體外膜肺氧合治療對成人暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜的影響

劉鋒鋒，鄭建杰，劉淼淼

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西 西安 710061)

暴發(fā)性心肌炎是由病毒感染、自身免疫性疾病、毒素/藥物毒性等原因導致心肌炎性損傷心臟功能受損，是心肌炎中最嚴重和特殊的類型，起病急驟，進展迅速，患者很快出現(xiàn)血液動力學異常和嚴重心律失常，早期病死率極高[1-2]。暴發(fā)性心肌炎患者出現(xiàn)異常免疫系統(tǒng)激活，導致免疫細胞向多個組織器官募集浸潤，細胞因子釋放和過度的免疫應答所致的“細胞因子風暴”亦可造成多臟器功能衰竭(如：呼吸衰竭、肝功能衰竭、腎功能衰竭等)[3-4]。以生命支持為依托的綜合救治方案是暴發(fā)性心肌炎的中心環(huán)節(jié)[5]。體外膜肺氧合(Extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)是重要的呼吸循環(huán)支持手段，對暴發(fā)性心肌炎的救治中已獲得大量臨床數(shù)據(jù)支持[6-7]。但有關ECMO對暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜的影響罕見相關報道。因此，本研究首先分析了暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜，并觀察ECMO治療對暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本研究方案通過西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，入組患者法定監(jiān)護人、對照者均簽署知情同意書。入組2017年4月至2021年6月在我科就診的成人暴發(fā)性心肌炎患者28例，所有患者診斷均符合《成人暴發(fā)性心肌炎診斷與治療中國專家共識》[5]的標準，病例納入標準：①臨床表現(xiàn)包括短時間內發(fā)生心慌、心悸、胸悶、胸痛、黑曚、暈厥、呼吸困難等；②心電圖檢查發(fā)現(xiàn)心律失常、ST段改變，心臟彩超檢查發(fā)現(xiàn)彌漫性室壁運動減低、收縮功能異常；③實驗室檢查發(fā)現(xiàn)多種心肌損傷標志物(包括：肌鈣蛋白Ⅰ、腦鈉肽、肌酸激酶同工酶MB)急性升高。排除標準：①有其他心臟病史(如：風濕性心臟病、先天性心臟病、心肌梗死等)；②惡性腫瘤患者；③合并慢性病毒感染者；④孕產婦。入組同時期在我院體檢中心進行健康查體的志愿者19例作為對照組。暴發(fā)性心肌炎組28例，男19例，女9例，年齡21～50歲，平均(37.9±8.2)歲。對照組19例，男12例，女7例，年齡19～51歲，平均(36.1±10.7)歲。兩組一般情況比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。所有暴發(fā)性心肌炎患者均接受ECMO治療，死亡6例，存活22例，存活率為78.57 %。存活患者ECMO治療時間為(105.7±11.9)h。在ECMO治療期間，并發(fā)癥包括出血3例，肺部感染2例，下肢血栓2例。

1.2 研究方法

1.2.1 主要儀器和試劑：ECMO為德國MAQUET Cardiopulmonary AG產品(型號規(guī)格：Rota Flow)；低溫離心機為美國Sigma公司產品；Luminex 200多功能液相芯片分析平臺為美國Millipore公司產品。14種細胞因子Luminex分析試劑盒(Human Cytokine Magnetic Luminex Performance Assay 14-Plex Fixed Panel)為美國R&D公司產品(貨號：LKTM011)。

1.2.2 ECMO操作過程：ECMO治療均選擇靜脈-動脈(V-A)輔助模式，采用普通肝素進行體外生命支持期間的抗凝控制。同側股動脈、股靜脈穿刺置入動脈插管17Fr和靜脈插管21Fr，膜式氧合器套包排氣后備用，將動靜脈連接管分別與穿刺置入好的股、動靜脈插管連接后開始轉流。股靜脈引出未經(jīng)氧合的血液，經(jīng)過離心泵和人工膜肺進行氧合后，經(jīng)股動脈輸入機體。所有患者股動脈插管側遠端置入灌注管，與股動脈插管三通側枝相連，作為旁路為遠端肢體供血，避免同側下肢遠端發(fā)生缺血壞死。使用ECMO的前48 h，流量設置為較高水平，輔助泵血流量達到患者理想心輸出量的80%，然后根據(jù)患者心臟恢復情況和血流動力學水平、心臟超聲檢測，適當下調泵血流量，達到患者理想心輸出量的50%。ECMO撤除前48 h，將泵血流量控制在患者理想心輸出量的20%～30%，并根據(jù)患者情況調整血管活性藥物用量。如心臟超聲提示患者心臟功能恢復、血壓、心率、及氧合平穩(wěn)，血管活性藥物劑量基本減停，ECMO輔助流量降低至1.3 L/min，維持12 h后，再次檢測上述指標平穩(wěn)后撤除ECMO輔助，繼續(xù)后期的常規(guī)治療。

1.2.3 血清分離：對照組于清晨空腹、暴發(fā)性心肌炎患者入院后和ECMO撤除后采集非抗凝外周血5 ml，靜置30 min后于4 ℃、1000 r/min離心15 min，收集上層血清，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞因子檢測：使用14種細胞因子Luminex分析試劑盒對血清中細胞因子進行檢測，包括：干擾素-α(Interferon-α,IFN-α)、IFN-γ、白細胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)、IL-1β、IL-1受體α(IL-1 receptor α,IL-1ra)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-33、血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)。向平板中加入50 μl稀釋的血清樣本和標準品，然后加入50 μl微粒雞尾酒(microparticle cocktail)，加蓋密封后水平搖床孵育2 h。洗滌3次，加入50 μl生物素抗體雞尾酒，加蓋密封后水平搖床孵育1 h。洗滌3次，加入50 μl鏈霉素-PE，加蓋密封后水平搖床孵育30 min。洗滌3次，加入100 μl洗滌緩沖液，水平搖床孵育2 min，加蓋密封后水平搖床孵育1 h。使用Luminex 200多功能液相芯片分析平臺讀板，根據(jù)標準曲線計算血清樣本中各種細胞因子水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)首先經(jīng)過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位間距)[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Wilcoxon配對檢驗。受試工作者特征(ROC)曲線分析細胞因子預測暴發(fā)性心肌炎患者生存結局。所有檢驗均為雙側檢測，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 暴發(fā)性心肌炎患者細胞因子表達譜變化 暴發(fā)性心肌炎組和對照組血清中均未檢測到IL-3表達。IFN-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-4、IL-10、IL-33和VEGF水平在暴發(fā)性心肌炎組和對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，暴發(fā)性心肌炎患者血清IL-2、IL-6、IL-7和IL-15水平均顯著高于對照組，比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。對暴發(fā)性心肌炎組存活者和死亡者血清IL-2、IL-6、IL-7和IL-15進行ROC曲線分析，IL-2曲線下面積(AUC)為0.583，95%可信區(qū)間(CI)為0.347～0.820，P=0.538(圖1A)。IL-6 AUC為0.871，95%CI為0.740～1.002，P=0.006(圖1B)。IL-7 AUC為0.598，95%CI為0.371～0.826，P=0.467(圖1C)。IL-15 AUC為0.609，95%CI為0.408～0.811，P=0.417(圖1D)。IL-6的生存結局預測效能良好，IL-2、IL-7和IL-15的生存結局預測效能較差。

圖1 預測暴發(fā)性心肌炎預后的ROC曲線

2.2 暴發(fā)性心肌炎存活患者ECMO治療后血清細胞因子水平變化 22例存活的暴發(fā)性心肌炎患者在ECMO撤除后采集外周血，檢測血清中IL-2、IL-6、IL-7和IL-15水平。血清IL-2、IL-7和IL-15水平在基線和ECMO撤除后的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，血清IL-6水平在ECMO撤除后顯著低于基線，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 暴發(fā)性心肌炎存活患者ECMO治療后血清細胞因子水平變化(pg/ml)

3 討 論

成人暴發(fā)性心肌炎患者行ECMO治療的臨床效果顯著，可使機體組織灌注得到有效改善，提高救治成功率[8-10]。免疫因素參與了暴發(fā)性心肌炎等因素誘導的心肌損傷[11]，特別是病毒感染、自身免疫等因素造成的多種免疫細胞和免疫分子調控紊亂促進了暴發(fā)性心肌炎的疾病進程。部分危重型新型冠狀病毒病(Coronavirus disease 2019,COVID-19)患者亦可并發(fā)暴發(fā)性心肌炎，ECMO治療可有效降低心肌損傷[12-13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，ECMO治療后暴發(fā)性心肌炎患者存活率為78.57 %，與既往報道結果相似[8-10]，進一步說明ECMO在暴發(fā)性心肌炎治療中的重要作用。

IL-6是一種多效性細胞因子，主要由活化的T細胞和成纖維細胞分泌，具有調節(jié)免疫應答、急性期應答、抗感染免疫等功能，特別是在固有免疫應答中發(fā)揮重要作用?？滤_奇病毒B3感染促進IL-6、IL-1β、IL-8等多種細胞因子分泌，促進中性粒細胞向心肌募集浸潤，誘導病毒性心肌炎發(fā)病[14]。完全弗氏佐劑在免疫應答初期即可促進IL-6分泌，誘導自身免疫性心肌炎發(fā)病[15]。在一例COVID-19并發(fā)暴發(fā)性心肌炎患者中，疾病早期患者血清IL-6水平升高，接受機械通氣、抗病毒及免疫調節(jié)治療、連續(xù)腎臟替代治療等綜合治療后患者肺部病變仍然進展，氧合無法維持，IL-6水平進一步升高。使用ECMO治療72 h后患者循環(huán)和氧合均改善，心肌損傷減輕，IL-6水平明顯下降[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴發(fā)性心肌炎患者血清IL-6水平顯著升高，ECMO治療后IL-6水平顯著降低，而IL-6水平升高亦為暴發(fā)性心肌炎患者臨床預后不良的重要影響因素之一。結合既往發(fā)表的結果，這說明IL-6參與了暴發(fā)性心肌炎的發(fā)病，而ECMO治療顯著降低了IL-6水平，抑制機體免疫應答，促進患者病情恢復。

IL-2、IL-7和IL-15均屬于共同γ鏈細胞因子家族成員，有多種免疫細胞和成纖維細胞分泌，主要發(fā)揮促進T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、單核巨噬細胞活性的作用，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)、免疫網(wǎng)絡平衡中均發(fā)揮重要作用[16]。1例轉移性腎癌患者接受高劑量IL-2治療后出現(xiàn)急性進行性呼吸困難、肌鈣蛋白水平升高，導致急性心肌炎發(fā)生[17]，提示IL-2具有心臟毒性。心肌炎患者IL-7受體α鏈(即CD127)主要表達于巨噬細胞中，IL-7可作為重要的趨化因子，誘導巨噬細胞向心肌募集浸潤[18]。IL-15作為促炎因子，可發(fā)揮促進自然殺傷細胞功能的作用，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病促進動脈粥樣硬化形成，在心肌炎中則可誘導疾病進展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴發(fā)性心肌炎患者血清IL-2、IL-7和IL-15水平均明顯升高，提示共同γ鏈細胞因子參與了暴發(fā)性心肌炎發(fā)病，但ECMO治療對IL-2、IL-7和IL-15水平均無顯著影響，而共同γ鏈細胞因子水平亦不能作為暴發(fā)性心肌炎患者的生存結局預測治療。這可能與暴發(fā)性心肌炎患者，特別是病毒感染誘導的暴發(fā)性心肌炎患者，經(jīng)有效治療后在恢復期仍存在免疫記憶有關[20]。

綜上所述，IL-6和多種共同γ鏈細胞因子參與了暴發(fā)性心肌炎的發(fā)病。ECMO治療可有效降低IL-6水平，但對共同γ鏈細胞因子水平無明顯影響，ECMO可能通過降低血清IL-6水平抑制暴發(fā)性心肌炎患者炎癥應答，促進疾病恢復。