基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)解析復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)的作用機(jī)制*

畢聰，吳灝，王永剛，彭維，蘇薇薇，劉宏

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275

復(fù)方血栓通膠囊由三七、黃芪、丹參、玄參四味藥材組成，系廣東眾生藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的名優(yōu)中成藥品種，具有活血化瘀，益氣養(yǎng)陰的功效，臨床上主治血瘀兼氣陰兩虛證的視網(wǎng)膜靜脈阻塞及穩(wěn)定性勞累型心絞痛［1］。研究表明，視網(wǎng)膜靜脈阻塞［2］、急性心肌梗死［3］、動(dòng)脈粥樣硬化［4］等疾病與微循環(huán)障礙密切相關(guān)，而復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)的作用靶點(diǎn)與機(jī)制尚不明晰。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，通過篩選微循環(huán)相關(guān)活性成分與作用靶點(diǎn)，構(gòu)建藥材-成分-靶點(diǎn)-通路綜合網(wǎng)絡(luò)，解析復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)障礙的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 微循環(huán)障礙靶點(diǎn)獲取

利用GeneCards（https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php）和OMIM（https：//omim. org/）數(shù)據(jù)庫［5］，以microcirculation 為關(guān)鍵詞，選擇“Relevance score≥4.0”的基因。同時(shí)搜索文獻(xiàn)中與微循環(huán)障礙相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因。

1.2 復(fù)方血栓通膠囊化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（http：//tcmspw. com/tcmsp. php） 數(shù)據(jù)庫［6］，以“三七”“黃芪”“丹參”“玄參”為關(guān)鍵詞，選擇口服生物利用度（OB，oral bioavailability）≥30%、化合物類藥性（DL，drug-like）≥0.18［7］的化學(xué)成分用于下一步分析。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫及參考文獻(xiàn)獲取各化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，并將所得靶點(diǎn)通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.3 活性成分及改善微循環(huán)靶點(diǎn)篩選

采用Venny 平臺(tái)（https：//bioinfogp. cnb. csic.es/tools/venny/）將微循環(huán)相關(guān)靶點(diǎn)與復(fù)方血栓通膠囊作用靶點(diǎn)取交集，作為復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)障礙潛在作用靶點(diǎn)。與潛在作用靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的成分作為復(fù)方血栓通膠囊的活性成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

將復(fù)方血栓通膠囊微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/）［8］平臺(tái)，蛋白種屬選擇“Homo sapiens”，最低相互作用得分選擇中等置信度“medium confidence（0.4）”。將“TSV”格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape［9］，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并利用“Network Analysis”的“Generate style from statistics”功能將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化。利用“cytoHubba”功能篩選核心基因。

1.5 生物功能與通路富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david. ncifcrf. gov/）對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO（gene ontology）功能分析，利用Cytoscape 中“ClueGO、CluePedia”插件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號(hào)通路分析［10］，并利用GraphPad軟件將結(jié)果可視化。

1.6 活性成分-改善微循環(huán)靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將復(fù)方血栓通膠囊活性成分、改善微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)、KEGG 通路導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。其中，節(jié)點(diǎn)代表活性成分、基因或通路，連線代表生物分子的作用關(guān)系，以度值和介數(shù)作為評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 改善微循環(huán)靶點(diǎn)及活性成分篩選

通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索，共獲取微循環(huán)相關(guān)靶點(diǎn)187 個(gè)，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索，共獲取復(fù)方血栓通膠囊作用靶點(diǎn)151 個(gè)。取二者靶點(diǎn)交集（圖1），篩選得到復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)的潛在作用靶點(diǎn)40 個(gè)（表1）、關(guān)聯(lián)活性成分41 個(gè)（表2）。其中，歸屬三七的活性成分有7個(gè)，為人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、三七素等皂苷類成分；歸屬丹參的有20 個(gè)，為丹參酮ⅡA、隱丹參酮等丹參酮類成分和迷迭香酸、丹酚酸B、原紫草酸等酚酸類成分；歸屬黃芪的有8 個(gè)，為芒柄花素、毛蕊異黃酮等黃酮類成分和黃芪甲苷等皂苷類成分；歸屬玄參的成分有6個(gè)，為哈巴俄苷等環(huán)烯醚萜類成分和安格洛苷C等苯丙素苷類成分。

圖1 復(fù)方血栓通膠囊作用靶點(diǎn)與微循環(huán)靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig.1 The Venn diagram of targets of CXC and microcirculation

表1 復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)Table 1 The potential targets of CXC to improve microcirculation

表2 復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)活性成分Table 2 The active compounds of CXC to improve microcirculation

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（PPI）及核心基因篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫、Cytoscape，構(gòu)建40個(gè)復(fù)方血栓通膠囊微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），篩選出核心基因（圖3）為IL6、CCL2、ICAM1、EDN1、JUN、NOS3、PTGS2、VCAM1、MMP9、TNF。結(jié)果提示這些靶點(diǎn)可能在復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)障礙的作用中發(fā)揮核心作用。

圖2 復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The protein-protein interaction network of CXC to improve microcirculation

圖3 靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因Fig.3 The hub genes in the protein-protein interaction network

2.3 GO功能富集分析

分別以生物過程（BP，biological process）、細(xì)胞組分（CC，cellular components）和分子功能（MF，molecular function）對(duì)復(fù)方血栓通膠囊微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析，列出顯著性最高的10條（圖4～6）。結(jié)果表明，在生物過程方面，主要富集于inflammatory response、lipopolysaccharidemediated signaling pathway、response to hypoxia 等，涉及炎癥反應(yīng)、脂多糖信號(hào)通路、白細(xì)胞遷移、缺氧反應(yīng)等；在細(xì)胞組分方面，主要富集于extracellular space、external side of plasma membrane、blood microparticle 等，涉及細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜外層、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞連接、血液微粒等，可能主要通過作用于細(xì)胞表面或細(xì)胞間物質(zhì)發(fā)揮作用；在分子功能方面，富集于serine-type endopeptidase activity、heme binding、transmembrane signaling receptor activity 等方面，涉及絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、血紅素結(jié)合、跨膜受體活性、一氧化氮合酶活性等。

圖4 復(fù)方血栓通微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)的生物過程富集分析Fig.4 Biological process analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

圖5 復(fù)方血栓通微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)的細(xì)胞組分富集分析Fig.5 Cellular components analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

圖6 復(fù)方血栓通微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)的分子功能富集分析Fig.6 Molecular function analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

2.4 KEGG通路富集分析

對(duì)復(fù)方血栓通膠囊微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，共富集到了107 條通路，篩選富集靶點(diǎn)數(shù)排名前20 的通路（圖7）。結(jié)果表明，復(fù)方血栓通膠囊可作用于血管相關(guān)通路Fluid shear stress and atherosclerosis（血流剪切應(yīng)力及動(dòng)脈粥樣硬化）、HIF-1 signaling pathway（缺氧誘導(dǎo)因子1 信號(hào)通路）、Relaxin signaling pathway（松弛素信號(hào)通路），通過調(diào)節(jié)血液流變、擴(kuò)張血管、促進(jìn)血管生成、增加微循環(huán)血流灌注等改善微循環(huán)障礙；也可作用于免疫炎癥相關(guān)通路，如Complement and coagulation cascades（補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)）、TNF signaling pathway（腫瘤壞死因子信號(hào)通路）、IL-17 signaling pathway （白細(xì)胞介素17 信號(hào)通路）；作用于神經(jīng)活性相關(guān)通路Neuroactive ligandreceptor interaction（神經(jīng)活性配體-受體相互作用）以及糖尿病相關(guān)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）。由此可見，復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)障礙，可能通過調(diào)節(jié)血液流變、擴(kuò)張血管、促進(jìn)血管生成、增加微循環(huán)血流灌注、調(diào)節(jié)炎癥免疫、神經(jīng)活性等方面的靶點(diǎn)及通路而實(shí)現(xiàn)。

圖7 復(fù)方血栓通膠囊微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)的KEGG通路結(jié)果圖Fig.7 The KEGG pathways of potential targets of CXC to improve microcirculation

2.5 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將41 個(gè)活性成分、40 個(gè)作用靶基因、富集靶點(diǎn)數(shù)排名前10 的KEGG 通路導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建復(fù)方血栓通膠囊改善微循環(huán)的活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖8）。其中紫色菱形代表靶點(diǎn)，灰色三角為通路，圓形為活性成分（綠色為三七成分，黃色為丹參成分，藍(lán)色為黃芪成分，粉色為玄參成分）。

圖8 復(fù)方血栓通微循環(huán)相關(guān)活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 The active compound-target-pathway network of CXC to improve microcirculation

3 小結(jié)與討論

微循環(huán)即微動(dòng)脈和微靜脈之間的血液循環(huán)，是機(jī)體進(jìn)行血液和組織間物質(zhì)交換的場所。當(dāng)機(jī)體受到某些病理因素的刺激時(shí)，出現(xiàn)血管炎癥和內(nèi)皮功能異常，引起血液流速減慢或形成血栓，進(jìn)而引發(fā)微循環(huán)障礙［11］。臨床數(shù)據(jù)表明，微循環(huán)障礙是造成糖尿?。?2］、胰腺炎［13］、腦損傷［14］、膿毒癥［15］、心血管［16］等多種疾病的重要原因。已有研究表明，復(fù)方血栓通膠囊可顯著增加血流灌注量，擴(kuò)張血管，從而改善視網(wǎng)膜、心肌組織的微循環(huán)障礙［1，17-18］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出復(fù)方血栓通膠囊與改善微循環(huán)相關(guān)的41 個(gè)活性成分，主要為人參皂苷Rg1、三七皂苷R1等皂苷類成分，芒柄花素、毛蕊異黃酮等黃酮類成分，丹參酮ⅡA、隱丹參酮等丹參酮類成分，迷迭香酸、丹酚酸B等酚酸類成分，哈巴俄苷等環(huán)烯醚萜類成分，以及安格洛苷C等苯丙素苷類成分。篩選出復(fù)方血栓通膠囊與改善微循環(huán)相關(guān)的40 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中IL6、CCL2、ICAM1、EDN1、JUN、NOS3、PTGS2、VCAM1、MMP9、TNF發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

復(fù)方血栓通膠囊微循環(huán)潛在作用靶點(diǎn)富集于心血管、免疫炎癥、神經(jīng)活性及糖尿病相關(guān)通路。在心血管通路方面，HIF-1信號(hào)通路對(duì)微循環(huán)的建立有重要意義［19］，復(fù)方血栓通膠囊可直接調(diào)控HIF 信號(hào)通路中的核心基因HIF-1α（圖9），進(jìn)而影響紅細(xì)胞生成、血管形成、鐵代謝、血管舒張等；也可調(diào)控下游血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1），直接影響血管形成；以及調(diào)控內(nèi)皮素（EDN-1）、一氧化氮合酶（iNOS、eNOS），調(diào)節(jié)血管舒張、血小板聚集以及血管平滑肌增生［20］。在炎癥方面，微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞被激活后，細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和趨化因子等被大量釋放，引起白細(xì)胞聚集，同時(shí)影響血管通透性，形成微血管血栓［21］。復(fù)方血栓通膠囊可調(diào)控TNF 信號(hào)通路等炎癥相關(guān)通路（圖10），通過調(diào)控TNF-α、IL6、CCL2、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素等，調(diào)控炎癥因子的釋放、白細(xì)胞黏附、血管重構(gòu)、細(xì)胞黏附等。在神經(jīng)活性方面，交感神經(jīng)通過支配微血管的平滑肌，調(diào)節(jié)血管收縮舒張及微循環(huán)的血流量［22-23］。復(fù)方血栓通膠囊可通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿受體2（CHRM2）、腎上腺素能受體（ADRB2）、糖皮質(zhì)激素受體（NR3C1）、補(bǔ)體（C3、C5）等調(diào)控Neuroactive ligand-receptor interaction信號(hào)通路，從而影響微循環(huán)血流量。

圖9 推測的復(fù)方血栓通膠囊在HIF-1信號(hào)通路的作用Fig.9 The effect of CXC in HIF-1 signaling pathway

圖10 推測的復(fù)方血栓通膠囊對(duì)TNF信號(hào)通路的作用Fig.10 The effect of CXC in TNF signaling pathway

綜上所述，本研究揭示了復(fù)方血栓通膠囊可能通過調(diào)控心血管、炎癥免疫、神經(jīng)活性等相關(guān)靶點(diǎn)與通路，影響血管形成、血管舒張、血管平滑肌增生及微循環(huán)血流量，發(fā)揮改善微循環(huán)作用；為其機(jī)制解析、臨床用藥提供了依據(jù)。