酶@金屬有機(jī)框架復(fù)合材料的設(shè)計(jì)策略*

童琳凈，黃思銘，陳國(guó)勝，歐陽(yáng)鋼鋒

1. 生物無(wú)機(jī)與合成化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006

2. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 511436

酶是一種具有高效催化功能的生物大分子，可維持復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)之間的有序通訊及信號(hào)即時(shí)反饋［1］。模仿或利用天然酶的催化特性在藥物設(shè)計(jì)、傳感設(shè)備開(kāi)發(fā)和生物醫(yī)學(xué)工程等研究領(lǐng)域中均具有重要的應(yīng)用前景［2］。然而，酶對(duì)溫度、酸堿度波動(dòng)、有機(jī)溶劑和小分子抑制劑等環(huán)境因素敏感，受到這些外界刺激時(shí)，酶的構(gòu)象會(huì)發(fā)生不同程度的擾亂或活性中心結(jié)構(gòu)直接被破壞，導(dǎo)致催化活性大大降低甚至消失?？梢哉f(shuō)，酶的脆弱性極大地限制了其在實(shí)際應(yīng)用的效率。為提高酶的工作穩(wěn)定性，近年來(lái)科學(xué)家們致力于尋找合適的多孔載體（包括無(wú)機(jī)氧化物、納米粒子、多孔碳材料等）對(duì)酶分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)固定。研究證實(shí)通過(guò)合理的材料固定化有助于酶三維結(jié)構(gòu)的維持，提高其在變性環(huán)境下的穩(wěn)定性，并展示連續(xù)循環(huán)催化的優(yōu)點(diǎn)［3］。然而，傳統(tǒng)多孔材料通常表面積低，且孔徑尺寸難以調(diào)控，導(dǎo)致酶固定化方法存在加載量低、結(jié)構(gòu)束縛不緊密和容易浸出等缺點(diǎn)。

金屬有機(jī)框架（MOFs，metal-organic frameworks）是由有機(jī)配體和金屬節(jié)點(diǎn)（金屬離子或金屬團(tuán)簇）連接成的延展性網(wǎng)絡(luò)框架。不同的節(jié)點(diǎn)（node）和聯(lián)接橋（linker）可組裝形成多種多樣結(jié)構(gòu)的MOFs，而框架豐富的官能團(tuán)又賦予其靈活的加工特性，目前已有超過(guò)20 000 種MOFs 被報(bào)道［4］。MOFs具備超高的孔隙率、可調(diào)控的孔道尺寸、優(yōu)異的化學(xué)及熱穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，不僅在氣體分離、存儲(chǔ)和催化等傳統(tǒng)研究領(lǐng)域備受關(guān)注，在酶固定化領(lǐng)域的研究也大放異彩［5］。首先，超高的孔隙率可大幅度地提高酶的負(fù)載效率，而可調(diào)控的孔道特性有利于裁剪出與酶尺寸匹配的固定空間；其次，優(yōu)異的化學(xué)及熱學(xué)穩(wěn)定性賦予酶@MOFs復(fù)合材料更高的耐受性及循環(huán)利用率。

酶的表面具有多樣的氨基酸殘基及豐富的電荷特性，容易與MOFs表面或者內(nèi)部孔道化學(xué)成分產(chǎn)生多種相互作用，包括范德華力、疏水相互作用、π-π 相互作用、靜電力、共價(jià)作用等。因此，容易形成穩(wěn)定的酶@MOFs 復(fù)合結(jié)構(gòu)。根據(jù)酶固定方式及空間分布，可將固定策略大致分為以下3類：1）基于物理吸附或化學(xué)鍵合的表面固定；2）后滲透的孔道固定；3）原位包埋的孔道固定。不同的固定化方式會(huì)對(duì)酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的束縛效果，提高酶的工作穩(wěn)定性；同時(shí)，材料的化學(xué)組分及固定模式賦予酶的活性中心不同的微環(huán)境，有望提高甚至改變酶的生物功能［6］。本文綜述了基于表面連接、滲透、原位包埋的3 種酶@MOFs固定化策略，著重強(qiáng)調(diào)不同固定模式的適用范圍及穩(wěn)定化特性，并對(duì)酶@MOFs 固定化研究的發(fā)展進(jìn)行展望。

1 表面連接

基于表面連接的酶固定化方式是指酶通過(guò)物理及化學(xué)作用固定于MOFs表面。這種固定方式不依賴于MOFs 的孔道結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、可操作性高。最簡(jiǎn)單、常見(jiàn)的表面固定化策略是基于物理吸附作用的固定，例如，右旋乳酸脫氫酶（DLDH）通過(guò)范德華相互作用、疏水作用以及原子間的氫鍵作用負(fù)載于Fe3O4NPs@Ni-MOF。固定后D-LDH 可保持其天然構(gòu)象，并獲得更高的溫度及酸堿性穩(wěn)定性［7］。物理吸附由于界面作用力較弱，很容易出現(xiàn)酶滲漏的問(wèn)題，通過(guò)結(jié)合力更強(qiáng)的共價(jià)作用是更理想的表面固定方式。例如，Wang等［8］通過(guò)EDC/NHS 交聯(lián)方式將α-L-鼠李糖苷酶（Rha） 固定于磁性ZIF-8 納米粒子，利用EDC/NHS 交聯(lián)法固定形成Rha@ZIF-8， 得到的Rha@ZIF-8 的酶活性為25.09 U/g，催化速率常數(shù)Km值低于游離Rha。Rha@ZIF-8也顯示出了顯著提高的可重用性，在60 ℃下循環(huán)30 次后，轉(zhuǎn)化率仍為73.55%；大豆環(huán)氧化物水解酶（sEH）通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方式被固定在尺寸均勻分布在350～400 nm 的納米/微尺度UiO-66-NH2上，酶負(fù)載達(dá)87.3 mg/g（圖1a）。所得到的新型納米/微生物催化劑sEH@UiO-66-NH2結(jié)構(gòu)剛度顯著增強(qiáng)，酶活性回收率達(dá)88.0%［9］。此外，有少量研究發(fā)現(xiàn)氨基酸有望作為配體，參與MOFs材料的組裝。如，L-天冬氨酸和鋯簇可組裝形成一種3D 微孔MOFs 材料，MIP-202（Zr）（圖1b，c）。這種氨基酸MOFs 繼承了傳統(tǒng)UiO-66 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并具有出色的化學(xué)穩(wěn)定性［10］。雖然目前還沒(méi)研究發(fā)現(xiàn)能否通過(guò)氨基酸直接配位的方式實(shí)現(xiàn)酶的固定，但氨基酸的配位潛力無(wú)疑為酶的表面固定策略提供了新思路。

圖1 表面連接法的酶固定化示意圖Fig.1 Schematic representation of enzyme immobilization by surface linking method

基于表面連接的酶固定化策略設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、可操作性高，大部分的MOFs均可以通過(guò)該方法作為酶的載體，得到的復(fù)合材料具備較好的生物活性和穩(wěn)定性。但這種固定化方式忽視MOFs的高孔隙利用率的特性，固定位點(diǎn)主要來(lái)自有限的表面區(qū)域，因此酶負(fù)載效率通常較低。此外，僅僅利用MOFs 表面與酶連接對(duì)酶的保護(hù)作用并不強(qiáng)，難以在惡劣環(huán)境條件下（水解酶、高溫、有機(jī)溶劑等）持續(xù)工作。

2 滲透法

MOFs 具超高的孔隙率和可調(diào)控的孔道尺寸，充分利用MOFs的孔道結(jié)構(gòu)必然會(huì)提高酶的加載效率，并提供更緊密的束縛環(huán)境?；跐B透方式的孔道固定方法是酶固定的重要的策略之一。在這個(gè)過(guò)程中，酶通過(guò)滲透的方式進(jìn)入MOFs 的孔道，并通過(guò)化學(xué)或物理作用固定于MOFs孔道內(nèi)。這種策略需要對(duì)MOFs 的孔道進(jìn)行精心的設(shè)計(jì)：1）孔道結(jié)構(gòu)與酶尺寸的匹配，保證酶分子的順利進(jìn)入；2）孔道-酶的界面的作用，防止酶分子的浸出。酶是生物大分子，往往具有數(shù)納米的分子尺寸，適用于后滲透孔道固定的MOFs 需要具備介孔的孔道。

南弗羅里達(dá)大學(xué)馬勝前教授團(tuán)隊(duì)［11］證明微過(guò)氧化物酶-11（MP-11，3.3 nm×1.7 nm×1.1 nm分子尺寸）可滲透并固定于Tb-meso-MOF的介孔孔道（3.9 nm 和4.7 nm），與介孔二氧化硅材料MCM-41 固定的酶相比，MP-11@Tb-meso-MOF 表現(xiàn)更優(yōu)越的酶催化性能。值得注意的是，相對(duì)尺寸較大的酶也有可能滲透、固定于孔道尺寸稍小的MOFs 中。如，細(xì)胞色素C（Cyt c）是一種重要的血紅素蛋白，分子尺寸約2.6 nm×3.2 nm×3.3 nm。Cyt c 可成功滲透進(jìn)入具有直徑為1.3 nm 和1.7 nm的Tb-meso-MOF 孔道里，在該過(guò)程中，Cyt c 會(huì)打開(kāi)部分三級(jí)結(jié)構(gòu)形成一個(gè)既不同于其天然構(gòu)象也不同于變性蛋白的構(gòu)象［12］。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移及MOFs 孔道的大分子固定提供了新見(jiàn)解。NU-1000 是由鋯簇（Zr6（m3-OH）4（m3-O）4（OH）4（OH2）4）和羧酸配體（1，3，6，8-tetrakis（p-benzoate）pyrene）鏈接形成的層次型介孔MOFs（～3 nm 介孔和1.2 nm 微孔），具有優(yōu)異的化學(xué)和熱穩(wěn)定性。NU-1000 及具有類似拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的NU-100X 系列（3.3 ～ 6.7 nm 介孔，X=3，4，5，6，7）是十分理想的酶固定載體［13］。胰島素（1.3 nm × 3.4 nm × 1.3 nm）通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入NU-1000 介孔孔道，30 min 內(nèi)達(dá)到～40%（w）的高負(fù)載率（圖2a）。NU-1000 堅(jiān)實(shí)的多孔保護(hù)層提高胰島素在胃蛋白酶中的耐受性，并實(shí)現(xiàn)PBS響應(yīng)的胰島素釋放（圖2b）［14］。

圖2 滲透法合成酶@MOFs示意圖Fig.2 Schematic representation of enzyme encapsulation in MOFs by the infiltration strategy

酶固定于MOFs孔道后，接觸界面組分容易發(fā)生相互作用，改變酶的結(jié)構(gòu)或活性中心的微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)Cyt c 滲透并固定于NU-1000 后，活性中心周圍的氨基酸位置會(huì)發(fā)生顯著改變，對(duì)2，2-偶氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）展示出比游離Cyt c 更高的氧化性能（圖2c）［15］。這種界面作用誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)擾亂現(xiàn)象為設(shè)計(jì)高活性、高穩(wěn)定性的酶@MOFs平臺(tái)提供了新的方向。

相比于表面固定策略，后滲透的孔道固定策略具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，主要體現(xiàn)在酶加載效率和穩(wěn)定功能的提升。但目前絕大多數(shù)MOFs的孔道是微孔的，適用于這種固定方式的介孔MOFs載體十分有限。此外，理想的MOFs載體的孔道尺寸應(yīng)盡可能和酶分子尺寸相匹配；反之，容易造成酶負(fù)載量的下降，并加劇酶浸出的風(fēng)險(xiǎn)［16］。因此，后滲透的孔道固定策略對(duì)MOFs孔道設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格。

3 原位包埋

為了克服對(duì)MOFs孔道結(jié)構(gòu)的高度依賴，原位包埋的固定策略應(yīng)運(yùn)而生。原位包埋是在酶表面原位生長(zhǎng)MOFs 結(jié)構(gòu)，故這種新型的“一鍋組裝”策略不受MOFs孔道結(jié)構(gòu)和尺寸的影響。在這種固定過(guò)程中，酶會(huì)直接與MOFs前驅(qū)體接觸，要求組裝環(huán)境具有良好的生物相容性。該固定方式可以根據(jù)組裝是否引入模板分為模板法與非模板法。

3.1 非模板法

ZIFs 系列，如MAF-4［17］（ZIF-8）、ZIF-67 等MOFs 組裝條件溫和，在常溫和水相環(huán)境下即可組裝，因此是十分理想的原位包埋載體。這一概念最早在2014 年被清華大學(xué)Liu zheng 團(tuán)隊(duì)［18］提出，在Cyt c 和ZIF-8 前軀體的混合溶液中，Cyt c 會(huì)通過(guò)共沉淀的方式進(jìn)入正在生長(zhǎng)的ZIF-8 的空腔，得到ZIF-8-包埋的Cyt c 結(jié)構(gòu)。隨后受自然生物礦化過(guò)程啟發(fā)，原位誘導(dǎo)MOFs在酶表面結(jié)晶成為另一種主流的原位包埋方法（圖3a）［19］。生物界面與金屬節(jié)點(diǎn)（團(tuán)簇）之間的強(qiáng)相互作用是生物礦化的關(guān)鍵因素，豐富負(fù)電荷表面性質(zhì)的酶有利于金屬陽(yáng)離子的蓄積，誘導(dǎo)原位礦化［20］。因此，這種策略對(duì)于酶表面化學(xué)性質(zhì)有一定要求。本課題組提出一種氨基酸增強(qiáng)的仿生礦化策略，可快速、高效地將不同表面化學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)和酶封裝在MOFs 內(nèi)。這種增強(qiáng)的封裝策略靈感來(lái)源于生物體內(nèi)金屬巰基蛋白對(duì)金屬離子的富集作用，半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和蛋白質(zhì)形成類似于金屬巰基蛋白模型的自組裝體可促進(jìn)金屬離子在蛋白質(zhì)周圍富集，加速ZIF-8 的預(yù)先成核（圖3b）［19，21］。此外，我們還開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單的聚多肽導(dǎo)向原位組裝策略，制備出系列具有不同2D或3D納米結(jié)構(gòu)的高活性酶@ZIF-8 生物雜交材料［22］。研究表明不同的納米結(jié)構(gòu)對(duì)于雜交材料的活性有重要影響，其中設(shè)計(jì)的介孔2D酶@ZIF-8納米片結(jié)構(gòu)由于具有更短的底物擴(kuò)散路徑和更大的孔道尺寸，有助于提高酶活性位點(diǎn)的利用率，因此具有更高的生物活性。值得注意的是，不同的原位封裝模式［23］及ZIFs 骨架的親疏水性質(zhì)［24］可能對(duì)酶@ZIFs 復(fù)合材料的活性均具有重要的影響，原位組裝過(guò)程需要充分考慮這些因素。

圖3 仿生礦化法合成酶@MOFs示意圖Fig.3 Schematic representation of the procedure for enzyme encapsulation in MOFs by the strategy of biomimetic mineralization

在原位包埋的策略中，ZIFs 的微孔結(jié)構(gòu)可緊密束縛酶的構(gòu)象，大幅度提升酶的穩(wěn)定性。例如，大量研究證實(shí)酶@ZIFs 材料在有機(jī)溶劑、水解酶、高溫等惡劣條件處理后仍能維持十分高的生物活性［18-26］。但由于微孔ZIFs 外骨骼對(duì)底物擴(kuò)散抑制作用，酶@ZIFs材料的活性往往不夠理想，但也有反常的現(xiàn)象被報(bào)道。如Guo 等［27］將Cyt c 包埋于生長(zhǎng)在TiO2納米通道的ZIF-8 內(nèi)，通過(guò)量子力學(xué)計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZIF-8 結(jié)構(gòu)的限制作用會(huì)導(dǎo)致Cyt c 的Fe-S鍵傾向于斷裂，提高Cyt c的過(guò)氧化物酶活性。

3.2 模板法

模板法是指酶預(yù)先與模板混合或組裝，隨后構(gòu)建MOFs 保護(hù)層，最后去除模板得到酶@MOFs結(jié)構(gòu)。模板在組裝過(guò)程中為脆弱的酶分子提供庇護(hù)作用，減少酶在組裝過(guò)程中的失活風(fēng)險(xiǎn)。Huo 等［28］預(yù)先將蛋白質(zhì)加載于UiO-66/Fe3O4穩(wěn)定的瓊脂糖水凝膠液滴，隨后在液滴表面生長(zhǎng)ZIF-8外殼，達(dá)到原位包封效果。得到的復(fù)合結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，高度微孔，水凝膠核心提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的基底誘導(dǎo)酶@MOFs的組裝。

目前適用于原位包埋固定的MOFs基質(zhì)主要是微孔的ZIFs 系列，但微孔的孔道會(huì)阻礙底物與內(nèi)部酶的接觸，抑制酶的生物活性。模板分子的引入-去除過(guò)程往往產(chǎn)生獨(dú)特的層次孔結(jié)構(gòu)，提高酶的可利用率。Cheng 等［29］以水凝膠為模板，采用模板乳化法制備鋅離子均勻分布的分層微孔和介孔鋅基MOFs，用于葡萄糖氧化酶和辣根過(guò)氧化物酶的原位封裝（圖4a），其穩(wěn)定性和酶活性顯著提高，kcat/km值比溶液中游離酶的值高7.7 倍，在Knoevenagel 反應(yīng)中也具有更高的催化活性。相比水凝膠等軟模板，硬模板法構(gòu)建層次結(jié)構(gòu)的酶@MOFs 材料也正在開(kāi)發(fā)。如Chen 等［30］將過(guò)氧化氫酶（CAT）預(yù)先封裝于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的ZIF-67 微晶中，在此結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步生長(zhǎng)ZIF-8 外殼，通過(guò)水刻蝕即可去除不穩(wěn)定的ZIF-67 核，形成中空的CAT@ZIF-8 結(jié)構(gòu)（圖4b）。這種中空結(jié)構(gòu)減少了酶-ZIF-8界面相互作用，提高包埋的酶的自由活動(dòng)度，因此中空CAT@ZIF-8的活性顯著提升。

圖4 模板法合成酶@MOFs示意圖Fig.4 Schematic illustration of the preparation of enzyme@MOFs via a templated method

4 總結(jié)與展望

MOFs 具有豐富的化學(xué)組分、極高的孔隙率和可調(diào)的孔道尺寸，基于表面連接、后滲透和原位包埋等固定模式能設(shè)計(jì)出不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)的酶@MOFs 復(fù)合材料。利用酶-MOFs 界面的相互作用及MOFs外骨骼提供的保護(hù)功能，酶在穩(wěn)定性、重復(fù)利用性甚至活性等方面均有不同程度的改善。目前，該固定技術(shù)在納米醫(yī)學(xué)［31］、生物催化［32］、藥物傳遞［33］等領(lǐng)域已表現(xiàn)出重要的應(yīng)用前景。相比于早期的表面連接和后滲透等固定策略，原位包埋方法設(shè)計(jì)的MOFs 載體對(duì)酶的結(jié)構(gòu)束縛更緊密，穩(wěn)定性更高。同時(shí)，致密的微孔網(wǎng)絡(luò)可更有效地防止酶浸出，提高酶的循環(huán)利用性。但該方法處于早期研究階段，仍存在較大的提升空間：1）大部分MOFs 的合成條件苛刻（強(qiáng)酸及有機(jī)溶劑使用、高溫、高壓等），酶極易在組裝過(guò)程中失活或變性。目前，已有其他生物相容的組裝策略正在發(fā)展中，如固相機(jī)械組裝策略有望降低酶在包埋過(guò)程中變性的風(fēng)險(xiǎn)［34］；2）原位包埋法最常用的ZIFs 系列材料對(duì)酸敏感，合成的酶@ZIFs 材料應(yīng)用范圍受限；3）酶和MOFs 的界面作用方式、酶在MOFs內(nèi)的空間規(guī)律以及如何調(diào)控等關(guān)鍵科學(xué)有待深入研究。