mol/L 的儲備液(醇量不可超過儲備液的20%),6.0×10-6mol/L 的WARF 和IBU儲備液同樣以水為溶劑,0.2 mol/L 的磷酸緩沖液(pH 4.0):由磷酸氫二鈉與檸檬酸溶液在pH 計上調節(jié)得到。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存。

    1.3.2 CGA 與BSA 結合的熒光光譜 準確移取2 970,2 945,2 920,2 895,2 870,2 845,2 820,2 795 μL PBS 緩沖溶液到1~8 編號的離心管中,再分別加入30 μL 1.2×10-6mol/L 的BSA 標準溶液,最后在每個離心管中加入3.6×10-5mol/L CGA標準溶液至3 mL,振蕩混勻備用。上述樣品配制6 組,均分為兩份,分別置于25 ℃和37 ℃下反應30 min。接著再從每份中取兩組樣品,分別經(jīng)超聲頻率40 kHz 和53 kHz 處理30 min,剩余樣品繼續(xù)在原溫度下反應30 min。每次測樣前先取300 μL樣品潤洗標準石英比色皿3 次,接著取2 mL 樣品于比色皿中進行掃描(下同)。設定激發(fā)波長280 nm,激發(fā)光柵為2.5 nm,發(fā)射光柵為5 nm,測定290~450 nm 的熒光光譜并記錄。

    1.3.3 CGA 與BSA 結合的同步熒光光譜 樣品配制及處理同1.3.2 節(jié)。設定發(fā)射波長215 nm,200~350 nm 為激發(fā)波長掃描范圍,測定每組樣品的同步熒光光譜并記錄;發(fā)射波長260 nm,200~350 nm 為激發(fā)波長掃描范圍,測定每組樣品的同步熒光光譜并記錄。

    1.3.4 CGA 與BSA 結合位點研究 準確移取2 945,2 920,2 895,2 870,2 845,2 820,2 795,2 770 μL PBS 緩沖溶液和30 μL 1.2×10-6mol/L 的BSA標準溶液到1~8 編號的離心管中,再分別加入25 μL 7.2×10-4mol/L WARF 儲備液,充分振蕩混勻并反應15 min 后,均加入3.6×10-5mol/LCGA 標準溶液至3 mL,混均后置于25 ℃反應30 min。上述樣品配制兩組,其中一組在超聲頻率40 kHz 下反應30 min,另一組繼續(xù)在原溫度下反應30 min。設定激發(fā)波長280 nm,激發(fā)光柵為2.5 nm,發(fā)射光柵為5 nm,測定290~450 nm 的熒光光譜并記錄。數(shù)據(jù)處理時以未加入WARF 的樣品的熒光光譜數(shù)據(jù)為對照繪制猝滅率隨CGA 濃度變化的圖像。將標記物換為IBU 后重復上述步驟。

    1.3.5 CGA 與BSA 結合的紫外-可見吸收光譜樣品配制同1.3.2 節(jié) 上述樣品配制3 組,一組置于25 ℃反應30 min,另外兩組分別在超聲頻率為40,53 kHz 下處理30 min。設定狹縫寬度5 nm,狹縫間隔0.5 nm,測定250~500 nm 的紫外光譜并進行記錄。

    2 結果與分析

    2.1 超聲處理對CGA 與BSA 熒光發(fā)射光譜的影響

    熒光光譜法廣泛用于研究蛋白質熒光團對猝滅劑的可及性。BSA 含有的氨基酸殘基可以吸收電磁輻射而受到激發(fā),當激發(fā)光源停止時,殘基因吸收能量產生熒光。其中Trp 熒光的量子產率和發(fā)射最大波長對環(huán)境的極性和其生物大分子的結構變化非常敏感[13]。熒光猝滅是指分子間相互作用(如能量轉移、激發(fā)態(tài)反應、碰撞猝滅和基態(tài)絡合物形成)導致熒光團熒光的減少[14]。

    由圖1可知,溫度及超聲頻率不同,CGA 對BSA 的猝滅效果也不同。CGA 在340 nm 左右誘導BSA 發(fā)射信號的濃度依賴性降低[15]。不同條件下的熒光圖譜峰形均無明顯變化,隨CGA 濃度的升高,BSA 的熒光強度降低,峰形均出現(xiàn)紅移,說明CGA 的加入使熒光物質的極性增強,CGA-BSA復合物影響了BSA 的三級結構[16]。25 ℃、40 kHz時,峰值較未超聲組有輕微降低;但53 kHz 時,峰值顯著下降 (P<0.05)。37 ℃、40 kHz 時,CGA 與BSA 作用后的熒光強度有所下降,但53 kHz 時變化不大。在25 ℃、53 kHz 時,CGA 對于BSA 的熒光強度影響最大。

    圖1 不同溫度下超聲頻率對CGA 與BSA 作用的熒光光譜的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on fluorescence spectra of CGA and BSA at different temperature

    2.2 超聲處理對CGA 與BSA 同步熒光光譜的影響

    同步熒光光譜通常用來研究蛋白質與配體相互作用的相關構象變化,主要是測定酪氨酸(Tyrosine,Tyr)殘基與色氨酸(Tryptophan,Trp)殘基的熒光強度[17]。當激發(fā)和發(fā)射波長的差值Δλ 設置為15 nm 和60 nm 時,同步熒光可分別提供Tyr 和Trp 殘基的特征信息[18]。

    由圖2、圖3可知,隨CGA 濃度的升高,Trp與Tyr 的熒光強度均降低,峰形基本無變化,但峰值均發(fā)生藍移,表明BSA 的Trp 與Tyr 殘基附近的微環(huán)境疏水性增強。CGA 可能通過與Trp 和Tyr結合來誘導BSA 的構象變化,即CGA 與BSA 的結合位置可能在Trp 和Tyr 殘基附近。25 ℃、40 kHz 時,Tyr 與Trp 峰值無明顯變化 (P>0.05),而53 kHz 時,Tyr 與Trp 峰值均顯著降低 (P<0.05);37 ℃、40 kHz 時,峰值無明顯變化(P>0.05),而53 kHz 時,Tyr 與Trp 峰值均升高,說明猝滅效果有所下降。在25 ℃、53 kHz 時,CGA 對BSA 的同步熒光強度影響最大。

    圖2 25 ℃時超聲頻率對CGA 與BSA 作用的同步熒光光譜的影響Fig.2 Effect of ultrasonic frequency on synchronous fluorescence spectra of CGA and BSA at 25 ℃

    圖3 37 ℃時超聲頻率對CGA 與BSA 作用的同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasonic frequency on synchronous fluorescence spectra of CGA and BSA at 37 ℃

    2.3 熒光猝滅機理

    本文中熒光猝滅機理由Stern-Volmer 方程(1)和Acharya 方程(2)來進行描述[19]。

    式中:F0——未加入CGA 時BSA 的熒光峰值;F——加入CGA 后BSA 的熒光峰值;[Q]——CGA 的濃度,mol/L;τ0——熒光分子平均壽命,s,BSA 的τ0約為10-8s;Kq——生物分子的猝滅速率 常 數(shù),L/(mol·s);Ksv——Stern-Volmer 猝滅常數(shù),L/mol;Ka——Acharya 結合常數(shù),L/mol。

    由表1可知,CGA 與BSA 作用的猝滅速率常數(shù)Kq大于1012L/(mol·s),遠大于最大動態(tài)猝滅的Kq值,說明CGA 與BSA 形成了復合物且為靜態(tài)猝滅[20-21],許多以往的研究也證明了如茶多酚等多酚類物質與血清白蛋白發(fā)生靜態(tài)猝滅作用[22],因此結果可靠;溫度一定時,隨超聲頻率的升高,CGA 對于BSA 的猝滅常數(shù)Ksv增大;25 ℃時,經(jīng)超聲處理后的結合常數(shù)Ka明顯升高(P<0.05),說明超聲處理促進CGA 與BSA 的結合。37 ℃、40 kHz時,結合常數(shù)Ka相較未超聲處理有所增大,但53 kHz 時卻又降低,說明超聲處理超過一定頻率,反而會對CGA 與BSA 的結合產生抑制作用。

    表1 CGA 與BSA 相互作用的熒光猝滅常數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants of BSA by CGA

    2.4 熱力學性質

    蛋白質與小分子間的主要作用力類型為:范德華力、氫鍵、靜電相互作用以及疏水相互作用等[23]。根據(jù)Van's Hoff 方程(3)和熱力學方程(4)分別計算反應的焓變ΔH、吉布斯自由能ΔG 和熵變ΔS,并比較在頻率40,53 kHz 處理后數(shù)值的變化情況。

    式中:K1、K2為T1、T2時的結合常數(shù);ΔG——吉布斯自由能,kJ/mol;ΔH——焓變,kJ/mol;ΔS——熵變,J/(mol·K)。當ΔS 和ΔH 均大于0時,分子間作用力為疏水相互作用;當ΔH≈0,ΔS>0 時,為靜電相互作用;當ΔS 和ΔH 均小于0時則為氫鍵和范德華力[24-25]。

    由表2可知,25 ℃時,反應的ΔH<0,ΔG<0,ΔS<0,說明CGA 與BSA 的作用過程是一個熵減少,分子結合后自由能升高的自發(fā)放熱反應,結合前人的研究推斷此時分子間作用力為氫鍵。隨超聲頻率的升高,ΔH、ΔG 和ΔS 均減小,由此可知隨超聲頻率的升高,其自發(fā)反應越發(fā)強烈,放出的熱能也更高。37 ℃時,反應的ΔH>0,ΔG<0,ΔS>0,說明該過程是一個熵增加的自發(fā)吸熱反應,同時自由能降低,作用力為疏水相互作用。超聲頻率變化,反應所吸收的熱量也隨之改變。

    表2 CGA 與BSA 相互作用的熱力學常數(shù)Table 2 Thermodynamic constants of the interactions between CGA and BSA

    2.5 結合位點的研究

    WARF 和IBU 能與BSA 的子域ⅡA(Sudlow's site I)和子域ⅢA(Sudlow's site II)特異結合[26]。通過比較猝滅率推斷CGA 與BSA 的結合位點。

    由圖4內插圖可知,標記物的加入導致猝滅率降低,因此判斷在未超聲處理時CGA 與BSA相互作用的結合位點在子域ⅡA 和子域ⅢA 之間。由圖5內插圖可知,40 kHz 時,加入標記物后,猝滅率在低CGA 濃度下無明顯變化,而隨CGA濃度升高猝滅率又明顯降低,說明超聲可改變CGA 在低濃度下的結合位點,而對高濃度CGA 與BSA 的結合位點無影響。

    圖4 WARF 與IBU 對于CGA 與BSA 作用的熒光光譜的影響Fig.4 Effects of WARF and IBU on fluorescence spectra of CGA and BSA

    圖5 40 kHz 超聲下WARF 與IBU 對于CGA 與BSA 作用的熒光光譜的影響Fig.5 Effects of WARF and IBU on fluorescence spectra of CGA and BSA under 40 kHz ultrasonic treatment

    2.6 超聲處理對CGA 與BSA 紫外光譜的影響

    紫外-可見吸收光譜法廣泛用于探索蛋白質的結構變化和研究蛋白質配體復合物的形成,是通過分析蛋白質Trp 和Tyr 殘基周圍的變化來研究蛋白質與配體相互作用的有效工具[26]。CGA 與BSA 的反應產物對于紫外光的吸收具有專一性,即一定結構的分子只可以吸收一定的能量,這樣就可以通過紫外光譜來研究其產物的結構特點及其特性。

    由圖6可知,25 ℃時,紫外光譜峰形無變化,隨CGA 濃度的升高,吸光度值增大。在靜態(tài)猝滅中,猝滅劑和蛋白質之間形成復合物。而在動態(tài)猝滅中,猝滅劑與蛋白質發(fā)生碰撞擴散。動態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài),而不影響熒光物質的紫外吸收光譜的變化[27]。結果再次證實了CGA 與BSA 的相互作用是通過靜態(tài)猝滅機制實現(xiàn)的。未超聲的吸光度峰值比超聲后的大,紫外吸收光譜發(fā)生15 nm 的藍移,說明超聲處理后CGA 與BSA反應的產物發(fā)生部分解離,生成了新的物質;同時超聲處理導致BSA 的結構骨架變得舒展,二級構象發(fā)生改變,微環(huán)境疏水性減小。同時,也有研究表明超聲處理同樣會迫使β-乳球蛋白的二、三級結構發(fā)生改變[28]。

    圖6 25 ℃時超聲頻率對CGA 與BSA 作用的紫外-可見吸收光譜的影響Fig.6 Effect of ultrasonic frequency on UV-vis absorption spectra of CGA and BSA at 25 ℃

    3 結論

    CGA 可與BSA 發(fā)生結合作用且自發(fā)進行,猝滅類型為靜態(tài)猝滅。CGA 與BSA 作用的結合位點在亞結構域ⅡA 和亞結構域ⅢA 之間,且CGA 在濃度低時與BSA 的結合位點受超聲處理影響。25℃時,CGA 與BSA 的反應是一個熵減少的自發(fā)放熱反應,作用力為氫鍵和范德華力;37 ℃時是一個熵增加的自發(fā)吸熱反應,作用力為疏水相互作用,因此溫度可能改變CGA 與BSA 結合的作用力。超聲處理可使CGA-BSA 復合物的構象發(fā)生一定改變,并且對CGA 與BSA 的結合起增強作用。超聲處理不會影響CGA 與BSA 結合的作用力類型,只影響反應的強度,但可能對CGA 在BSA 上的結合位點造成一定影響。經(jīng)超聲處理后,CGABSA 復合物發(fā)生部分分解,BSA 的二級構象發(fā)生變化,使BSA 的氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變,即極性增強,疏水性變小。研究結果表明CGA 與BSA 的相互作用受超聲處理的影響,且不同超聲頻率影響不同。在生產加工中選擇合適的處理條件及處理方式可以達到一定的目的。本研究結果將為超聲處理對蛋白質與配體結合的影響提供有益的參考。

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