苦蕎芽苗菜黃酮超聲提取工藝

張恩華，王 亞，聶子涵，馬挺軍

(北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院，北京102206)

苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.)別名菠麥、烏麥、花蕎等，一年生草本植物。苦蕎是中國主要的雜糧作物之一，生長在高寒、貧瘠等地帶，主要分布在云南、貴州、四川、山西、甘肅、內(nèi)蒙等地，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。中國苦蕎種植面積達70萬公頃，產(chǎn)量多年居世界第一位?？嗍w中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、微量元素等[1,2]?？嗍w還含有黃酮、酚類、多肽、糖醇、甾體等生物活性物質(zhì)[3,4]，尤其是蘆丁等黃酮類物質(zhì)的含量高，這賦予了苦蕎更高的經(jīng)濟價值[5]。研究表明，長期食用苦蕎粉及苦蕎制品，有利于降低機體血糖、血脂水平[6]。

苦蕎口感較粗糙，含有蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子，食用過多時易導致消化不良，這在一定程度上制約了苦蕎的消費。芽苗菜是各種谷類、豆類、樹類的種子經(jīng)過發(fā)芽培養(yǎng)出來的可食用“芽菜”。芽苗菜的培育過程無需復雜操作，且培育時間較短，一般7～15 d即可成熟。利用苦蕎籽粒培育的苦蕎芽苗菜是一種綠色、營養(yǎng)的食品，具有高活性物質(zhì)、高膳食纖維、低糖等特點[7]。

黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有超臨界流體提取法、超聲波提取法、微波提取法等。超聲波提取法是將超聲波作為介質(zhì)，在短時間內(nèi)增大物質(zhì)分子運動速率，使溶劑的穿透力增強，可提升待提取物的溶出速度，且具有操作簡便、時間短、試劑使用量少等優(yōu)點[8]。張國濤等[9]研究了蕎麥粉中黃酮類物質(zhì)的超聲提取方法。宋越冬等[10]發(fā)現(xiàn)超聲提取的蕎麥葉黃酮含量較高，且具有良好的抗氧化活性。

目前，有關苦蕎芽苗菜黃酮提取工藝的研究報道較少。為了促進苦蕎芽苗菜中黃酮物質(zhì)的開發(fā)利用，本研究以苦蕎麥芽苗菜為研究對象，采用超聲輔助提取法提取黃酮，在單因素試驗基礎上，對超聲時間、乙醇體積分數(shù)及液料比進行響應面優(yōu)化，以期得到苦蕎芽苗菜黃酮的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠山谷苦蕎二號及芽苗培養(yǎng)盤，北京綠山谷芽菜有限責任公司；蘆丁標準品(純度≥99.0%)，美國Sigma公司；次氯酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司；三氯化鋁、乙酸鉀、甲醇，北京化工廠，均為分析純。

電子分析天平，天津德安特傳感技術有限公司；超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司；臺式低速離心機，長沙易達儀器有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；紫外-可見分光光度計，上海精科儀器有限公司；高速粉碎機，濰坊德爾粉體設備技術有限公司；真空冷凍干燥機，德國CHRIST凍干機有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，天津市中環(huán)試驗電爐有限公司；立體高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械場；大氣等離子體放電設備，實驗室定制。

1.2 方 法

1.2.1 原料處理 選取籽粒飽滿、無霉變、大小均一的苦蕎種子，用蒸餾水淘洗干凈，然后用65 ℃熱水激活種子。種子經(jīng)浸泡4 h后撈出，NaClO溶液消毒，用浸過水的透氣軟布包裹放在陰暗處進行催芽。把催好芽的種子均勻的碼放在芽苗培養(yǎng)盤中，并在苦蕎種子上蓋一張經(jīng)等離子活化水噴濕的紙張，然后把苦蕎種子放置于背陰處進行催芽生長，培養(yǎng)得到苦蕎芽苗菜。將芽苗菜放入凍干機中冷凍24 h至干，磨粉，放入干燥皿中備用。

1.2.2 苦蕎芽苗菜中黃酮提取工藝 準確稱取0.500 g苦蕎芽苗粉，按照單因素乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度及響應面試驗設計(表1，利用軟件 Design-Expert.V12.0.3.0中Box-Behnken方法)的條件提取黃酮，提取結(jié)束后，使用離心機在4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min。取上清液，得到黃酮粗提液，備用。

表1 單因素試驗條件和響應面因素及水平Tab.1 Single-factor test conditions and response surface factors and levels

1.2.3 黃酮含量測定 繪制標準曲線方程Y= 0.563X-0.067 6(R2=0.999 7)，其中X為苦蕎芽苗粉質(zhì)量(mg)，Y為吸光度值?？傸S酮的測定：取0.5 mL提取液于20 mL具塞試管中，加入0.1 mol/L三氯化鋁2 mL、1 mol/L乙酸鉀3 mL，再加入70%甲醇定容到10 mL刻度線，搖勻，靜置30 min后于420 nm處測定吸光度[11]。重復3次，計算平均值。

式中，Y1為總黃酮含量(mg/g)；X1為提取液中總黃酮質(zhì)量(mg)；m為萌發(fā)苦蕎粉質(zhì)量(g)；V取為提取液中移取體積；V定為提取液總體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲時間對黃酮得率的影響 由圖1可知，當超聲時間從10 min延長到20 min時，黃酮得率顯著提高(P<0.05)，而當超聲時間繼續(xù)增加時，黃酮得率開始逐步下降。原因可能是當超聲時間小于10 min，苦蕎芽苗菜中的黃酮尚未提取完全；當超聲時間大于10 min之后，超聲處理使細胞壁破碎較完全，導致得率增加，但當超聲時間超過30 min，黃酮的分子結(jié)構(gòu)被破壞，雜質(zhì)析出，使黃酮得率下降[12]。

圖1 各因素對提取苦蕎芽苗菜黃酮得率的影響Fig.1 Effect of various factors on the yield of flavonoids from Tartary buckwheat sprouts

2.1.2 超聲溫度對黃酮得率的影響 由圖1可知，當超聲溫度從20 ℃上升到30 ℃時，黃酮得率顯著增加(P<0.05)。而當超聲溫度繼續(xù)增加至50 ℃時，黃酮得率逐漸降低(P>0.05)；超聲溫度增加至60 ℃時，黃酮得率顯著下降(P<0.05)。推測可能是因為超聲溫度高于50 ℃時，黃酮結(jié)構(gòu)易被破壞，并且會使雜質(zhì)加速溶出，從而降低黃酮得率[13]。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響 黃酮類物質(zhì)一般易溶于水、乙醇、甲醇等極性強的溶劑[14]；但難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑。乙醇具有毒性小、回收率高的優(yōu)點，所以本試驗選用乙醇作為溶劑提取黃酮。由圖1可知，在乙醇體積分數(shù)80%時，黃酮得率達到最大值，為28.63%。乙醇體積分數(shù)增加至90%時，黃酮得率顯著下降(P<0.05)。這可能是因為乙醇濃度影響了細胞內(nèi)外的濃度差，濃度越大越有利于黃酮浸出，但當乙醇濃度過高，會使苦蕎芽苗菜細胞中的脂溶性物質(zhì)浸出，影響了黃酮浸出速度[15]。

2.1.4 液料比對黃酮得率的影響 由圖1可知，液料比在40 mL/g～80 mL/g內(nèi)，隨液料比增大，黃酮得率顯著(P<0.05)增大，80 mL/g時達到最大值，為31.01%。當液料比增加至90 mL/g，黃酮得率下降(P>0.05)。溶液體積過小時，苦蕎芽苗粉與溶液接觸不充分，黃酮未被有效溶出，所以在一定的范圍內(nèi)，隨著溶液體積變大，黃酮得率增加；但當溶液體積過高，單位體積物料接收到的超聲能量降低，使黃酮溶出速率降低，得率減小[16]。

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗和顯著性檢驗結(jié)果 響應面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗結(jié)果Tab.2 Response surface experiment results

利用Design-Expert.V12.0.3.0軟件得到各個因素與黃酮得率間的二次回歸方程：

黃酮得率=34.08-0.13A-0.10B+3.88C+0.083AB+0.36AC+0.97BC-2.00A2-0.88B2-7.55C2。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Tab.3 Results of significant test for regression coefficient

黃酮得率=34.08+3.88C+0.36AC+0.97BC-2.00A2-0.88B2-7.55C2。

2.2.2 響應面分析 利用軟件繪制各因素交互作用的響應面三維曲面圖和等高圖。能直觀反應各試驗因素的交互作用情況，響應面越平緩，表明該因素對黃酮得率影響越小，響應面越陡峭，說明該因素對黃酮得率影響越大[17,18]。超聲時間和液料比的響應面以及乙醇體積分數(shù)和液料比的響應面都較陡峭，但乙醇體積分數(shù)和超聲時間的響應面比較平緩，可以看出乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響相對較小，而超聲時間和液料比對黃酮得率的影響顯著。黃酮得率對應各因素構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，能客觀反映各因素的交互作用及其對響應面的影響[19]。

2.2.3 最優(yōu)苦蕎芽苗菜黃酮超聲提取工藝 通過響應面試驗，得出苦蕎芽苗菜黃酮的最佳超聲提取工藝條件為：超聲時間19.94 min、乙醇體積分數(shù)80.83 %、液料比82.63∶1，在此條件下預測的黃酮得率為34.59%?？紤]到實際操作，將原有的模型條件修改為：超聲時間20 min、乙醇體積分數(shù)80%、液料比80∶1，在此條件下重復3次，黃酮得率為34.24%，與模型預測值基本相符。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗考察了影響苦蕎芽苗菜黃酮超聲提取得率的4個因素，并利用響應面試驗進一步分析了超聲時間、乙醇體積分數(shù)和液料比對黃酮得率的影響。初步明確了影響苦蕎芽苗菜黃酮得率的因素從大到小依次為液料比、超聲時間和乙醇體積分數(shù)。優(yōu)化后的最佳提取工藝為超聲時間20 min、乙醇體積分數(shù)80%、液料比80∶1，在此條件下的黃酮得率為34.24%。