觀賞海棠‘王族’miR156a的克隆及功能驗(yàn)證

劉嘉偉，王杏隨，潘云雪，侯穎慧，張 杰

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

觀賞海棠(Ornamental Crabapple)是蘋果屬著名的花果共賞材料[1]。包括新葉有色品種和常色紫紅色葉品種，其中紅色葉片‘王族’(Malus‘Royalty’)是常色有色類品種的典型代表[2]。其花色鮮艷、果實(shí)胎紅、冬果宿存，兼具抗病、耐旱、生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)[3]。

花色苷作為花青素和各種糖形成的一種糖苷物質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中積累[4]，然后穩(wěn)定存在于植物器官中，由此產(chǎn)生由紅到紫的顏色。眾多研究表明，顏色差異與花色苷的含量密切相關(guān)[5]花色苷的合成不僅增加了植物的觀賞價(jià)值，還提高植物抗氧化、消炎抑菌的生物活性，其合成代謝一直以來都是研究熱點(diǎn)。

MicroRNAs (miRNAs) 是小的非編碼內(nèi)源性RNA ( 18～24個(gè)核苷酸)，參與多種生理代謝過程，如：激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與代謝產(chǎn)物的生物合成，以及植物的生長(zhǎng)發(fā)育和一些脅迫應(yīng)答等[6]。已有研究表明miRNA是介導(dǎo)植物花青素生物合成的重要調(diào)節(jié)因子[7]。miR858可以靶向擬南芥花青素合成負(fù)調(diào)節(jié)基因MYBL2參與擬南芥花青素的合成積累[8]。在低磷條件下，miR399參與miR156調(diào)控的花青素積累和根際酸化過程，miR156 和miR399 協(xié)同參與磷平衡過程[9]。對(duì)于高度保守miR156正確的時(shí)空積累維持了植物的正常發(fā)育。研究表明，miR156及其靶基因SPL家族在植物的發(fā)育過程、合成代謝及非生物脅迫中起到重要作用，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)樞紐[10]。在楊樹中，miR156過表達(dá)導(dǎo)致花青素在莖、葉緣及葉柄表皮中大量積累?；ㄉ障嚓P(guān)基因(LDOX，UFGT，GST)的轉(zhuǎn)錄本豐富度明顯增加，有助于調(diào)控楊樹中花色苷的生物合成[11]。在桃和梨中，miR156/SPL介導(dǎo)的兩種機(jī)制可調(diào)控花色苷生物合成：血肉桃中的PpSPL1通過抑制反式啟動(dòng)活性PpMYB10.1(花色苷積聚的正調(diào)節(jié)劑)的表達(dá)[12]。 文中所采用的試驗(yàn)材料是觀賞海棠 ‘王族’，首先進(jìn)行克隆miR156a的前體基因，接下來把表達(dá)載體轉(zhuǎn)進(jìn)‘王族’ 植株中。然后進(jìn)行檢測(cè)花色苷含量并分析花色苷代謝途徑上的相關(guān)基因的表達(dá)量，以此揭示miR156a在花色苷代謝途徑中的作用。

1 植物材料及方法

1.1 植物材料

植物材料觀賞海棠‘王族’在2021年3月中旬取自北京農(nóng)學(xué)院海棠資源圃和組培中心培育的‘王族’植株。進(jìn)行分裝標(biāo)記所收集的材料，用液氮迅速存樣，并保存于-80 ℃。侵染試驗(yàn)所需材料選自觀賞海棠‘王族’植株。在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行植株的培養(yǎng)(4.43 g/L MS粉末，30 g/L蔗糖，7.0 g/L瓊脂，1 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，pH=5.8)。適宜的培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度70%～80%，溫度24 ℃±2 ℃，光照的強(qiáng)度1 700～2 000 lx，光照的時(shí)間16 h光/8 h暗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取植物總RNA 及反轉(zhuǎn)錄 cDNA 提取‘王族’葉片的總RNA，使用RA53-EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒(愛博森)，操作參照說明書進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否污染，核酸儀檢測(cè)RNA的純度及濃度。并采用RT-PCR試劑盒(全式金)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2miR156a基因克隆 首先用GDR查找‘金冠’的pre-miR156a基因的序列，其在15號(hào)染色體上。取大約260 bp的基因序列，在其前體序列的上游和下游位置，結(jié)合前體序列組成新序列。引物通過Primer5進(jìn)行設(shè)計(jì)。以‘王族’植株葉片反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，PCR反應(yīng)體系cDNA,2xPhanta Max Master Mix (Dye Plus),上游引物F,下游引物R,ddH2O分別為1 μL,25 μL,2 μL,2 μL,20 μL總量共50 μL。

PCR的反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸5 min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)。

檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將目的基因片段條帶進(jìn)行膠回收。然后將膠回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化 Trans-T1大腸感受態(tài)并涂板進(jìn)行抗性篩選，挑選單菌落生長(zhǎng)后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，然后送測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3miR156a前體表達(dá)載體的克隆 用限制性內(nèi)切酶Xba I酶切，將克隆得到的miR156a前體序列分別構(gòu)建到PDONR221表達(dá)和沉默載體上。反應(yīng)體系如下：目的基因片段、載體片段、T4 DNA連接酶、2×T4DNA ligase Buffer 分別是3 μL,3 μL,1 μL,1 μL,加ddH2O至10 μL。

將以上體系產(chǎn)物，加入干凈離心管中，慢慢混勻后放置于16 ℃的金屬浴中，進(jìn)行3～4 h連接后，將得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，并涂板進(jìn)行卡那霉素抗性篩選，挑取單菌落生長(zhǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，然后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。并按1∶1比例將50%甘油與測(cè)序正確的菌液進(jìn)行混勻，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4miR156a的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 首先吸取2 μL質(zhì)粒加入50 μL提前融化的農(nóng)桿菌感受態(tài)(GV3101)細(xì)胞里。并涂板培養(yǎng)，然后挑選單菌落生長(zhǎng)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆。將鑒定正確的菌液在28 ℃條件下、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。室溫下，5 000 r/min離心8 min,收集菌體，與侵染液進(jìn)行重懸( 10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2+200 μmol/L AS)。將菌液再次懸浮至OD600=0.8。將培養(yǎng)30 d左右且生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)相同的‘王族’組培苗，將侵染菌液利用真空泵抽吸的方式轉(zhuǎn)化整株組培苗，用干凈濾紙吸干植株表面的液體，立刻接種到固體MS培養(yǎng)基(含有Cef 300 mg/L和Kana50 mg/L)中，在組培室進(jìn)行培養(yǎng)7～10 d，期間注意觀察表型。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照 SYBR ? Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)酶進(jìn)行，采用qRT-PCR兩步法，體系參照說明書。反應(yīng)條件為：預(yù)變性、變性、退火、延伸的溫度分別是95 ℃，94 ℃，60 ℃，72 ℃，時(shí)間分別是3 min，20 s，30 s，30 s，cycles 39。測(cè)定關(guān)于花色苷途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量。表1為所用的熒光引物序列。待測(cè)樣品的數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 花色苷含量的測(cè)定 取存樣后的‘王族’葉片，用液氮迅速研磨成粉末，稱量0.11 g樣品，步驟參照植物花色苷含量測(cè)定試劑盒(索寶萊)說明書進(jìn)行操作。后續(xù)用分光光度計(jì)，通過測(cè)定提取液在530 nm和700 nm 處的吸光度值計(jì)算樣本中花色苷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR156a前體的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建

以‘王族’葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為489 bp的miR156a前體序列。以miR156a前體序列為模板，在上下游引物前端加酶切位點(diǎn)Xba I的序列，利用T4連接酶連接過表達(dá)載體和沉默載體上，通過對(duì)載體序列的判定，獲得了miR156a過表達(dá)載體(OE-miR156a)和miR156a沉默載體(Si-miR156a)。測(cè)序結(jié)果為圖1所示。

圖1 比對(duì)McmiR156a的表達(dá)載體序列Fig.1 Alignment of the expression vector sequence of McmiR156a

2.2 miR156a的瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化

通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將miR156a的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入‘王族’植株中，放于組培中心進(jìn)行培養(yǎng)7～10 d，利用體式熒光顯微鏡觀察表型。與對(duì)照相比，OE-miR156a‘王族’葉片呈綠色表型，Si-miR156a‘王族’葉片呈紅色表型，如圖2所示。

圖2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因‘王族’葉片表型Fig.2 Phenotype of transient genetically Malus ‘Royalty’ leaves

2.3 miR156a的相關(guān)表達(dá)量的分析

通過熒光檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化葉片，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中葉片的花色苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花色苷含量在過表達(dá)植株葉片中明顯低于對(duì)照組，并且在沉默植株葉片中花色苷含量明顯高于對(duì)照組。并在轉(zhuǎn)基因植株中分析CHS、UFGT、DFR基因的表達(dá)量。由圖3所示，OE-miR156a的花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，Si-miR156a的花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)量呈升高趨勢(shì)。結(jié)果表明miR156a參與負(fù)調(diào)控觀賞海棠葉片中花色苷生物合成。

圖3 花色苷的含量及相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.3 Anthocyanin content and relative expression of some related genes

3 討 論

觀賞海棠是具有綜合觀賞價(jià)值的品種[13]。受花色苷積累的影響，葉片色澤是觀賞植物的重要特征之一?；ㄉ諒V泛分布于植物各部位，抗氧化活性使其具有抗炎、保護(hù)心腦血管和抗代謝性疾病等作用[14]。它還可以吸引傳粉昆蟲、保護(hù)植物花粉活性、提高授粉成功率。因此研究花色苷的調(diào)控機(jī)制以及相關(guān)色素的合成代謝有重要意義[15]。

miRNA不僅在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而且在調(diào)控植物生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)育等各方面均起重要作用。目前對(duì)miRNA的功能研究主要通過miRNA過表達(dá)、miRNA基因缺失突變體和靶標(biāo)模擬技術(shù)手段[16]。miR156是植物中保守的一類miRNA，其靶基因SPL為編碼含有SBP-BOX結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在植物中的重要調(diào)節(jié)作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)。擬南芥miR156家族有8個(gè)成員(miR156a-h)，其中miR156a與miR156c在控制幼年?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期向成年?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變過程中起主要作用[9]。

本研究主要通過對(duì)觀賞海棠‘王族’中的miR156a前體進(jìn)行克隆，得到489 bp的miR156a前體序列，并構(gòu)建表達(dá)載體侵染‘王族’組培苗。測(cè)定了轉(zhuǎn)基因‘王族’組培苗的花色苷含量及相關(guān)結(jié)構(gòu)基因CHS、DFR、UFGT的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)OE-miR156a其表達(dá)量降低，Si-miR156a其表達(dá)量升高。植物的花色苷代謝途徑受多種因素影響：外界環(huán)境因素如溫度、光照、水等以及環(huán)境的pH、糖類、植物激素等；自身遺傳因素如植物本身產(chǎn)生的色素種類以及相關(guān)調(diào)控基因差異所起的作用。但是在調(diào)控花色苷的合成上，miR156a的表達(dá)是否起作用，尚未研究。該結(jié)果為進(jìn)一步探究植物中miR156a對(duì)花色苷的代謝途徑提供了一定的理論基礎(chǔ)。